荧光假单胞菌缓解植烟土壤酸化效果及对烟草青枯病的防治作用

施河丽，谭 军，谭绍安，彭五星，尹忠春，祁高富，向必坤*

1.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北省恩施市施州大道119 号 445000

2.华中农业大学，武汉市狮子山街1 号 430070

依据土壤酸碱度分级，pH 6.5～7.5的土壤为中性土壤，pH 5.5～6.5 为酸性土壤，pH 4.5～5.5 为强酸性土壤，pH＜4.5 为极强酸性土壤。土壤酸化主要是由自然因素和人为因素引起的土壤中盐基离子淋失而氢离子增加、酸度增高的过程［1-2］。据统计，截至2015年，我国酸化土壤面积达2亿公顷，约占我国陆地面积的21%，主要分布在长江以南的广大地区。一般烟草生长的最适宜土壤pH范围为5.5～6.5，我国有很大一部分植烟土壤的pH 低于该范围［3］，土壤酸化不仅对烟草的生长发育和品质影响较大，还会导致土传病害如青枯病的发生和流行，间接影响烟叶产质量，不利于烟叶生产的长远发展［4-5］。

添加土壤改良剂可有效缓解土壤酸化，目前使用较多的酸性土壤改良剂有石灰、粉煤灰和生物质炭等，但这些改良剂在改善土壤环境酸度的同时还有一定的负面影响［6-8］，因此研究者们开始利用生长繁殖容易、生产成本低、不污染环境、对人畜安全的微生物对酸化土壤进行治理。假单胞菌因在土壤中分布广泛、适应性强、容易分离，且具有改善植物营养、降解有毒物质［9-11］、产生抗生素［12］和植物生长调节物质［13］、促进植物生长［14］和抑制病害［15-16］等作用，已成为土壤微生物菌剂研究的热点之一。从酸性土壤中可分离筛选出既适应酸性环境又具有多种活性的有益假单胞菌，如Verma 等［17］在茶树根际酸性土壤中分离得到一株荧光假单胞菌，具有较好拮抗病原真菌的活性，在酸性（pH 5.2）条件下该菌株能够良好生长，还能产生嗜铁素等拮抗病原菌的活性代谢物；Zhang等［18］发现长期种植生姜的酸性根际土中也有许多假单胞菌类有益微生物，可以有效缓解土壤酸化导致的铝中毒和生姜青枯病的流行。为进一步挖掘具有缓解土壤酸化能力和生防功效的假单胞菌，通过原位培养从恩施烟区酸化植烟土壤中筛选得到一株荧光假单胞菌SSW-11（Pseudomonas fluorescens SSW-11），并采用盆栽试验和大田试验相结合的方法，评价该菌株对酸化植烟土壤的改良效果以及对烟草青枯病的影响，旨在为开发新型酸性土壤改良剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 酸性环境微生物菌株的筛选与鉴定

1.1.1 菌株的筛选

将采集于恩施烟区的酸化植烟土壤（pH 4.87～5.20）进行原位培养，具体方法［19］如下：将0.22 μm孔径的无菌混合纤维素酯膜置于40 μm孔径无菌细胞过滤器中，称取3 g 过2 mm 无菌筛的样品土并覆于膜上，用1.3 mL 的无菌双蒸水润湿土壤并混匀成土壤悬液。将制作好的上述装置倒扣入装有无菌双蒸水的培养皿中保湿，22 ℃培养7 d。培养结束后，用无菌镊子将纤维素酯膜置于装有5 mL无菌双蒸水的50 mL离心管中，涡旋振荡5 min，于28 ℃、180 r/min振荡培养2～3 h。取出纤维素酯膜，将菌液稀释涂布于LB 平板上，28 ℃培养24 h，挑取单菌落。将单菌落接入酸性LB 培养基（pH 5.0）中，28 ℃、180 r/min过夜振荡培养，然后以1%（体积分数）的接种量将该培养液接入含有1%（体积分数）甲基红指示剂的酸性LB培养基中，培养48 h后观察培养液颜色变化并测定pH。

