牡丹根不同部位成分差异性分析

张树蓉，赵宏苏,2，欧迎雪，翟宏焱，吴德玲,2,4,5，张 村，张 伟,2,4,5*

1安徽中医药大学药学院；2中药饮片制造新技术安徽省重点实验室，合肥 230012；3安徽省食品药品检验研究院，合肥 230051；4国家药品监督管理局中药质量研究与评价重点实验室；5安徽中医药大学国家中医药管理局中药炮制传承基地，合肥 230012；6中国中医科学院中药研究所，北京 100700

毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的药用部位多为其根皮(牡丹皮)，临床应用广泛，具有清热凉血、活血化瘀功效[1]。现代研究表明，牡丹中主要化学成分为酚及酚苷类成分代表丹皮酚、单萜及其苷类成分代表芍药苷、鞣酸类成分代表没食子酸等，其主要药理作用有抗炎、抗菌、中枢抑制、调节免疫、调节心血管系统等[2-8]。早在南北朝《雷公炮制论》中就记载“凡采牡丹皮根，日干，以铜刀劈破去骨。”[9]，《本草经集注》：“色赤者为好，用之去心”[10]中也记载牡丹皮去心加工方法并沿用至今。自宋代《传信适用方》[11]中记载牡丹皮“去心及粗皮”、《万病回春》[12]中记载“去皮”开始，说明临床应用中出现刮去栓皮的牡丹皮，即现今应用的“粉丹皮”。在《中华人民共和国药典》(2020版一部)中，收载牡丹皮为连丹皮和刮丹皮两种规格，且挑选长5～20 cm，直径在0.5～1.2 cm范围内的根皮入药，导致牡丹的侧根、须根以及木心、栓皮等部位作为不合格或非药用部位舍弃，造成极大的资源浪费。在产地及市场调研中发现，牡丹皮道地产区加工中只抽心不去栓皮，市场上的刮丹皮多数以外观洁净为其商业目的。因此对牡丹根其他部位的有效成分进行研究，可一定程度上扩大牡丹根部利用率，减少资源浪费。

前期研究发现在牡丹不同部位均分布有药效成分[13-18]，本研究根据加工过程将药用牡丹根分为连丹皮、刮丹皮、栓皮、木心、须根五个部位进行特征图谱研究并结合化学计量学分析不同化学组分在牡丹根加工过程中分成的不同部位中的分布，对其进行质量的整体性及专属性评价，为牡丹皮规格等级划分提供科学依据，非药用部位的开发利用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters ACQUITY H-CLASS UPLC超高效液相色谱仪(组成：四元溶剂管理器、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower 2工作站、真空脱气机等)；PALL Cascada II.I实验室纯水一体化系统(PALL过滤器北京有限公司)；EX125DZHW十万分之一天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；WL-100型打粉机(浙江省威力制药机械厂)；KQ700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料

氧化芍药苷(批号：16021505，纯度≥98%)、丹皮酚新苷(批号：100291-86-9，纯度≥98%)、芍药苷 (批号：0736-200015，纯度≥98%，以上购于北京世纪奥科生物技术有限公司)、没食子酸(批号：GZDD-0128，纯度≥98%，购于贵州迪大生物科技有限责任公司)、没食子酸甲酯(批号：DST200424-077，纯度≥98%)、丹皮酚原苷(批号：DST200302-049，纯度≥98%)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(批号：DST200518-001，纯度≥98%)、牡丹皮苷C(批号：DST200226-065，纯度≥98%)、苯甲酰氧化芍药苷(批号：DST191210-088，纯度≥95%)、苯甲酰芍药苷 (批号：20032703，纯度≥98%，以上购于成都普菲德生物技术有限公司)、芍药内酯苷(批号：39011-90-0，纯度≥98%，购于上海源叶生物科技有限公司)、1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖(批号：CFS201901，纯度≥98%，购于武汉天植生物技术有限公司)；丹皮酚(由天然药物化学实验室自制，纯度大于99%)。

乙腈、甲醇(色谱级，美国Fisher公司)；甲酸(色谱级，美国Sigma公司)，其他试剂均为分析级。

1.3 样品来源与分类

牡丹植株采自安徽省芜湖市、铜陵市、亳州市，经安徽中医药大学方成武教授鉴定原植物为毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.。10月份采挖根部，除去地上部分和根部表面泥沙。将牡丹根按照加工过程进行分类。

