亚麻醉浓度的七氟烷对局灶性脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性的影响

徐达 许旭东 潘春英 郦惠芳 商建飞 张爱萍

(常州市中医医院麻醉科，江苏 常州 213000)

脑卒中的致残率、发病率、死亡率及复发率随着人口老龄化的进展而逐年升高，该病以患者出现局灶性神经功能障碍或缺失为主要临床表现，给患者的家庭带来沉重的经济和精神负担，不利于社会公共健康卫生事业的可持续发展。溶解血栓、恢复脑内血流是目前常用的干预措施，但是在溶栓再灌注干预过程，不可避免地出现脑缺血再灌注损伤(CIRI)〔1〕。既往的研究〔2〕多从改善患者的神经功能、减轻患者脑组织的炎性应激阻滞有害物质进入脑实质的等方面入手，并未取得突破性的进展，形成完善的治疗手段使患者从中受益免于疾病困扰。血脑屏障(BBB)是机体脑组织与脑部微血管的分界面，是维持颅内环境稳定的重要的结构基础。在脑缺血发生后BBB的通透性直接影响缺血对脑损伤的程度。Hassonizadeh等〔3〕研究显示在CIRI大鼠模型中，改善BBB的通透性可降低实验动物的脑梗死的面积。但并未详细地阐明其中的分子机制。七氟烷是一种临床上常用的吸入麻醉药，其诱导麻醉速度快，麻醉深入便于控制，恢复苏醒时间段，广泛用于心脑血管外科手术中的麻醉。Ou等〔4〕研究显示，亚麻醉浓度的挥发性的麻醉剂(如七氟烷等)能调控急性脑梗死小鼠的神经元细胞的静息膜电位，调控神经元细胞的生长与兴奋性。但是有关亚麻醉浓度的七氟烷对脑缺血再灌注损伤的作用机制报道较少。本研究通过构建局灶性CIRI大鼠模型，从BBB的角度入手，探讨亚麻醉浓度的七氟烷对脑组织的保护机制。

1 材料和方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器 SPF级雄性SD大鼠，9～12周龄，250～280 g，40只，由杭州拓实生物科技有限公司提供，动物的许可证号SYXK(浙)2020-0025，所有实验动物在常州市中医医院SPF及动物房中适应性饲养1 w后用于实验，饲养设定条件：温度22℃～25℃，湿度(45±15)%，自然光照，常规基础饲料，自由饮水。本研究经医院动物伦理委员会的批准，并在实验过程中尽最大努力减少动物的伤亡及痛苦。七氟烷购自鲁南贝特制药有限公司；尼莫地平(20 mg×50片，广东华南药业集团有限公司，国药准字：H44025019)。戊巴比妥钠、多聚甲醛、组织裂解液、化学增强显色剂(南京建成生物科技有限公司)，蛋白浓度检测试剂、Western印迹试剂盒、2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色试剂盒、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色试剂盒、苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司，兔抗GAPDH抗体购自美国Abcam公司。X71光学显微镜(日本Olympus公司)，Universal Hood Ⅱ凝胶成像处理系统(美国Bio-rad公司)，Philips 201透射电子显微镜(荷兰Eindhoven公司)，超薄切片机(德国Leica公司)。

1.2模型构建和分组 术前将大鼠禁食不禁水12 h后，参照Abdel-Rahman等〔5〕介绍的方法进行造模构建局灶性CIRI大鼠模型：腹腔注射戊巴比妥钠将大鼠麻醉后，待动物失去意识后固定在无菌实验台上，消毒备皮，颈部正中切开，显微镜下钝性分离颈总动脉、颈内外动脉，穿线，在距颈外动脉近动脉分叉约1 cm结扎颈外动脉，结扎线插入的深度在18 cm上下，当栓线呈现一定的波动感，以示颈内动脉没有完全阻塞，表示结扎成功，在动物缺血2 h后松开线栓进行再灌注，假手术组的动物只进行穿线，不进行结扎和再灌注。术后2 h，进行神经功能评价：无神经功能缺失症状，能够正常活动为0分；大鼠出现左侧前爪不能完全伸展的情况为1分；大鼠爬行时出现转圈走的现象为2分；大鼠行走时身体向一侧倾倒的现象为3分；大鼠出现意识丧失，不能自主行走的现象为4分，其中获得1～3分的大鼠表示造模成功。

