宣白承气汤对急性呼吸窘迫综合征大鼠BTLA/HVEM通路及肺功能的影响

张轶强 李咏红 向丹 张玉沛

(荆门市中医医院肺病科，湖北 荆门 448002)

2019年新型冠状病毒疾病已在中国和世界各地发生，感染的重症肺炎患者会迅速发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，并因多器官衰竭而死亡。尽管支持治疗方法有所进步，ARDS仍与高死亡率和高发病率有关〔1,2〕。ARDS是一种复杂的临床综合征，各种创伤、药物摄入、细菌性或病毒性肺炎、败血症等引起的急性肺损伤(ALI)均可导致ARDS的发生〔3〕，其特征在于急性炎症、呼吸急促、低氧血症、弥漫性肺泡浸润及肺血管和上皮通透性增加〔4〕。研究发现ARDS的发病与高炎症免疫反应有关〔5〕，涉及先天性和适应性免疫系统的多种免疫细胞，如肺泡巨噬细胞和T细胞，这些免疫细胞介导肺损伤的发生发展〔6,7〕。近年来中医药在治疗ALI/ARDS中取得显著疗效，宣白承气汤就是其中一种，而且其在临床上的使用频次最多〔8〕。研究发现宣白承气汤在新型冠状病毒肺炎的治疗上效果显著〔9〕，可降低ARDS的病死率〔10〕。但具体作用机制尚不明确。宣白承气汤对ALI/ARDS的治疗是否与机体免疫系统有关尚未可知。本研究旨在探讨其对ARDS肺损伤的影响及可能的作用机制，为ARDS治疗和宣白承气汤临床更广泛应用提供参考。

1 材料与方法

1.1动物 从北京维通利华动物中心购入SPF级Wistar大鼠72只，雄性，体质量(200±20)g，许可证号为SCXK(京)2016-0011，大鼠饲养在可控的环境中保持12 h明/暗循环，自由获取食物和水。

1.2药品及试剂 宣白承气汤〔生石膏15 g，大黄(后下)10 g，苦杏仁15 g，瓜蒌皮15 g〕，以上药材均购自河南张仲景大药房；上述药材加入8倍量的水分充分浸泡30 min，煎煮40 min，过滤药液，药渣再加入6倍量的水继续煎煮40 min后过滤药液，合并药液并浓缩至1 ml相当于生药2.5 g。

脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-10酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号：RA20035、RA20020-S、RA20132、RA20090；异硫氰酸荧光素(FITC)标记小鼠抗大鼠CD3单抗(554832)、别藻蓝蛋白(APC)小鼠抗大鼠CD4(550057)、藻红蛋白(PE)标记小鼠抗大鼠CD8a单抗(554857)均购自美国BD Biosciences公司；FITC标记抗大鼠BTLA单抗、FITC标记抗大鼠HVEM单抗购自上海微蒙生物技术有限公司；血气分析仪(型号：ABL90 FLEX，丹麦Radiometer)；多功能酶标仪、流式细胞仪(型号：iMark680、BD FACSCanto Ⅱ，美国Bio-Rad公司)；倒置荧光显微镜(型号：IX73，日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1模型制备、分组及给药 大鼠适应性饲养7 d后开始实验，随机选取12只大鼠为空白组，大鼠用3%戊巴比妥钠以50 mg/kg的剂量腹腔内注射麻醉，除空白组外，其余大鼠参考文献〔11〕通过气管内滴入100 μl的LPS溶液(生理盐水稀释至5 mg/kg)造模；空白组气管内滴入等量生理盐水。24 h后，若大鼠出现精神萎靡，倦怠，活动减少，食欲减退，便秘等症状，呼吸频数增加，出现呼吸窘迫，氧合指数<300 mmHg〔12〕，说明ARDS构建成功。将造模成功的60只大鼠随机分为模型组、宣白承气汤高、中、低剂量组(22.8、11.4、5.7 g/kg)，每组12只。开始给药，宣白承气汤各剂量组灌胃相应剂量的药物，空白组和模型组灌胃等量生理盐水，1次/d，给药7 d。计量换算：给药剂量按成人平均体质量60 kg体表面积换算，对应给药剂量为成人的6.25倍，宣白承气汤成人每日给药剂量相当于生药55 g，则大鼠每日给药剂量为5.7 g/kg，因此设置低、中、高剂量药物剂量为5.7、11.4、22.8 g/kg。

1.3.2形态学观察 给药期间，观察各组大鼠的精神状况、毛色、饮食、活动等一般状态，并记录。

1.3.3动脉血气分析 大鼠称重后，麻醉并记录体重，从颈动脉抽取大鼠动脉血，立即使用血气分析仪测定动脉血中的氧分压(PaO2)和二氧化碳分压(PaCO2)；计算氧合指数(P/F)和肺泡-动脉血氧分压差P(A-a)O2。本实验大鼠吸入空气(氧气浓度21%)，故吸入氧气浓度(FiO2)为0.21。

