富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼生长、生理生化、硒代谢、抗氧化及先天免疫的影响

张 辰 贾小巍 钱鹏丞 陈艳婷 吴成龙 * 叶金云 *

(1. 湖州师范学院生命科学学院, 水生动物繁育与营养国家地方联合工程实验室, 湖州 313000; 2. 湖州师范学院生命科学学院,浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室, 湖州师范学院生命科学学院, 湖州 313000)

硒(Se)是鱼类生长所必需的微量营养元素之一, 对维持机体生长和代谢方面起着重要的作用。在自然界中, 硒主要以有机硒(硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸等)和无机硒(亚硒酸钠)两种形式存在[1]。研究发现, 硒进入体内, 经小肠消化后以简单扩散和主动运输的方式被机体吸收[2], 在体内合成含硒蛋白, 进而参与提高机体抗氧化能力和免疫能力[3]。目前在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)和尖吻鲈(Lates calcarifer)等水产动物中已有大量关于硒的研究报道[4—6], 主要集中在硒源选择、生长性能、代谢能力及机体免疫力等方面, 通过亚硒酸钠和酵母硒、硒代蛋氨酸等比较发现, 动物机体对有机硒源有更好的利用效率[7,8], 但是目前国内外对于植物有机硒源的开发和利用等相关研究较少。

壶瓶碎米荠(Cardamine hupingshanensis)是十字花科碎米荠属[9], 主要分布于湖南和湖北, 具有超富硒能力[10], 是一种新型的有机硒源。壶瓶碎米荠各组织均含硒, 其中叶片含硒量高达1427 mg/kg[11],且作为一种来源于植物的硒, 其来源更为广泛, 更为易得。在壶瓶碎米荠机体中, 硒的活性物质主要为硒代半胱氨酸[11], 直接或间接参与硒蛋白的合成,如谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、硫氧还蛋白还原酶(TXNRD)和脱碘酶(DIO)等, 进而在机体内发挥其抗氧化和抗应激等生理学功能[4,12]。饮食中硒的缺乏会导致硒蛋白的表达量减少, 脂质过氧化反应增加, 进而对机体造成损伤[13], 而过量硒也会对机体产生毒副作用, 导致机体肝损伤和生理功能下降, 免疫能力降低甚至死亡[14]。因此, 研究饲料中添加富硒壶瓶碎米荠对水产动物生长及其生理指标的影响并探究其相关机制具有较大的理论和应用价值。

青鱼(Mylopharyngodon piceus)作为我国主要淡水经济养殖品种之一, 2020年养殖年产量已达到69×107kg[15]。目前对于青鱼的营养需求已在糖、蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等方面有较多的研究[16—18], 但是关于富硒壶瓶碎米荠对于青鱼生长、代谢和免疫调控影响方面仍未见报道。近年来, 随着青鱼养殖行业的快速发展, 其对优质配合饲料的开发尤为迫切。本实验旨在探究添加富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼生长、血清生理生化、肝脏硒代谢、抗氧化能力及先天免疫指标的影响, 为其在青鱼幼鱼配合饲料中的科学利用奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本实验以酪蛋白、明胶为蛋白质源, 菜籽油为脂肪源, 在基础饲料(无硒添加)组分别添加0.5、1.0和2.0 g/kg富硒壶瓶碎米荠(硒的实际含量为0.04、0.43、0.75和1.57 mg/kg), 制备成4种等氮等能的饲料, 分别以饲料1(Se 1; 对照)、饲料2(Se 2)、饲料3(Se 3)、饲料4(Se 4)表示, 实验饲料配方及营养组成如表 1所示。所需原料粉碎过60目筛,按表 1进行配比, 用双螺杆挤条机加工并制成直径为2.00 mm的颗粒, 置于37℃烘箱风干, 后存于-20℃冰箱中保存。

表1 试验饲料组成及营养水平Tab. 1 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.2 实验鱼饲养与管理