将造模成功的30只大鼠按照随机数字表法依次分为模型组、实验组和对照组，每组10只，另取10只大鼠为假手术组，假手术组在造模术中只进行穿线，不结扎；其中实验组每日给以1.2%七氟烷吸入治疗3 h，对照组每日给以1.08 mg/ml的尼莫地平灌胃给药，模型组和假手术组以等剂量的生理盐水进行灌胃处理，所有大鼠以单笼、基础饲料喂养。

1.3各组神经功能评价 连续处理1 w后，再次对动物进行神经功能评价，留取2 ml尾静脉血，离心后，留取上清待测；然后将大鼠断头处死，取出各组大鼠的脑组织，注意保持动物脑组织的完整性。

1.4各组脑梗死面积比较 取脑组织标本，制成厚度约为2 μm的冠状切片，TTC工作液避光染色，正常脑组织中因含与TTC发生特异性反应的酶而呈红色，缺血区域因酶活下降不能与TTC发生特异性的结合而呈现苍白色〔6〕，图像分析测量系统统计分析大鼠脑组织的脑梗死面积比例大小。

1.5各组脑组织病理损伤变化 取脑组织标本，中性甲醛溶液固定，脱水，包埋，制成厚度在3～5 μm的冠状石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察并采集图片。

1.6各组脑组织的超微结构损伤病理 取脑组织标本，在戊二醛溶液(浓度约为3%)中固定1 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，1%四氧化锇固定90 min，无水乙醇梯度脱水，中性树脂包埋，切片，依次经洗涤、脱水、切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，Philips 201透射电子显微镜镜下观察，拍照。

1.7各组脑组织细胞凋亡 取脑组织，按TUNEL染色试剂盒要求进行预处理，抗原修复，封闭，标记，避光染色，脱水，中性树胶封片，镜检，视野中被染成黄褐色的细胞为凋亡细胞〔7〕，细胞的凋亡率等于TUNEL阳性细胞数与总细胞的比值。

1.8各组大鼠BBB的通透性比较 处死大鼠24 h前，股静脉注射4%伊文思蓝(EB)染料5 ml/kg，按EB染色试剂盒要求进行生理盐水及固定液灌注，处死大鼠后，取各组大鼠的脑组织，常规固定48 h，梯度浓度蔗糖溶液脱水，制成约8 μm的切片，显微镜下观察。

1.9各组血清指标检测 按照酶联免疫吸附试验试剂盒要求，检测各组大鼠血清中白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性相关因子含量的变化。

1.10各组脑组织中闭合蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白(Claudin)-5、闭锁连接蛋白(ZO)-1等细胞连接蛋白的表达 取各组脑组织，在4℃裂解液中放置30 min，离心，并将上清液稀释，常规方法提取样本中的总蛋白，以50 μg样品进行上样，电泳后，转模，封闭，加入一抗(1∶1 000)，二抗(1∶5 000)稀释后，室温孵育后，显色30 min，以GAPDH为参照，分析目标蛋白的灰度值。