抽取牡丹根部木心作为木心部位；剥取的根皮作为连丹皮部位；将连丹皮表面栓皮刮去，分别得到栓皮部位和刮丹皮部位(韧皮部)；参照《中国药典》2020版一部中，直径小于0.5 cm细根即为须根；收集栓皮、木心、须根、连丹皮、刮丹皮五个部位，分别晒干，备用。牡丹根不同部位取材见图1，样品具体产地信息见表1。

图1 牡丹根各部位示意图Fig.1 Schematic diagram of peony root

表1 样品信息来源Table 1 Sources of samples

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

称取没食子酸、氧化芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚对照品适量，精密称定。加70%甲醇溶解制成质量浓度分别为88.2、147、55.5、169.5、212.4、60.6、282.5、71.428、179.1、59.2、54.8、119.6、364.5 μg/mL的对照品储备液，4 ℃保存备用。

2.2 供试品溶液制备

称取表1中药材栓皮、木心、须根、连丹皮、刮丹皮粉末(过4号筛)，每份0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶，精密加入70%的甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min(功率280 W，频率40 kHz)，放冷，再称定重量，用70%甲醇补重，摇匀，离心(4 500 r/min，10 min)，取上清液用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液为供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Thermo Scientific Syncronis C18(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，流动相为乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B)，柱温：30 ℃，进样体积：2 μL，流速：0.2 mL/min，检测波长：246 nm 。梯度洗脱程序为0～1 min，8%→15%A；1～5 min，15%A；5～8 min，15%→18%A；8～15 min，18%→30%A；15～20 min，30%→45%A；20～24 min，45%→95%A；24～24.5 min，95%→8%A；24.5～30 min，8%A。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

精密称取MC-5号粉末，按“2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件重复进样6次，测得没食子酸、氧化芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚RSD值均在0.48%～2.35%。结果表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

精密称取MC-5号粉末，按“2.2”项下制备供试品溶液，分别在制备后0、4、8、12、16、20 h按“2.1”项色谱条件进行色谱分析。测得没食子酸、氧化芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚的RSD值均在1.32%～2.73%，表明样品溶液在20 h内相对稳定。

2.4.3 重复性试验

精密称取MC-5号粉末6份，按“2.2”项下制备供试液，按“2.1”项色谱条件依次进样，测得没食子酸、氧化芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚含量的RSD均在1.63%～2.90%。表明该方法重复性良好。

2.4.4 加样回收率

精密称取已知含量的样品粉末(MC-5)6份，每份约0.125 g，另取没食子酸等对照品，用70%甲醇制成一定浓度混合对照品溶液。按“2.2”项下制备供试液，按“2.1”项色谱条件依次进样，测得没食子酸、氧化芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍药苷、1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚的回收率为98.73%～101.66%，其RSD均在0.62%～2.89%，表明方法准确度良好。

2.4.5 线性关系考察

精密适量移取各对照品储备液于5 mL容量瓶中，70%甲醇定容至刻度，混匀，即得混合对照品储备液，按2、5、10、20、50、100倍稀释，得系列混合对照品溶液。以峰面积(y)为纵坐标，浓度为横坐标(x)绘制标准曲线，进行线性回归，回归方程、相关系数及线性范围见表2。结果表明，各对照品在各自浓度范围内的线性关系良好。

表2 13种对照品的线性回归方程Table 2 Linear regression equation of 13 reference substance of Cortex Moutan

2.5 牡丹根不同部位差异性标志成分挖掘

2.5.1 UPLC特征图谱的建立及共有峰标定

将各批次牡丹皮样品UPLC图谱数据导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)”，设定(MC-1)为参照图谱，采用中位数法，时间窗的宽度默认为0.1 min，经过多点校正后将谱峰自动匹配，生成30批牡丹根不同部位UPLC特征图谱(见图2)和对照图谱(见图3)，共标定共有峰19个，通过对照品色谱图指认，确定1号峰为没食子酸，2号峰为氧化芍药苷，4号峰为没食子酸甲酯，5号峰为丹皮酚原苷，7号峰为丹皮酚新苷，8号峰为芍药内酯苷，10号峰为芍药苷，13号峰为1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖，14号峰为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，15号峰为牡丹皮苷C，16号峰为苯甲酰氧化芍药苷，17号峰为苯甲酰芍药苷，19号峰为丹皮酚。