肺泡-动脉血氧分压差〔P(A-a)O2，mmHg〕=(PIO2-PaCO2×1/R)-PaO2〔PAO2为肺泡气氧分压；PIO2为吸入气氧分压=FiO2×(大气压-47)；R为呼吸商，等于0.8〕。

1.3.4流式细胞术检测大鼠外周血T淋巴细胞亚群 大鼠抽取动脉血后，用毛细管从眼眶取外周血样品置于15 ml离心管(含1 ml抗凝剂)中，加入1 ml磷酸盐缓冲液(PBS)进行离心，分离并弃去上清液。加入3 ml溶血素后，冰上放置4～5 min，离心，弃上清液，然后加入PBS，获得外周血细胞悬液。将100 μl的外周血细胞悬液放入2 ml离心管中，然后与FITC标记抗大鼠CD3单抗、APC标记抗大鼠CD4单抗和PE标记抗大鼠CD8a单抗混合。在离心管中加入PBS，4℃的冰箱中避光孵育30 min。然后，添加1 ml PBS，300 r/min离心5 min。除去上清液后，加入0.5 ml PBS重悬并用流式细胞仪分析。

1.3.5肺湿/干比(W/D)评估 处死大鼠后，取出肺组织，将大鼠的左侧肺组织称重，获得肺湿重；然后将其在60℃下烘烤72 h后称量，获得每个样品的干重。W/D=湿重/干重。

1.3.6肺组织病理学改变 每只大鼠固定于右肺相同位置切取部分组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。进行苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肺部病理学变化。

1.3.7肺组织炎性因子检测 剩余的右肺组织，按照1∶9的比例加入预冷的生理盐水，研磨后离心，制备10%的肺组织匀浆，ELISA检测匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-10水平。

1.3.8流式细胞术检测BTLA、HVEM在ARDS大鼠外周血CD4+和CD8+T细胞表面的表达 取1.3.4获得的外周血细胞悬液100 μl加入流式管中；加入FITC标记抗大鼠BTLA单抗或HVEM单抗，4℃的冰箱中避光孵育30 min，PBS洗涤细胞，离心去上清，加入羊抗鼠PE二抗，4℃的冰箱中避光孵育30 min，再次洗涤细胞，去上清，然后分别加入APC标记抗大鼠CD4单抗和PE标记抗大鼠CD8a单抗，4℃的冰箱中避光孵育30 min，PBS洗涤细胞2次后用0.5 ml悬浮细胞，用流式细胞仪进行双色标记的方案检测分析。

1.4统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1宣白承气汤对ARDS大鼠一般状态的影响 空白组精神状态良好，毛色光滑有光泽，较活跃；模型组精神萎靡，倦怠，毛色暗淡无光泽，活动减少，食欲减退，出现便秘，呼吸困难等现象；宣白承气汤高、中、低剂量组状态较模型组发生不同程度的改善，活动、饮食量增加，无明显呼吸困难现象。

2.2宣白承气汤对ARDS大鼠P/F、P(A-a)O2的影响 与空白组相比，模型组PaO2、P/F显著降低，P(A-a)O2显著升高(P<0.05)；与模型组相比，宣白承气汤高、中、低剂量组大鼠PaO2、P/F明显升高，P(A-a)O2明显降低(P<0.05)，且呈一定的剂量依赖性(P<0.05)；见表1。

2.3宣白承气汤对W/D的影响 与空白组相比，模型组W/D显著升高(P<0.05)；与模型组相比，宣白承气汤高、中、低剂量组W/D明显降低(P<0.05)，且呈一定的剂量依赖性(P<0.05)；见表1。

表1 宣白承气汤对ARDS大鼠P/F、P(A-a)O2、W/D的影响

2.4宣白承气汤对ARDS大鼠肺组织病理变化的影响 空白组肺组织肺泡结构正常，未见明显异常；模型组肺体积增大，肺组织结构严重受损，肺泡、肺间质水肿，肺泡壁增厚，肺泡间隔增宽，大量炎症细胞浸润，肺泡腔内有出血，部分有透明膜形成；宣白承气汤高、中剂量组肺组织损伤程度明显减轻，少量炎性细胞浸润，未见明显透明膜形成；宣白承气汤低剂量组肺组织上述损伤较模型组有所改善，但改善程度低于宣白承气汤高、中剂量组。见图1。

图1 宣白承气汤对ARDS大鼠肺组织病理变化的影响(HE染色，×200)

2.5宣白承气汤对ARDS大鼠肺组织炎性因子的影响 与空白组相比，模型组肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-10水平显著升高，IL-2水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，宣白承气汤高、中、低剂量组肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β水平明显降低，IL-2、IL-10水平明显升高(P<0.05)，呈一定的剂量依赖性(P<0.05)；见表2。