本实验用青鱼幼鱼购自浙江菱湖兴旺水产苗种场, 正式实验前在循环水养殖系统中暂养2周, 期间投喂未添加硒的基础饲料。选取体质健康且初始体重为(5.51±0.02) g青鱼幼鱼共360尾, 随机分到12个水循环养殖缸, 共4个实验组, 每组3个重复, 每个重复30尾鱼, 养殖周期60d。养殖期间饲料日投喂量为鱼体总重的3%, 分别在8:00、12:00和17:00进行投喂。养殖缸隔天换水、吸污1次用于保持水质, 养殖期间水温为26.5—28.5℃, 自然光照,溶氧＞ 5.8 mg/L。

1.3 实验样品采集

待养殖实验结束后, 统计每缸尾数和终末重量。用MS222麻醉后, 每缸随机选取5尾进行体成分分析, 同时选取15尾测量终末体重和体长, 用于分析生长指标。通过尾部静脉采血的方式采取血液, 2500 r/min离心15min, 取血清存于-80℃超低温冰箱待测生理生化相关指标。于冰上快速剖取青鱼肝脏等内脏组织, 称重后存于冻存管中置液氮速冻, 存于-80℃超低温冰箱用于测定其他指标。

1.4 实验饲料和鱼体成分分析

实验饲料水分采用105℃恒温烘干法测定, 鱼体水分采用冷冻干燥法测定(科瑞斯特 Alpha2-4 LSC Basic); 粗灰分均采用马弗炉550℃灼烧法测定;粗脂肪均采用索氏抽提法测定; 粗蛋白均采用杜马斯全自动快速定氮仪(艾力蒙塔 Rapid N exceed; 德国)测定。

1.5 生长性能指标计算公式

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=(鱼体终末重量-鱼体初始重量)/鱼体初始重量×100

特定生长率(Specific growth rate, SGR, %/d)=(ln鱼体终末重量-ln鱼体初始重量)/养殖天数×100

饲料系数(Feed conversion ratio, FCR)= 鱼摄入饲料量/(鱼体终末重量-鱼体初始重量)

肝体比(Hepatosomatic index, HSI)=鱼肝脏重量/鱼体终末重量×100

肥满度(Condition factor, CF, g/cm3)= 鱼体终末重量/鱼体终末体长3×100

1.6 血清生化及肝脏抗氧化酶活性指标的检测

血清葡萄糖(GLU)浓度采用上海荣盛生物药业有限公司所生产的试剂盒测定, 甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)浓度采用浙江东瓯诊断产品所生产的试剂盒测定, 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定, 白蛋白(ALB)、低密度脂蛋白(LDL-C)浓度和谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性均采用宁波普瑞柏生物技术股份有限公司所生产的试剂盒进行检测。

肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT) 、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和谷胱甘肽还原酶(GR)等相关酶活性及肝脏丙二醛(MDA)水平、总抗氧化能力(T-AOC)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量均是采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。

1.7 组织总RNA提取及cDNA反转

利用Monzol试剂(Monad, 上海)提取青鱼肝脏组织总RNA, 超微量分光光度计(Thermo, Nano-Drop2000)测定其浓度和纯度。利用MonScriptTM反转录试剂盒(Monad, 上海), 按照其操作说明进行反转录合成cDNA, 后存于-20℃冰箱中备用待测。

1.8 引物设计及荧光定量PCR

本实验所需相关基因引物如表 2所示, 均采用Primer Premier 5软件设计, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 其中β-actin为内参基因。反应体系在荧光定量PCR仪(Biorad cfx96, bio-rad,美国)进行, 具体实验方法及体系参考Wu等[17], 实验结果的分析统计采用相对荧光定量法(2-ΔΔCt法)分析[19]。

表2 实时定量PCR引物Tab. 2 Primers for real-time quantitative PCR

1.9 数据统计及分析

实验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示, 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析(One-WayANOVA), 差异显著时, 采用Duncan氏法进行多重比较,P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼生长性能和体组成的影响