1.1.2 菌株的鉴定

将筛选获得的菌株28 ℃培养24 h 后观察菌落形态和细胞形状。挑选单菌落接种于LB培养基中，28 ℃、180 r/min 过夜活化振荡培养。取培养液1 mL，12 000 r/min 离心5 min，弃上清液收集细胞。加入500 μL 无菌双蒸水重悬细胞，煮沸10 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为模板。使用通用引物（16SF：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA；16SR：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）扩增菌株的16S rDNA。PCR 反应体系为：ddH2O 6 μL，2 × Easy Taq PCR super Mix 10 μL，正、反向引物各1 μL，模板2 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30 个循环；72 ℃延伸10 min。将扩增产物纯化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，并在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，使用MEGA 5.2软件的邻接法构建系统发育树。

1.2 微生物菌株的效果评价

1.2.1 盆栽试验

1.2.1.1 盆栽试验概况

试验于2020 年4—7 月在湖北省武汉市华中农业大学微生物农药国家工程研究中心进行。供试土壤采集于湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩县椒园镇罗圈岩村，土壤类型为山地黄棕壤，土壤质地为壤土，pH为5.50～5.90；供试烤烟品种为云烟87；供试烟草专用复合肥［m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=8∶12∶24，磷酸一铵和碳酸氢铵等铵态氮60%，硝酸钾等硝态氮40%］购自湖北香青化肥有限公司。将供试土壤装于高10 cm、直径12 cm 的圆形塑料花盆，烟苗长至6 片真叶时移栽烟苗，每盆1 株。复合有机酸溶液为：苯甲酸180 mg/L、3-苯丙酸180 mg/L、延胡索酸180 mg/L 和琥珀酸84 mg/L。发酵培养基为LB 培养基。将保存的菌株平板划线培养，挑取单菌落，接入5 mL LB 培养基，于37 ℃过夜振荡培养，然后以1%（体积分数）的接种量将培养液接入LB培养基中，继续培养48 h获得菌株发酵液。

1.2.1.2 菌株对复合有机酸造成的土壤酸化的影响

烟苗移栽成活后，于第0、14和28 d灌施20 mL/株复合有机酸溶液。试验设对照组（CK）和处理组（SSW-11）2 个处理。第1 次灌施复合有机酸溶液后，处理组灌施20 mL/株菌株SSW-11 发酵液（稀释5倍），对照组灌施20 mL/株发酵培养基（稀释5倍）。

1.2.1.3 菌株对复合肥料造成的土壤酸化的影响

烟苗移栽成活后，于第0、14 和28 d 施用9.75 g/株烟草专用复合肥。试验设对照组（CK）和处理组（SSW-11）2 个处理。第1 次施用复合肥后，处理组灌施20 mL/株菌株SSW-11发酵液（稀释5倍），对照组灌施20 mL/株发酵培养基（稀释5倍）。

1.2.2 大田试验

试验于2021年4—10月在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩县椒园镇罗圈岩村四组进行。供试土壤类型和烤烟品种同盆栽试验。耕层土壤（0～20 cm）基本理化性质为：pH 4.47、有机质21.9 g/kg、碱解氮136.0 mg/kg、有效磷243.1 mg/kg和速效钾302.0 mg/kg。

采用随机区组设计，共设置2 个处理，对照组（CK）：当地常规施肥［施氮量为105 kg/hm2，施肥配比 为m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1 ∶1.2 ∶3］；处 理 组（SSW-11）：2 250 L/hm2菌株SSW-11发酵液+当地常规施肥］，3次重复，每小区5行，每行植烟12株，行距为1.20 m，株距为0.55 m。2021 年5 月1 日移栽，处理组于烟苗移栽后25 和45 d 灌施150 mL/株菌株SSW-11发酵液（稀释5倍），对照组灌施清水（150 mL/株）。其他栽培管理措施按当地常规方法进行。

1.3 样品采集

用五点法采集盆栽试验和大田试验土样。盆栽试验第1次处理后，每隔7 d采集一次0～5 cm土层土样，共采集8 次。大田试验第1 次处理后（移栽后25 d），每隔7 d 采集一次0～20 cm 根区土样，共采集7次；烟叶采收结束后采集根区土样。将采集的土壤样品充分混匀，然后自然风干、去杂、研磨和过筛，用于测定土壤pH、阳离子交换量、可交换酸度、可交换铝和可交换氢等指标。