图2 牡丹根不同部位特征图谱Fig.2 Characteristic map of different parts of peony root

图3 牡丹根不同部位对照图谱Fig.3 Control map of different parts of peony root

2.5.2 聚类分析(HCA)

以30批牡丹根不同部位样品UPLC特征图谱共有峰面积为变量，运用IBM SPSS Statistics 26.0以平方欧氏距离(Euclidean距离)为区间，采用组间联接法对30批牡丹根不同部位样品进行聚类分析，结果见图4。当分类距离达到15时，可分为3类，其中须根、连丹皮、刮丹皮基本聚为一类，栓皮聚为一类，木心基本聚为一类，说明连丹皮、刮丹皮、须根化学成分及含量无显著性差异，木心和栓皮与连丹皮、刮丹皮等常规药用部位的共有成分含量差异显著，聚类分析可以将牡丹根传统药用部位和非药用部位分开。

图4 牡丹根不同部位样品聚类分析结果Fig.4 Cluster analysis results of samples from different parts of peony root

2.5.3 主成分分析(PCA)

为验证聚类分析结果，进一步采用PCA进行分析。将30批牡丹根不同部位样品的19个共有峰峰面积导入SIMCA 14.1 软件，以特征值>1，提取出主成分有5个，其累积贡献率为89.62%。通过少数贡献度较大成分，可将30批样本分为三类，其中须根、连丹皮、刮丹皮基本聚为一类，栓皮聚为一类，木心基本聚为一类，见图5。以上与聚类分析结果一致。

图5 牡丹根不同部位样品主成分分析结果Fig.5 Principal component analysis results of samples from different parts of peony root

2.5.4 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)

为筛选30批牡丹根不同部位样品的组内差异成分，将19个共有峰匹配结果导入 SIMCA 14.1软件进行PLS-DA分析，变量重要性投影值(variable importance in projection，VIP)结果见图6。由图6可知，VIP值>1的成分有10个，说明这10个成分是牡丹根不同部位主要差异性成分，其中1号峰为没食子酸，17号峰为苯甲酰芍药苷，14号峰为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，13号峰为1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖，10号峰为芍药苷，16号峰为苯甲酰氧化芍药苷，7号峰为丹皮酚新苷。

图6 牡丹根不同部位样品的PLS-DA的VIP图Fig.6 VIP map of PLS-DA of samples from different parts of peony root

2.6 牡丹根不同部位特征性成分分析

为进一步探究牡丹根不同部位化学成分分布规律及富集特征，以上述筛选的10个差异性成分中可指认的7个差异性成分及含量大于0.1 mg/g的化学成分作为定量分析指标，分别为没食子酸、氧化芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚13个成分。混合对照品和供试品样品色谱峰见图7、图8。将30批样品中所测定指标成分的峰面积带入2.4.5中线性回归方程计算，得到牡丹根各部位中各成分的含量，其中酚及酚苷类成分含量大致为连丹皮>刮丹皮>须根>栓皮>木心，单萜及其苷类成分大致为栓皮>连丹皮>须根>木心>刮丹皮，鞣酸类成分大致为须根>栓皮>连丹皮>刮丹皮>木心，具体见表3，图9。

图7 混合对照品色谱图Fig.7 Chromatogram of mixed reference substance注：1-没食子酸；2-氧化芍药苷；4-没食子酸甲酯；5-丹皮酚原苷；7-丹皮酚新苷；8-芍药内酯苷；10-芍药苷；13-1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖；14-1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖；15-牡丹皮苷C；16-苯甲酰氧化芍药苷；17-苯甲酰芍药苷；19-丹皮酚。Note:1-Gallic acid;2-Oxypaeoniflorin;4-Methyl gallate;5-Paeonolide;7-Aplopaeonoside;8-Albiflorin;10-Paeoniflorin;13-1,2,3,6-O-Tetragalloylglucose;14-1,2,3,4,6-O-Pentagal-loylglucose;15-Mudanpioside C;16-Benzoyloxypaeoniflorin;17-Benzoylpaeoniflorin;19-Paeonol.