如表 3所示, 青鱼幼鱼的增重率和特定生长率随着饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量的增加均呈现先升高后下降的趋势, 当饲料中添加0.5和1.0 g/kg富硒壶瓶碎米荠时, 青鱼幼鱼的增重率和特定生长率均显著高于对照组和过量组(2.0 g/kg), 同时饲料系数显著低于对照组和过量组(2.0 g/kg;P＜0.05)。饲料中富硒壶瓶碎米荠的添加量对青鱼幼鱼的肝体比、肥满度和成活率无显著性影响(P＞0.05)。青鱼鱼体的水分和粗灰分不受饲料中富硒壶瓶碎米荠添加的影响, 各组间无显著性差异(P＞0.05)。随着饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量的增加, 青鱼鱼体的粗脂肪含量呈先升高后降低的趋势, 并在饲料其添加量为0.5 g/kg时达到最高值, 显著高于对照组(P＜0.05)。当饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量为1.0 g/kg时, 青鱼鱼体粗蛋白含量较其他组显著升高, 达到最高值(P＜0.05)。

2.2 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼血清生理生化指标的影响

如表 4所示, 饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量对GLU含量和AST活性影响均呈现先下降后上升的趋势。与对照组相比, 饲料中添加0.5—1.0 g/kg的富硒壶瓶碎米荠可以显著下调血清中GLU的含量,提高ALB含量, 而饲料中添加量为1.0—2.0 g/kg时,血清中的AST活性显著下降(P＜0.05)。血清中TG、TCH和HDL-C含量呈先上升后下降的趋势,当饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5 g/kg时, 血清中TG和HDL-C含量较对照组显著上升, 而较对照组和过量组(2.0 g/kg), 饲料中添加1.0 g/kg富硒壶瓶碎米荠可显著升高血清中TCH的含量(P＜0.05)。但是血清中ALT和ALP活性各组间无显著性差异(P＞0.05)。

表4 饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量对青鱼幼鱼血清生化指标的影响(平均值±标准差, n=3)Tab. 4 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on serum biochemical indices of juvenile black carp (mean±SD, n=3)

2.3 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼肝脏硒代谢指标的影响

如图 1所示,SCLY和SPS1基因表达量均呈现先上升后下降的趋势, 富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5—1.0 g/kg时无显著性差异(P＞0.05), 但较对照组显著升高(P＜0.05)。SEP15、SEPT2、SEPH和SEPP基因表达量均呈现先上升后下降的趋势。SEP15基因表达量随着饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量的增加呈先上升后下降趋势, 并在1.0 g/kg达到最高(P＜0.05)。SEPT2基因表达量在富硒壶瓶碎米荠添加量为1.0 g/kg时较对照组显著升高(P＜0.05),达到最高值。SEPH基因表达量在富硒壶瓶碎米荠添加量为1.0 g/kg达到最高值, 与2.0 g/kg间无显著性差异(P＞0.05), 较对照组显著升高(P＜0.05)。与对照组相比, 富硒壶瓶碎米荠添加组能够显著提高SEPP基因表达量(P＜0.05), 并在其添加量为1.0 g/kg时达到最高, 而1.0 g/kg与2.0 g/kg组间无显著性差异(P＞0.05)。

图1 饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量对青鱼幼鱼肝脏硒代谢相关基因表达量的影响Fig. 1 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on gene expression levels related to selenium metabolism in the liver of juvenile black carp

2.4 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼肝脏抗氧化指标的影响

如表 5所示, 饲料中富硒壶瓶碎米荠缺乏和过量对青鱼幼鱼肝脏中SOD、CAT活性和T-AOC、GSH含量均有显著的抑制作用(P＜0.05), 当饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5 g/kg时SOD、CAT活性和T-AOC、GSH含量达到最大值。肝脏中GR活性随着饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量的增加呈先上升后下降的趋势, 在其添加量为1.0 g/kg时达到最高。肝脏GSH-PX活性随着饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量的增加持续上升, 且各组间差异显著(P＜0.05)。肝脏中MDA的水平随着饲料中富硒壶瓶碎米荠的添加量呈先下降后上升的趋势, 在其添加量为0.5 g/kg时达到最低值, 较其他组显著降低(P＜0.05)。而饲料中富硒壶瓶碎米荠的添加对鱼体肝脏GST活性无显著性影响(P＞0.05)。