表2 宣白承气汤对ARDS大鼠肺组织炎性因子的影响

2.6宣白承气汤对ARDS大鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 与空白组相比，模型组外周血中CD3+、CD4+T淋巴细胞亚群比例及CD4+/CD8+比值均显著降低，CD8+T值显著升高(P<0.05)；与模型组相比，宣白承气汤高、中、低剂量组外周血中CD3+、CD4+T淋巴细胞亚群比例及CD4+/CD8+比值明显升高，CD8+T值明显降低(P<0.05)，呈一定的剂量依赖性(P<0.05)；见表3。

2.7BTLA、HVEM在ARDS大鼠外周血CD4+和CD8+T细胞表面的表达 与空白组相比，模型组外周血CD4+和CD8+T细胞表面BTLA、HVEM表达显著升高(P<0.05)；与模型组相比，宣白承气汤高、中剂量组外周血CD4+和CD8+T细胞表面BTLA、HVEM表达明显降低(P<0.05)，呈一定的剂量依赖性(P<0.05)。见表4。

表3 宣白承气汤对ARDS大鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响

表4 BTLA、HVEM在ARDS大鼠外周血CD4+和CD8+T细胞表面的表达

3 讨 论

有证据表明不同类型的免疫细胞参与了ARDS的发病机制，包括肺泡巨噬细胞(AMs)的极化，嗜中性粒细胞性中毒，辅助性T细胞亚群的促炎反应及调节性T细胞亚群的抗炎和再生作用〔13〕。内毒素是ARDS最重要的危险因素，LPS诱导的大鼠模型模拟了由革兰阴性杆菌感染或败血性休克引起的一种ARDS，其病因和生理病理与人类患者非常相似，因此LPS诱导的模型具有重要的现实意义〔14〕。故本研究也采用了LPS进行造模，结果显示，LPS诱导的ARDS大鼠出现明显的便秘，呼吸困难等现象，P/F显著降低，且肺体积增大，肺组织结构严重受损，肺泡、肺间质水肿，肺泡壁增厚，大量炎症细胞浸润；说明模型制备成功。

中医认为肺与大肠相表里，宣白承气汤出自《温病条辨》，由大黄、(生)石膏、苦杏仁、瓜蒌皮组成，具有清肺定喘，泻热通便的功效。其中(生)石膏为君药，可泻热通便、攻积导滞；杏仁宣肺止咳，合用瓜蒌皮同走肺肠，可清肺化痰；且中医药治疗ALI/ARDS的核心方药组成中就有大黄、苦杏仁、石膏〔8〕。宣白承气汤临床上被广泛应用于ALI/ARDS、重症肺炎(痰热壅肺证)的治疗，可改善P/F，降低内毒素和炎症因子水平〔15,16〕；还可增加重症肺炎患者血清CD4+、CD4+/CD8+水平，降低CD8+水平，增强免疫〔17〕；动物实验也表明，宣白承气汤可影响慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠外周血T淋巴细胞的亚群分布，调节辅助性T淋巴细胞比例〔18〕。有研究发现ALI患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值偏低于正常范围，CD8+高于正常范围，出现了免疫抑制，升高患者外周血CD4+/CD8+值，纠正细胞免疫抑制状态，能降低肺部及全身的炎症反应，明显改善肺组织损伤〔19,20〕。IL-2是T细胞增殖所必需的细胞因子，IL-10是重要的炎症抑制因子，LPS诱导IL-10的分泌增加，可能是由于急性炎症引起的反馈作用所致〔21〕；且外周血中CD3+、CD4+T淋巴细胞比例及CD4+/CD8+比值显著降低，CD8+T值显著升高，说明ARDS大鼠T细胞免疫应答的能力受到抑制；宣白承气汤可改善ARDS大鼠上述指标的变化；提示宣白承气汤可增强ARDS大鼠T淋巴细胞免疫功能。

BTLA也称为CD272，是一种免疫调节受体，主要在B、T和所有成熟淋巴细胞上表达，BTLA抑制T细胞反应和细胞因子产生〔22〕。HVEM为BTLA的特异性配体，BTLA对T细胞的抑制作用强于HVEM对T细胞的积极刺激作用，并防止了T细胞的过度活化〔23〕。BTLA/HVEM信号通路在各种炎症，自身免疫和感染免疫反应中起着双向调节作用〔24〕。Zhang等〔25〕发现在肾移植患者中，急性排斥反应接受者的外周CD3+T淋巴细胞中的BTLA表达明显低于稳定肾移植的对照患者，BTLA过表达可抑制IL-2和IFN-γ的产生并增加IL-4和IL-10的产生，抑制急性排斥反应并调节肾脏移植的同种异体反应。通过阻断BTLA与HVEM的结合，可激活衰老的CD8+T细胞对流感病毒的应答〔26〕。本研究结果提示宣白承气汤可下调BTLA/HVEM的表达，增强T淋巴细胞免疫应答能力。

综上所述，宣白承气汤可增强ARDS大鼠T淋巴细胞免疫功能，改善肺损伤；其机制可能与BTLA/HVEM的表达下调有关。但是BTLA/HVEM在CD4+和CD8+T细胞表达上调的调控因素及其对T细胞的抑制效应和作用机制有待进一步分析。