核因子2相关因子2激动剂dh404对异氟醚诱导认知功能障碍大鼠脑海马组织的影响

张纵横, 朱全智, 丁蕾

术后认知功能障碍（POCD）是病人手术麻醉后出现的一种中枢神经系统并发症, 主要临床表现为病人术后出现学习、记忆、判断力、注意力等下降[1］。研究发现异氟醚麻醉可致术后认知功能障碍, 可能与异氟醚加剧氧化应激反应, 增加脑内海马神经元凋亡有关[2］。核因子2相关因子2（Nrf2）是一种转录因子, 氧化应激时能结合抗氧化反应元件启动氧化应激相关基因的转录[3］。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）是Nrf2负调控因子, 具有重要的抗氧化应激调控机制[4］。血红素加氧酶1（HO-1）作为一种应激蛋白, 在应激和疾病条件下具有抗炎、抗组织损伤、抗氧化及保护细胞黏膜等积极作用, 是Nrf2下游的抗氧化基因[5］。本研究起止时间为2018年12月至2019年8月。本研究拟探讨Nrf2激动剂dh404改善异氟醚麻醉诱导的认知功能障碍, 进一步探讨Nrf2信号通路在氟醚麻醉诱导的认知功能障碍大鼠脑组织中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 选择清洁级SD雄性大鼠24只, 鼠龄8～12周, 体质量范围为250～280 g, 购自中国科学院昆明动物研究所, 动物生产许可证号为SCXK（滇）K2016-0001, 医学实验动物使用许可证号为SYXK（滇）K2017-0009。无特定病原体级动物房饲养条件：温度范围为22～26 ℃, 相对湿度范围为40%～60%, 适应性喂养3 d。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2 实验主要试剂 Nrf2激动剂dh404（Reata制药公司, 批号HY-112671）、异氟醚（美国雅培制药有限公司）、Nrf2、HO-1、Keap1、β肌动蛋白（β-actin）PCR正反向引物（上海生工公司）、Nrf2兔单克隆抗体、HO-1兔单克隆抗体、Keap1兔单克隆抗体（均购自美国Abcam公司）、山羊抗兔二抗（购自美国LICOR公司）、丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒（均购自南京建成生物工程研究所）。

1.1.3 主要仪器 Drager Fabius型麻醉机（德国Drager公司）、Morris水迷宫（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）、实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad公司）、酶标仪（Thermo公司）、石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司）、正置光学显微镜、成像系统（日本尼康）。

1.2 建立动物模型、分组24只大鼠均于清洁级动物房适应性饲养1周后按照随机数字表法将24只大鼠分为三组, 对照组、异氟醚组、Nrf2激动剂dh404+异氟醚组（dh404组）, 每组8只。dh404组在吸入异氟醚前30 min腹腔注射Nrf2激动剂dh404（1.5 mg/kg）, 对照组和异氟醚组注射等量的生理盐水。将各麻醉组大鼠放置于麻醉箱中, 经麻醉机向箱内充入30%氧气的空气, 调节挥发罐使异氟醚浓度为2%, 持续时间6 h。将对照组大鼠置于含30%氧气的空气中6 h。各组在麻醉期间经腹腔注射补充葡萄糖及生理盐水, 每2小时1次, 0.5毫升/次。

1.3 观察指标

1.3.1 Morris水迷宫测试 麻醉前一天进行适应性训练。参照参考文献[6］, 各组大鼠在麻醉结束后24 h进行Morris水迷宫测试。①定位航行实验：每天训练4次, 连续5 d。将大鼠分别从不同象限面向池壁轻放入池中, 限时60 s, 记录大鼠从入水到爬上平台所用的时间, 即逃避潜伏期。将60 s内找不到平台的大鼠逃避潜伏期记为60 s。②空间探索实验：在大鼠完成最后一次定位航行实验结束24 h后, 撤去平台, 任选一入水点将大鼠放入水池内, 记录60 s内在原平台所在象限的探索时间及穿越平台次数。测试结束后立即处死大鼠, 取脑海马组织进行后续实验。