表5 饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量对青鱼幼鱼肝脏抗氧化能力的影响(平均值±标准差, n=3)Tab. 5 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on antioxidant capacities in the liver of juvenile black carp (mean±SD,n=3)

如图 2所示, 与对照组相比, 饲料中添加富硒壶瓶碎米荠能够显著上调青鱼肝脏中Nrf2基因表达量(P＜0.05), 在其添加量为2.0 g/kg时达到最高, 但0.5、1.0和2.0 g/kg三组间无显著性差异(P＞0.05)。而keap1a和keap1b基因表达量随饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量增加均呈现先下降后升高的趋势, 并都在1.0 g/kg时达到最低值(P＜0.05)。尽管1.0 g/kg组keap1a表达量与2.0 g/kg组间无显著性差异, 但1.0 g/kg组keap1b表达量显著低于对照组和过量组(2.0 g/kg;P＜0.05)。

图2 饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量对青鱼幼鱼肝脏Nrf2/Keap1相关基因表达量的影响Fig. 2 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on gene expression levels related to Nrf2/Keap1 in the liver of juvenile black carp

如图 3所示, 随着饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量的增加, 肝脏中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表达量均呈现先升高后降低的趋势。尽管Cu/Zn-SOD基因表达量各组间无显著性差异(P＞0.05), 但富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5—1.0 g/kg时, 肝脏中Mn-SOD基因表达量较对照组显著升高(P＜0.05)。CAT基因表达量在2.0 g/kg时达到最高值, 显著高于其他组(P＜0.05)。与对照组相比,GST-M和GST-A基因表达量在富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5 g/kg时达到最低值, 随后升高。GST -M在各组间差异不显著(P＞0.05),GST-A基因表达量在0.5 g/kg显著低于其他各组(P＜0.05)。GPX1和GPX4基因表达量均在饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量为1.0 g/kg时达到最大值, 较对照组显著升高(P＜0.05)。GPX1基因表达量在0.5、1.0和2.0 g/kg三组间无显著性差异(P＞0.05), 但1.0 g/kg组GPX4基因表达量显著高于0.5和2.0 g/kg组(P＜0.05)。同时, 肝脏中GR基因表达量也呈先上升后下降的趋势, 且各组间无显著性差异(P＞0.05)。

图3 饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量对青鱼幼鱼肝脏抗氧化能力相关基因表达量的影响Fig. 3 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on gene antioxidant expression levels related in the liver of juvenile black carp

2.5 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼肝脏先天免疫指标的影响

如图 4所示, 随着饲料中富硒壶瓶碎米荠的添加, 肝脏中Leap2a、Leap2b、HEPC、LYZ和C3基因表达量均呈现先升高后降低的趋势。其中,Leap2a基因表达量在富硒壶瓶碎米荠添加量为0、0.5、和1.0 g/kg组间无显著性差异(P＞0.05), 但均显著高于过量组(2.0 g/kg;P＜0.05)。而Leap2b基因表达量在其添加量为1.0 g/kg组显著高于对照组(P＜0.05)。尽管HEPC基因表达量在富硒壶瓶碎米荠添加量为1.0和2.0 g/kg组间无显著性差异(P＞0.05),但均显著高于对照组和0.5 g/kg组 (P＜0.05)。富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5 g/kg组LYZ基因表达量显著高于对照组和过量组(2.0 g/kg;P＜0.05), 但与1.0 g/kg组间无显著性差异(P＞0.05)。饲料中添加富硒壶瓶碎米荠能够显著提高C3基因表达量(P＜0.05), 同时1.0 g/kg组C3基因表达量显著高于0.5 g/kg和过量组(2.0 g/kg;P＜0.05)。