1.11统计学分析 采用Graphpad8.0进行作图，采用SPSS16.0软件进行单因素分析、t检验。

2 结 果

2.1各组一般状态及神经功能评分比较 假手术组反应敏捷，活泼好动，皮毛光亮，饮食与进水未见明显异常，体重增加较为明显；模型组皮毛杂乱，暗淡无光，活动量明显减少，反应迟钝，大鼠经常以鼠尾为中心转圈，四肢协调性不高，弓背明显，食欲不良，体重增加不明显；与模型组相比，实验组及对照组症状明显改善，大鼠四肢协调趋于正常，饮水与进食量明显增加，体重较模型组增加较为明显。神经功能评价结果显示，与假手术组相比，模型组、实验组、对照组神经功能评分明显升高(均P<0.05)，与模型组相比，实验组、对照组神经功能评分明显下降(均P<0.05)，对照组和实验组神经功能差异不明显(P>0.05)，见表1。

2.2各组脑梗死面积比较 TTC染色结果显示，与假手术组相比，模型组、实验组、对照组脑组织的梗死面积明显升高(均P<0.05)；与模型组相比，实验组、对照组脑组织的梗死面积明显下降(均P<0.05)，对照组和实验组脑组织的梗死面积差异不明显(P>0.05)，见表1、图1。

表1 各组神经功能评分、脑梗死面积、脑组织细胞凋亡率比较

图1 各组脑组织(TTC染色，×10)

2.3各组脑组织病理损伤变化 HE染色结果显示，假手术组脑组织的神经元细胞结构完整，排列紧密，大小均匀，胞质中内容物丰富，核膜、核仁及尼式体均清晰可辨，神经纤维未见明显异常，毛细血管无水肿现象出现；模型组脑组织中可见明显的坏死灶点，坏死灶点周围较多的坏死的神经元细胞，炎性细胞浸润，神经元细胞排列松散，或大或小，胞核固缩严重，胞体损伤明显，空泡样变性明显，核质界限不明，神经纤维或断裂或缺失，脑部血管结构不完整。与模型组相比，实验组及对照组脑组织的神经损伤明显改善，细胞内空泡样变性趋于缓解，核质界限趋于清晰，脑梗死周围的神经元细胞损伤趋于恢复，见图2。

2.4各组脑组织超微结构损伤病理变化 电镜下观察结果显示，假手术组神经元细胞结构清晰完整，核仁大且圆，染色质未见明显异常，核糖体、内质网、线粒体等细胞器性状稳定；模型组脑组织神经元细胞超微结构损伤明显，核膜凹陷或溶解明显，核仁消失，胞质中的细胞器数量明显减少，线粒体损伤严重，双层膜结构不清晰，肿胀明显，内质网断裂，核糖体脱颗粒现象明显；与模型组相比，实验组及对照组脑组织神经元超微结构损伤明显缓解，线粒体的双层膜结构逐渐清晰，核膜溶解现象明显减轻，染色质的固缩聚集状态明显减少，见图3。

图2 各组脑组织(HE染色，×400)

图3 各组脑组织超微结构(×10 000)

2.5各组脑组织细胞凋亡 TUNEL染色结果显示，与假手术组相比，模型组、实验组、对照组脑组织细胞凋亡率明显升高(均P<0.05)；与模型组相比，实验组、对照组脑组织的细胞凋亡率明显下降(均P<0.05)，对照组和实验组脑组织的细胞凋亡率差异不明显(P>0.05)，见表1、图4。

图4 各组脑组织细胞凋亡(TUNEL染色，×400)

2.6各组BBB通透性比较 EB染色结果显示，与假手术组相比，模型组、实验组、对照组脑组织EB的渗出量明显升高(均P<0.05)；与模型组相比，实验组、对照组脑组织EB的渗出量明显下降(均P<0.05)，对照组和实验组脑组织EB的渗出量差异不明显(P>0.05)，见图5，表2。

2.7各组血清指标比较 酶联免疫吸附实验结果显示，与假手术组相比，模型组、实验组、对照组血清中IL-1β和TNF-α含量明显升高(均P<0.05)；与模型组相比，实验组、对照组血清中IL-1β和TNF-α含量明显下降(均P<0.05)，对照组和实验组血清中IL-1β和TNF-α含量差异不明显(P>0.05)，见表2。