1.4 分析方法

1.4.1 田间调查

参照YC/T 142—2010《烟草农艺性状调查测量方法》［20］测定成熟期烤烟株高、叶片数、茎围、最大叶面积等农艺性状；参照GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》［21］调查旺长期和成熟期烟草青枯病发生情况，计算发病率、病情指数和防治效果；参照GB 2635—1992《烤烟》［22］记录烤后烟叶各等级产量，计算单位面积均价、产量和产值等指标。

1.4.2 土壤化学性质分析

采用电位法测定土壤pH［23］；采用三氯化六氨合钴浸提-分光光度法测定土壤阳离子交换量［24］；采用氯化钾提取-滴定法测定土壤可交换酸度、可交换氢和可交换铝［25］含量。

1.5 数据处理

数据整理与分析采用Excel 2010 和DPS 15.10统计软件完成。

2 结果与分析

2.1 低pH环境微生物的筛选和鉴定

通过原位培养结合酸性LB培养基，从恩施烟区酸化植烟土壤中筛选得到一株能显著升高发酵液pH 的菌株SSW-11。从图1A 可见，含甲基红指示剂的酸性培养基显现红色，接入菌株SSW-11发酵培养后，培养基的pH 从5.00 上升到8.18，同时显现的红色消失。对菌株SSW-11进行形态学观察，发现其菌落边缘规整透明，菌落整体凸起，湿润易挑起，结晶紫染色后菌株整体呈椭球状（图1B）。由系统发育分析结果（图1C）可见，该菌株与荧光假单胞菌TJ3（Pseudomonas fluorescens TJ3）的遗传距离最近，聚于同一个分支。结合形态特征及分子生物学鉴定结果将菌株SSW-11鉴定为荧光假单胞菌。

图1 菌株SSW-11的筛选和鉴定Fig.1 Screening and identification of strain SSW-11

2.2 菌株SSW-11对酸化土壤pH的影响

2.2.1 盆栽试验结果

菌株SSW-11 发酵液对复合有机酸造成的土壤酸化的影响见图2A，对照组土壤pH随时间的变化曲线较为平缓，而处理组土壤pH随时间的变化曲线有升高趋势，并且在第14、28、35和49 d等多个时间点显著高于对照组，较对照组平均提高了0.18。菌株SSW-11发酵液对复合肥料造成的土壤酸化的影响见图2B，对照组和处理组土壤pH随时间的变化曲线均有下降趋势，处理组土壤pH在第14、21和28 d等多个时间点显著高于对照组，较对照组平均提高了0.18。盆栽试验的结果表明，菌株SSW-11发酵液对复合有机酸和复合肥料造成的土壤酸化有一定缓解效果。

图2 菌株SSW-11发酵液对盆栽土壤pH的影响Fig.2 Effects of strain SSW-11 fermentation broth on potting soil pH

2.2.2 大田试验结果

2.2.2.1 对旺长期酸化植烟土壤pH的影响

由图3可见，第一次灌施菌株SSW-11发酵液7 d后，处理组土壤pH随时间的变化曲线有一次明显的跃升，此后土壤pH随时间的变化曲线较为平缓，且处理组土壤pH在各个时间点均显著高于对照组，较对照组平均提高0.47。表明菌株SSW-11发酵液可显著提高烟株旺长期根区酸化土壤pH，且效果持续至灌施后42 d，可有效缓解大田植烟土壤酸化。

图3 菌株SSW-11发酵液对旺长期酸化植烟土壤pH的影响Fig.3 Effects of strain SSW-11 fermentation broth on pH of acidified tobacco-planting soil during fast growing stage

2.2.2.2 对烟叶采收结束后酸化植烟土壤pH相关指标的影响

由表1 可见，烟叶采收结束后，处理组可交换铝含量显著高于对照组，而可交换氢含量显著低于对照组，表明菌株SSW-11发酵液可显著减少酸化植烟土壤可交换氢含量。

表1 菌株SSW-11 发酵液对土壤酸碱度相关指标的影响①Tab.1 Effects of strain SSW-11 fermentation broth on soil pH related indexes