图4 饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量对青鱼幼鱼肝脏先天免疫相关基因表达量的影响Fig. 4 Effect of dietary selenium-rich Cardamine hupingshanensis on gene expression levels related to innate immunity in the liver of juvenile black carp

3 讨论

3.1 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼生长性能和体组成的影响

作为动物体生长所必需的一种微量元素[20], 适量硒对维持生物体正常生理功能起着重要的作用[21],其补充量与生长参数密切相关[22]。本研究发现, 饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5—1.0 g/kg(硒实际添加量为0.43—0.75 mg/kg)时能够显著升高青鱼幼鱼的增重率和特定生长率, 并显著降低饲料系数(P＜0.05), 这与在草鱼(Ctenopharyngodon idella; 硒需求量为0.546—0.604 mg/kg)的研究结果基本一致, 高于黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco; 硒需求量为0.20 mg/kg)的需求量[21,23,24]。在真鲷(Pagrusmajor)的研究中发现, 饲料中添加适量硒, 可显著提高鱼体粗蛋白的含量, 增加鱼体蛋白质沉积[25], 与本实验结果相似。这可能是由于硒是5′脱碘酶的组成成分, 催化甲状腺素(T4)脱碘生成有活性的三碘甲状腺原氨酸(T3), T3水平的升高会刺激机体生长激素的分泌, 进而促进了鱼体的生长, 提高蛋白质沉积速率[26], 但在青鱼中需进一步验证。本实验结果显示, 饲料中添加0.5 g/kg富硒壶瓶碎米荠会显著提高鱼体粗脂肪的含量, 这与黄颡鱼研究结果一致, 可能是由于低剂量的硒可能促进鱼体粗脂肪的沉积, 对鱼体脂肪代谢有一定影响[24]。而在草鱼的研究中发现, 饲料中添加0.41—4.31 mg/kg硒时, 可以显著下降其鱼体粗脂肪含量, 在白鲟中也发现类似结果[27,40]。鲈的研究表明, 饲料中硒的添加对鱼体粗脂肪含量无显著性影响[28], 这可能是由于物种不同导致结果产生差异。同时本研究也发现, 当饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量为2.0 g/kg时, 鱼体的生长性能显著降低(P＜0.05)。这表明过量的富硒壶瓶碎米荠会对鱼体的生长产生抑制作用[29]。综上所述, 饲料中添加适量富硒壶瓶碎米荠可以提高鱼体的增重率, 增加鱼体蛋白沉积, 而过量的富硒壶瓶碎米荠则抑制鱼体生长。

3.2 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼血清生理生化指标的影响

动物机体血清生理生化指标的变化与饲料中营养物质的含量有关[30]。在正常状态下, 机体血糖处于动态平衡状态, 随着外界因素的改变发生变化[31]。本研究结果发现, 饲料中添加0.5—1.0 g/kg富硒壶瓶碎米荠时, 青鱼幼鱼血清中GLU的含量显著下降(P＜0.05)。血清中TG和TCH含量可以反映出脂肪在血液中的转运能力。本实验发现, 随着饲料中富硒壶瓶碎米荠添加量的增加, 血清中TG和TCH呈先上升后下降的趋势, 说明血清中脂肪代谢在一定范围内受到抑制, 但未对机体造成明显损伤, 这与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)研究结果相似[32]。HDL-C能够将过多的胆固醇转运至肝脏进行清除, 而LDLC则是将胆固醇和甘油三酯由肝脏运送至各个组织进行利用[33]。与大口黑鲈(Micropterus salmoides)和卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)的研究结果类似, 适量富硒壶瓶碎米荠(0.5 g/kg)能够改善血清中脂肪的转运和代谢, 而过量富硒壶瓶碎米荠(2.0 g/kg)会阻碍血清中脂肪的转运[34,35]。作为血清中最主要的蛋白质, ALB与机体免疫能力、肝脏和肾脏的健康状况有关, 其含量降低可能表明机体肝脏受到损伤[36,37]。而AST和ALT主要存在于肝脏、肾脏、心脏和其他器官, 因此血清中AST和ALT活性的增加可能与肝损伤或肝功能障碍有关[38]。在草鱼的研究中发现,纳米硒对草鱼肝脏和其他组织器官具有一定的保护作用, 随着饲料中硒添加量的增加, 血清中的AST和ALT的活性呈下降趋势[39]。在本实验中, 与对照组相比, 添加0.5—1.0 g/kg富硒壶瓶碎米荠时, 可显著提高ALB的含量, AST在其添加量为1.0 g/kg时达到最低(P＜0.05), 而富硒壶瓶碎米荠添加量对ALT无显著性影响(P＞0.05), 表明添加适量富硒壶瓶碎米荠可提高鱼体免疫能力, 防止肝脏受损。作为由肝胆向外排出的酶, ALP是一种磷酸单酯水解酶, 其含量与机体先天免疫有关[40]。本实验发现, 随着富硒壶瓶碎米荠添加量的增加, 血清中ALP呈先上升后下降的趋势, 说明饲料中添加富硒壶瓶碎米荠能够通过提高ALP分泌量进而提高鱼体的先天免疫能力。