图8 供试品样品色谱峰Fig.8 Chromatographic peaks of the test sample注：各编号对应的化合物同图7。Note:The compounds corresponding to each number are the same as Fig 7.

图9 牡丹根不同部位中各组分含量Fig.9 Content of components in different parts of peony root注：各编号对应的化合物同图7。Note:The compounds corresponding to each number are the same as Fig 7.

表3 牡丹根不同部位中各组分含量测定结果Table 3 Content of components in different parts of peony root(mg/g)

续表3(Continued Tab.3)

3 讨论与结论

化学成分是中药发挥其传统功效的物质基础，合理选取指标性成分进行中药质量控制与评价研究是关键步骤。本研究采用特征图谱对牡丹根在加工过程中分成的五个部位的整体化学信息进行采集，结合化学计量学的评价体系筛选13个差异性特征成分进行含量测定，对牡丹皮根不同部位进行客观性质量评价。

通过UPLC特征图谱对牡丹根不同部位化学成分进行整体表征，较为全面地比较了连丹皮、刮丹皮、木心、栓皮、须根的化学信息，通过HCA和PCA分析可以得出连丹皮、刮丹皮、须根三个部位化学成分相似，可聚为一类，木心中化学成分较少，且主要成分如丹皮酚和芍药苷含量偏低，栓皮中化学成分较为丰富。

通过PLS-DA筛选了牡丹根不同部位10个特征性差异成分，根据对照品指认得没食子酸、丹皮酚原苷、芍药苷、1,2,3,6-O-四没食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷等7个成分，同时结合含量大于0.1 mg/g的功效成分(氧化芍药苷、没食子酸甲酯、丹皮酚新苷、芍药内酯苷、牡丹皮苷C、丹皮酚)共13个成分进行含量测定，以酚及酚苷类、单萜及其苷类、鞣酸类组分等类别化学组分分析牡丹根不同部位化学成分分布规律[19]。含量测定结果表明牡丹根不同部位化学成分既有相似性又有差异性，造成差异性的原因可能与牡丹生长过程中次生代谢产物的合成与转移有关[20]。连丹皮中酚及酚苷类、鞣酸类含量与刮丹皮大致相当，但单萜及其苷类组分含量高于刮丹皮，这与伍淳操等[21]文献报道一致，说明单萜及其苷类组分主要累积在最外栓皮层，史素影等[22,23]在研究芍药根不同部位发现单萜苷类成分含量分布栓皮层>韧皮>木质，推测芍药属特征性组分单萜苷类次生代谢累积特征相同。栓皮在连丹皮中所占比重较少，但其所含化学成分丰富，单萜苷类成分含量富集。这说明在临床疗效上，连丹皮可能优于刮丹皮，也提示牡丹皮产地加工时保留栓皮部位更为适宜。

非药用部位木心中有效成分含量比较发现，木心中所测的特征成分含量相对较低，因木心为牡丹根部木质化程度高的部位，去除木心可提高牡丹药用部位有效成分富集，因此，牡丹皮加工过程中去心具有科学性。非药用部位须根中酚及酚苷类、单萜及其苷类、鞣酸类组分含量与连丹皮相当，作为非药用部位舍弃较为可惜，但须根在加工过程中较难与木心完全剥离，且较容易映入灰分部分导致整体产品下降，不易纳入药用部分进行质量控制，可收集须根部位考虑综合资源开发利用。

药用植物体内次生代谢物差异积累是不同基源、产地药材质量差异的核心问题。本研究表明，牡丹根皮是主要功效成分及其次生代谢产物积累的主要器官，牡丹药用部位为去心的根皮具有科学性，又因栓皮中单萜及其苷类成分含量较高，因此，牡丹产地加工保留栓皮更为合适。非药用部位须根中各组分含量与连丹皮相差不大，但因其直径过细，难与木心剥离，且较难对其进行质量控制，而不宜纳入药用部位，但可考虑加工用于日化、兽药等产业。值得注意的是，单萜及其苷类成分在牡丹根不同部位中差异积累，这可能与牡丹在植物生长中次生代谢产物如何合成并转运至药用部位贮藏有关，需要结合转录组学等分子生药学进一步揭示科学内涵，这对于牡丹皮质量评价具有重要意义。