1.3.2 采用免疫组织化学法检测脑海马组织Nrf2表达情况 将4%多聚甲醛固定脑组织, 用刀片将脑组织切成2 mm厚的组织块, 放入一次性蜡盒中, 脱水、透明、浸蜡、包埋后, 蜡块在组织切片机上连续切片, 片厚4 μm。经二甲苯脱蜡、乙醇逐步水化后高温抗原修复20 min。3%双氧水室温避光浸泡10 min。每张切片的组织上滴加50 μL山羊血清, 封闭30 min后, 加50 μL兔抗鼠Nrf2抗体孵育, 4 ℃过夜。次日, 弃去一抗后滴加二抗孵育30 min。滴加DAB显色剂, 镜下观察组织颜色。之后进行苏木素复染, 中性树脂封片。显微镜下观察Nrf2的蛋白表达水平。

1.3.3 采用蛋白质印迹法检测脑组织HO-1、Keap1表达水平 提取脑组织总蛋白, 蛋白质定量试剂盒定量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）后转膜至聚偏二氟乙烯2 h, 5%脱脂牛奶封闭1 h, 洗涤缓冲液洗膜后加入一抗（1∶1 000稀释）, 孵育2 h, 加入二抗（1∶3 000稀释）, 室温孵育2 h。电化学发光显影, 以β-actin为内参, 凝胶成像系统分析目的蛋白与内参条带的相对灰度值。

1.3.4 采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测脑组织Nrf2、HO-1、Keap1表达水平 Trizol法提取脑组织总RNA并逆转录, 采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测各组脑组织Nrf2、HO-1、Keap1基因的表达水平。引物设计如下：Nrf2正向5'-CCATTCCCGAGTTACAGTGTCTT-3', 反 向5'-GATCGATGAGTAAAAATGGTAATTGC-3'；HO-1正向5'-AGCATGTTCCCAGGATG-3', 反向5'-GCTCAATGTTGAGCACA-3'；Keap1正向5'-GGTACGACGTGGAGACAGAG-3', 反向5'-TAGCCTCCGAGGACGTAGAT-3'；β-actin正向5'-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3', 反 向5'-CGTCATCCA TGGCGAACTGG-3'。每个样本重复检测3次。基因的相对表达量按2-ΔΔCt法计算。

1.3.5 分别检测脑组织MDA、SOD、GSH-Px的表达水平 将脑组织用冰盐水冲洗, 试纸擦干后称重, 按体质量体积比1∶9加入生理盐水, 研磨制成10%脑匀浆。4 ℃, 5 000 r/min离心10 min, 按照试剂盒说明书分别采用TBA法检测脑组织MDA浓度、WST-1法检测脑组织SOD活性和分光光度法检测脑组织GSH-Px活性。

1.4 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行数据分析, 所有计量数据均呈正态分布, 结果用xˉ ±s表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 多组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠认知功能的比较与对照组相比, 异氟醚组大鼠逃避潜伏期长, 平台所在象限停留时间及穿越平台次数减少（P＜0.05）；与异氟醚组相比, dh404组大鼠逃避潜伏期缩短, 平台所在象限停留时间及穿越平台次数增加（P＜0.05）。见表1。

表1 dh404对异氟醚麻醉后各组大鼠认知功能的影响/xˉ ±s

2.2 各组大鼠脑海马组织Nrf2表达情况脑海马组织CA1区免疫组织化学结果见图1。异氟醚组大鼠中可见少量Nrf2核阳性细胞, dh404组大鼠脑组织中可见大量核阳性细胞, 见图2。qRT-PCR结果显示, dh404组大鼠脑组织Nrf2 mRNA表达水平（6.70±0.98）高于对照组（1.00±0.12）及异氟醚组（1.16±0.15）（F=95.63,P＜0.001）, 而异氟醚组与对照组Nrf2 mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组大鼠脑海马组织CA1区结构切片染色图（免疫组织化学染色×400）：1A为对照组；1B为异氟醚组；1C为dh404组

图2 各组大鼠脑海马组织Nrf2表达情况（免疫组织化学染色×400）：2A为对照组；2B为异氟醚组；2C为dh404组

2.3 各组大鼠脑海马组织HO-1、Keap1表达水平蛋白质印迹法和qRT-PCR结果均显示, 与对照组相比, 异氟醚组和dh404组大鼠脑组织HO-1蛋白和mRNA表达减少、Keap1蛋白和mRNA表达升高（P＜0.05）；与异氟醚组相比, dh404组大鼠HO-1蛋白和mRNA表达升高、Keap1蛋白和mRNA表达减少（P＜0.05）。见表2, 图3。