3.3 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼肝脏硒代谢指标的影响

硒在壶瓶碎米荠中的存在形式主要为硒代半胱氨酸, 而硒代半胱氨酸在机体内被SCLY催化分解, 生成硒化物和丙氨酸, 硒化物和三磷酸腺苷(ATP)在SPS1的催化下生成硒磷酸, 直接参与合成相应的硒蛋白[41,42]。在动物机体内, 硒蛋白具有调节氧化应激、免疫功能和内质网应激等多种作用,对促进机体硒代谢具有重要意义[43]。硒蛋白代谢的主要部位是肝脏, SEPP在肝脏中合成, 将硒转运至其他组织中[44]。当SEPP基因被敲除后, 各组织硒供应会受到不同程度的影响, 因此SEPP主要用于维持机体硒的平衡[45]。SEP15是一种内质网驻留蛋白, 在维持氧化还原稳态和促进糖蛋白正确折叠中具有重要作用[46]。SEPT也存在于内质网中, 在维持机体钙离子稳态和促进机体抗氧化方面其重要作用[47]。SEPH位于细胞核中, 参与机体氧化还原的调节, 调节细胞增殖, 是防止细胞不受控制地增殖的关键调节剂[48]。 在本研究中, 富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5和1.0 g/kg时青鱼肝脏中SCLY、SPS1、SEP15、SEPT2、SEPH和SEPP基因表达量均高于对照组。由此可见, 饲料中添加0.5—1.0 g/kg富硒壶瓶碎米荠时能够促进SCLY和SPS1催化分解硒代半胱氨酸, 生成硒磷酸, 促进SEPP的合成, 保证机体硒含量的稳态。同时饲料中添加适量的富硒壶瓶碎米荠也能够通过提高SEP15、SEPT2、SEPH等硒蛋白基因表达量, 进而维持机体的氧化还原稳态, 发挥对机体的保护作用[44—46]。