2.8各组脑组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白表达 Western印迹结果显示，与假手术组相比，模型组、实验组、对照组脑组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白相对表达明显降低(均P<0.05)；与模型组相比，实验组、对照组脑组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白相对表达明显升高(均P<0.05)，实验组和对照组相比差异无统计意义(P>0.05)，见图6，表3。

图5 各组BBB通透性(EB染色，×400)

表2 各组脑组织EB的渗出量、血清中IL-1β、TNFα含量比较

图6 各组脑组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白的表达

表3 各组脑组织中Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白相对表达

3 讨 论

缺血性脑卒中又被称为脑梗死，是由多种原因引起的脑组织局部区域出现血液供应障碍，脑神经元细胞在缺血、缺氧情况下异常凋亡，脑组织出现不可逆的损伤，进而诱发神经功能障碍及运动功能障碍，肢体自主能力受限，影响患者的正常生活。CIRI是在脑组织恢复血流致使脑组织损伤进一步加重的现象。其病理机制尚处于实验研究阶段，临床上尚缺乏根治性的治疗措施。大量的研究显示〔8〕，CIRI的病理机制涉及能量代谢障碍、炎症性与氧化应激、酸中毒等多个生理病理过程。但有研究显示〔9〕，BBB的通透性增加与CIRI的关系密切。当CIRI的发生导致患者的BBB的开放，血液及血浆中的组分由此进入脑实质诱发患者出现血管性的脑水肿，致使脑组织神经元的损伤进一步加剧。因此研究BBB通透性的改变成为干预CIRI的一个新思路，改善脑梗患者的BBB，有助于降低患者的神经障碍程度，提高患者的日常生存质量。

七氟烷是使用较为广泛的麻醉药。但最新的研究显示七氟烷不仅具有良好的镇静催眠的效用，并且在外科手术中具有对肝、肺、心、脑等器官保护的作用。Tuncay等〔10〕研究显示，在下肢缺血再灌注损伤大鼠模型中，七氟烷能明显抑制肺组织中的氧化应激的酶活性，发挥对非保护的作用。Shiraishi 等〔11〕研究显示，在肝移植和肝切除等因素导致的大鼠肝缺血再灌注损伤模型中，七氟烷的应用能明显抑制肝细胞的异常凋亡。Xie 等〔12〕研究报道，在糖尿病心肌缺血再灌注小鼠模型中，七氟烷(1.2%)能明显抑制炎性相关信号的传导，抑制心肌炎性反应的级联放大。Yue等〔13〕研究显示，吸入性麻醉剂七氟烷(1.2%)能激活神经系统的自我防御机制，增强神经元对CIRI的耐受作用。本研究中七氟烷的浓度为1.2%，属于亚麻醉范围浓度，本研究结果证实了治疗手段对疾病的干预作用。

BBB是将脑组织和血液进行分隔的一个复杂的细胞系统，其主要功能是调控某些物质在血液循环和中枢神经区域的交换，进而保护中枢神经元细胞内环境的稳定，其通透性的改变与中枢神经元细胞的损伤、变性、炎性应激及凋亡、坏死等生理过程关系密切〔14〕。Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白是构成BBB的结构基础。Liu等〔15〕研究显示，CIRI发生后，BBB的结构被破坏，其正常功能随之发生严重的障碍。Khamchai等〔16〕研究显示，在CIRI后，改善大鼠脑组织BBB的通透性，有助于炎性因子进入中枢神经区域的量，保护脑组织免于过于激烈的炎性损伤。本研究结果证实药物对BBB的修复作用。

综上，亚麻醉浓度的七氟烷能明显改善局灶性CIRI大鼠BBB的通透性，降低神经元的凋亡率，改善其神经功能。但是在临床应用中，该干预手段能否发挥等效的作用，仍需要结合患者的个体特殊性及疾病的进展进行综合考量。