2.3 对烟草青枯病发生和烟株生长发育的影响

2.3.1 对烟草青枯病发生的影响

由表2 可见，在旺长期，处理组和对照组烟草青枯病的发病程度均较轻，且处理组发病率和病情指数均低于对照组，处理组对烟草青枯病的防效为22.21%。在成熟期，处理组和对照组烟草青枯病的发病程度均加重，但处理组发病率和病情指数均显著低于对照组，处理组对烟草青枯病的防效达52.01%。说明菌株SSW-11 发酵液对烟草青枯病防控效果较好。

表2 菌株SSW-11 发酵液对烟草青枯病的防效Tab.2 Control effects of strain SSW-11 fermentation broth on tobacco bacterial wilt

2.3.2 对成熟期烟株农艺性状的影响

由表3 可见，烟叶成熟期不同处理的株高、叶片数、茎围和中部叶叶面积等农艺性状差异不显著，但对照组上部叶叶面积显著高于处理组。

表3 成熟期烟株主要农艺性状Tab.3 Main agronomic traits of tobacco plants at mature stage

2.3.3 对烟叶经济性状的影响

从表4可见，处理组产量和产值均显著高于对照组，处理组的增产率和增值率分别为55.83%和59.22%，说明菌株SSW-11 发酵液可通过缓解植烟土壤酸化和对烟草青枯病的有效防控减少烟叶产量损失。

表4 菌株SSW-11 发酵液对烟叶经济性状的影响Tab.4 Effects of strain SSW-11 fermentation broth on economic characters of tobacco leaves

3 讨论

在盆栽试验中，菌株SSW-11发酵液处理组土壤pH在多个时间点显著高于对照组，较对照组平均提高0.18，且在大田试验中，菌株SSW-11 发酵液处理组土壤pH 显著高于对照组，较对照组平均提高0.47，说明菌株SSW-11可通过生物修复在一定程度上缓解复合有机酸和复合肥料造成的土壤酸化，这与赵倩等［26］报道的韩国假单胞菌CLP-7可提高酸化植烟土壤pH，改善酸化植烟土壤质量的结果相符。Panichikkal 等［27］和Wang 等［28］等研究发现假单胞菌具有分解利用植物根系分泌物中有机酸的能力，因此推测菌株SSW-11 缓解土壤酸化的原因可能是添加到土壤中的复合有机酸和复合肥料被该菌株分别作为碳源和氮源分解利用，从而减少了有机酸和氮的积累。

在旺长期和成熟期菌株SSW-11 发酵液对烟草青枯病有一定的防治效果，且在成熟期效果显著，处理组相对防效达52.01%，说明菌株SSW-11 可作为防控烟草青枯病的生防菌，这与Chandrasekaran等［29］报道的荧光假单胞菌对青枯雷尔氏菌引起的青枯病有显著的抑制效果，以及Suresh 等［30］发现的荧光假单胞菌对番茄青枯病具有良好防治效果的结果相符。推测菌株SSW-11 可能从以下4 个方面发挥生防功能：（1）青枯雷尔氏菌具有嗜酸性［31］，在酸化土壤中青枯病愈发严重，菌株SSW-11可通过缓解土壤酸化创造不利于青枯雷尔氏菌生存的环境；（2）由于多种有机酸类烟草根系分泌物能够作为化学信号物，诱导青枯病原菌的运动趋化活性，刺激生物膜的形成，促进烟草青枯病发生［26］，故菌株SSW-11 可通过分解利用有机酸类烟草根系分泌物，改善烟株微环境来抑制青枯病的发生；（3）菌株SSW-11 可通过较强的氨化作用将有机氮转化为铵态氮［32］，有助于烟株吸收利用氮素养料，促进烟株生长；（4）菌株SSW-11 还可通过产生抗生素和次生代谢物抑制青枯病病原菌。因此在酸化植烟土壤中灌施菌株SSW-11发酵液，通过减少有机酸和氮的积累缓解土壤酸化，创造适宜烟株正常生长而不利于青枯病等土传病害发生的土壤生态环境，可降低烟株发病率、减轻发病程度，提高烤后烟叶的产量和产值。

4 结论

从恩施烟区酸化植烟土壤中筛选获得一株荧光假单胞菌SSW-11，灌施该菌株发酵液可有效缓解有机酸和复合肥料造成的土壤酸化，提高烟株旺长期根区酸化土壤pH，显著降低烟草青枯病的发病率和病情指数，减少病害损失，增加烟叶产量和产值。