3.4 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼肝脏抗氧化能力的影响

饲料中营养物质的均衡, 对维持机体稳态具有重要作用[18]。在氧化应激条件下, 机体产生大量活性氧(ROS), 高水平的ROS会导致细胞的凋亡, 从而对组织造成损伤[49], 此时抗氧化防御系统包括SOD、CAT和GSH-PX等对保护机体至关重要[50]。硒是预防氧化应激的重要微量元素[51], 其作为GSH-PX的活性中心, GSH-PX可分解机体内过量的过氧化氢, 提高机体抗氧化能力[52,53]。本研究发现, 富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5 g/kg时, 肝脏中SOD和CAT活性达到最高, 而GSH-PX的活性较对照组持续上升(P＜0.05), 二者呈正相关关系, 这与虹鳟、尖吻鲈和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的研究结果一致[54—56]。在草鱼的研究中发现, 饲料中添加0.9 mg/kg硒可以显著提高肝脏中Nrf2基因表达量, 表明一定量的膳食硒可以激活机体内Nrf2/keap1信号通路[39], 在动物机体抗氧化调控中起重要作用。在本实验中, 与对照组相比, 富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5和1.0 g/kg时青鱼肝脏中Nrf2基因表达量持续上升, 而keap1基因出现下调, 其下游的抗氧化相关基因Mn-SOD、CAT、GPX1和GPX4的基因表达量均升高, 这表明饲料中添加富硒壶瓶碎米荠可以通过Nrf2/keap1信号通路促进鱼体相关靶基因的表达, 保护细胞膜免受氧化损伤, 保证机体的正常生长[57,58]。青鱼幼鱼在富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5 g/kg组中GR活性、GSH含量和T-AOC水平较对照组和过量组(2.0 g/kg)显著升高(P＜0.05)。同时富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5 g/kg时MDA水平显著低于对照组和过量组(2.0 g/kg), 这说明饲料中添加适量的富硒壶瓶碎米荠能够减缓脂质过氧化过程[59]。由此可见, 饲料中添加适量的富硒壶瓶碎米荠能够通过上调GR活性并下调GST活性的途径来提高GSH含量, 减少脂质过氧化物的产生, 降低细胞损伤程度, 进而发挥其对机体抗氧化的保护作用[60, 61]。

3.5 富硒壶瓶碎米荠对青鱼幼鱼肝脏先天免疫指标的影响

抗菌肽广泛存在于各种生命体中, 是宿主不可或缺的组成部分, 保护机体免受细菌侵害, 为机体建立起第一道屏障, 其中鱼类抗菌肽包括HEPC和Leap2等[62]。Leap2在肝脏中产生, 通过提高其mRNA表达量进而抵御细菌入侵, 在第一道防线中起重要作用[63]。HEPC通过提高巨噬细胞的内吞作用和蛋白酶水解作用破坏病原体细胞, 导致病原体死亡[64]。本实验结果发现, 在富硒壶瓶碎米荠添加量为1.0 g/kg时, 肝脏中Leap2b和HEPC基因表达量较对照组均显著升高(P＜0.05), 因此, 饲料中添加适量的富硒壶瓶碎米荠可以提高青鱼对细菌的抵抗能力, 增强机体的先天免疫能力。溶菌酶是重要的抗菌酶, 能直接反应鱼类先天免疫能力的高低[65]。本实验发现, 肝脏中LYZ基因表达量呈先升高后降低的趋势, 在富硒壶瓶碎米荠添加量为0.5 g/kg时达到最高值, 较对照组和过量组(2.0 g/kg)显著升高(P＜0.05), 此结果与尼罗罗非鱼、中华绒螯蟹和欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)一致[6,66,67]。在大菱鲆(Scophthalmus maximus)的研究中发现, 在铜胁迫下, 随着饲料中硒添加量的增加, 肝脏中LYZ相对表达量呈上升趋势, 说明饲料中硒添加量的增加可以缓解高铜诱导的免疫抑制, 对机体免疫能力有促进作用[68]。补体系统是先天免疫系统的重要组成部分, 通过经典途径、旁路途径和凝集素途径对机体进行免疫调节, 而补体C3则是激活补体系统的关键分子[69]。本实验结果表明, 适量的富硒壶瓶碎米荠可以促进补体C3的表达, 提高机体的先天免疫能力, 这与尼罗罗非鱼研究结果一致[26]。综上所述,饲料中添加适量的富硒壶瓶碎米荠能够通过上调Leap2、HEPC、LYZ和补体C3的表达量进而增强青鱼幼鱼的先天免疫能力。

4 结论

本实验结果显示饲料中添加0.5—1.0 g/kg富硒壶瓶碎米荠能显著提高青鱼幼鱼的生长性能, 提高青鱼幼鱼肝脏硒代谢、抗氧化及先天免疫能力, 上述结果也为富硒壶瓶碎米荠在青鱼幼鱼配合饲料中的科学使用奠定了基础。