图3 各组大鼠脑组织HO-1、Keap1蛋白表达水平

表2 dh404对各组大鼠脑组织HO-1蛋白、Keap1和mRNA表达的影响/xˉ ±s

2.4 各组大鼠脑匀浆丙二醛浓度、SOD及GSH-Px活性与对照组相比, 异氟醚组和dh404组大鼠丙二醛浓度增加而SOD、GSH-Px活性降低（P＜0.05）；与异氟醚组相比, dh404组大鼠丙二醛浓度减少而SOD、GSH-Px活性增强（P＜0.05）。见表3。

表3 dh404对各组大鼠脑匀浆丙二醛浓度、SOD及GSH-Px活性的影响/xˉ ±s

3 讨论

异氟醚是临床上最常用的吸入性麻醉药物之一。研究表明, 异氟醚可诱发中枢神经毒性, 导致术后认知功能减退[7-8］。异氟醚的浓度、麻醉时间、指标检测时间的不同可导致其对新生大鼠远期认知功能的影响不同[9］。曹高亚等[10］研究表明持续吸入异氟醚对空间记忆能力的影响显著, 而且长时间高浓度的吸入方式造成的影响时间较长；Wang等[11］研究发现, 1.5%异氟醚治疗2 h会损害啮齿动物的认知功能, 包括学习记忆功能和焦虑相关行为。水迷宫是检测海马功能直接相关的空间学习记忆能力的经典行为学实验手段[12］。本研究结果发现, 异氟醚组大鼠逃避潜伏期与对照组比长, 平台所在象限停留时间及穿越平台次数与对照组比减少。表明大鼠异氟醚麻醉后引发认知功能障碍。

Nrf2是一种细胞质蛋白, 在被ROS或亲电子试剂激活后进入细胞核, 识别ARE, 编码下游抗氧化蛋白（Nrf2、HO-1及SOD-1）而发挥内源性抗氧化作用, Nrf2、HO-1和SOD-1及其mRNA表达水平可间接反映Nrf2信号通路激活情况[13-14］。有研究显示, 吸入1.5%异氟醚能够诱导氧化应激并影响神经和认知发育, 而PKCα/Nrf2信号通路的激活具有神经保护作用[15］。另有研究发现, 高压氧预处理对异氟烷诱导小鼠术后认知功能障碍模型中的记忆缺陷具有神经保护作用, 可能与通过激活Nrf2/HO-1途径介导有关[16］。本研究结果发现, 异氟醚组大鼠脑组织中可见少量Nrf2核阳性细胞, 而异氟醚组和dh404组大鼠脑组织Keap1表达水平升高、HO-1表达水平减少, 提示异氟醚可通过氧化应激诱导大鼠发生认知功能障碍, 吸入异氟醚后, Nrf2表达水平呈应激性升高, 但无法有效减轻大鼠脑组织氧化应激水平。因此, 本研究观察Nrf2激动剂dh404对神经认知的保护作用。Morris水迷宫实验结果表明, dh404组大鼠相关指标均有所改善。且dh404组大鼠脑组织中可见大量核阳性细胞, Nrf2、HO-1表达水平升高而Keap1表达水平减少。提示预给予dh404可以有效改善异氟醚麻醉所诱导大鼠空间学习能力下降, 可能与Nrf2信号通路激活, 从而起到脑保护作用有关。

麻醉手术过程中会增加机体氧化应激压力, 对机体造成进一步损害。丙二醛能够反映细胞受氧自由基损伤的程度, 而SOD活性高低反应机体抗氧化能力[17］。GSH-Px属于体内分布较广的过氧化物分解酶, 其活性高低反应了机体清除氧自由基的能力, 是机体氧化应激反应的灵敏指标[18］。SOD、GSH-Px和过氧化氢酶共同构成机体抗氧化防御系统, 能直接反映机体抗氧化能力[19］。本研究结果发现, 与对照组相比, 异氟醚组和dh404组大鼠丙二醛浓度增加而SOD、GSH-Px活性降低；与异氟醚组相比, dh404组大鼠丙二醛浓度减少而SOD、GSH-Px活性增强。提示dh404可起到保护异氟醚诱导认知功能障碍的大鼠, 其可能的作用机制是Nrf2信号通路激活起到抗氧化作用。

综上所述, 异氟醚6 h吸入可诱发大鼠认知功能障碍与脑组织氧化应激水平增高有关, 促进Nrf2信号通路激活可改善异氟醚6 h吸入导致认知功能损害。