大黄鱼油提取工艺优化及品质分析

赵腾飞, 贺 苏, 王道飞, 李晚成, 应晓国, 马路凯, 邓尚贵

（1.浙江海洋大学食品与药学学院, 浙江 舟山 316022；2.湖北省十堰市农产品质量检验检测所, 湖北 十堰 442000；3.仲恺农业工程学院轻工食品学院, 广州 510225；4.广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室, 广州 510145）

鱼油含有丰富ω-3 不饱和脂肪酸[1, 2］, 尤其二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）含量较高。鱼油主要成分EPA、DHA、胆固醇以及甘油三脂能够控制人体血脂浓度, 提高人体高密度脂蛋白含量[3-6］, 预防心血管疾病及改善内分泌功能等[7-9］。二十碳五烯酸（EPA）被称为 “血管清道夫” , 它还具有疏导清理心脏血管、血栓的功能[10, 11］。鱼油中富含磷脂[12］、维生素等成分易被皮肤表层吸收, 增强皮肤光泽度, 缓解皮肤干燥, 抵抗微生物侵入[13, 14］。

刘汝萃等[15］研究发现, 鱼油能减少动脉硬化, 针对人体痛风、风湿性关节炎有缓解作用, 促进婴儿视网膜发育。付雪媛等[16］研究章鱼油中脂肪酸组成, 分析多种不饱和脂肪酸对人体健康的影响。目前, 消费者在加工鱼肉过程中, 舍去油脂较多部位, 但根据相关研究表明, 鱼油含丰富营养物质, 具有多种生理功能[17］。近年来, 随着居民生活水平不断提高, 人们对营养保健产品关注度日渐提升, 鱼油保健品便是其中之一, 另外鱼油成分还包括必需脂肪酸, 如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸。鱼油可以调节血脂, 改善视力, 维护视网膜功能[18］。张建等[19］利用祛除鱼鳞的方法增强皮肤恢复功能, 并观察皮肤吸收能力, 进而促进皮肤吸收、排泄及代谢功效。卫文[20］发现鱼油能改善皮肤炎症, 通过补充膳食鱼油降低大气颗粒物暴露导致皮肤炎症反应和氧化应激损失。刘海英[21］经过新一项临床试验数据表明当人体长期服用一定剂量omega-3 脂肪酸, 能够预防皮肤癌, 增强皮肤免疫力, 减轻阳光照射引起的免疫抑制作用, 因为omega-3 脂肪酸是一种能够防止皮肤癌的重要营养成分。

本研究以大黄鱼为原料, 研究不同有机溶剂提取大黄鱼油的差异, 分析得出最佳提取方法, 通过影响因素工艺条件的控制做进一步优化, 提高鱼油提取率, 并分析鱼油理化品质、细胞毒性、皮肤吸收性等指标, 为大黄鱼油资源开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：大黄鱼, 购自浙江舟山新城大洋世家渔业有限公司, 大黄鱼置于装有冰块超低温箱, 0.5 h 内运回实验室, -18 ℃储藏。

试剂：石油醚、正己烷、乙醇（分析纯, 国药集团化学试剂有限公司）；氮气（浙江舟山鸭蛋山先锋气体有限公司）。

1.2 仪器与设备

MDF-U53V 型冰箱, 日本Sanyo 公司；CF-16RN型高速冷冻多用途离心机, 日本日立公司；FJ200-S型数显高速均质机, 湖南力辰仪器科技有限公司；AR224-CN 型电子天平, 奥豪斯仪器上海有限公司；Soxtec FOSS 型脂肪提取器, 福斯分析有限公司；RE-2000A 型旋转蒸发仪, 上海亚荣生化仪器厂；HC-0520 型循环泵, 杭州惠创仪器设备有限公司；Vortex QL-861 型漩涡振荡器, 海门市其林贝尔仪器有限公司；HHS-21-4 型电热恒温水浴锅, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DSC-200F3 型差示扫描量热仪, 德国耐驰仪器公司；SM800 型酶标仪, 上海永创医疗器械有限公司；CM-5 型色度计, 日本柯尼卡美能达。

1.3 试验方法

1.3.1 大黄鱼鱼油提取工艺流程

新鲜大黄鱼→去除内脏→取腹部鱼肉→磁力搅拌→鱼糜量取→索氏抽提→旋蒸纯化→收集

1.3.2 单因素试验 根据初步试验的分析和资料查阅[22］, 以大黄鱼油提取率为结果, 其他操作条件保持一致, 研究提取温度、提取时间、溶剂体积3 个因素变量对鱼油提取率的影响。

1）提取温度对鱼油提取率的影响。以提取时间120 min, 溶剂体积40 mL 条件下, 分别设置温度60、70、80、90、100 ℃, 探究不同提取温度对鱼油提取率的影响, 确定最佳提取温度。

2）提取时间对鱼油提取率的影响。以提取温度70 ℃, 溶剂体积40 mL 条件下, 分别设置时间100、110、120、130、140 min, 探究不同提取时间对鱼油提取率的影响, 确定最佳提取时间。

3）溶剂体积对鱼油提取率的影响。以提取温度70 ℃, 时间120 min 条件下, 分别设置溶剂体积30、35、40、45、50 mL, 探究不同溶剂体积对鱼油提取率的影响, 确定最佳溶剂体积。

1.3.3 响应面试验设计 在单因素试验结果基础上, 采用Box-Behnken 8.0 响应面模型[23, 24］, 设定鱼油提取率为响应值, 分别用A、B、C表示提取温度变化量、时间变化量、溶剂体积添加量3 个自变量, 每个变量低、中、高水平以-1、0、1 编码, 中心组合设计的因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken 8.0 设计水平因素

1.3.4 指标测定

1）大黄鱼油提取。参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》, 称取8.00 g 鱼肉研磨置于滤纸, 索氏抽提法提取油脂[25］。

2）大黄鱼油脂肪酸测定。脂肪酸甲酯化及测定方法参考前期研究[26］。

3）大黄鱼油理化指标测定。酸价、过氧化值、茴香胺值分别参照GB 5009.228—2016、GB 5009.227—2016 和GB/T 24304—2009 测定；共轭二烯值测定参考文献[26］并略作修改, 称取油样0.010～0.020 g于小烧杯中, 5 mL 异辛烷溶解, 定容至50 mL, 波长232 nm 测其吸光度, 以异辛烷为调零组测定。

4）大黄鱼油角鲨烯含量测定。角鲨烯含量参考T/ZNZ 027—2020 气相色谱-串联质谱法测定。

5）大黄鱼油生育酚测定。参照方冰等[27］方法略作修改：称取0.5 g 油样于具塞试管, 加入0.125%抗坏血酸和5 mL 2 mol/L 氢氧化钾-乙醇溶液, 60 ℃皂化反应1 h, 待反应液冷却后, 加入5 mL 正己烷, 重复提取3 次后合并提取液, 有机相旋转蒸干, 甲醇定容10 mL, 经0.45 μm 微孔滤膜过滤, 滤液备用。

高效液相色谱条件：采用C18 色谱柱（5 μm, 4.6 mm×250 mm）, 填充平均粒径约为5 μm 二醇基硅胶柱, 柱温30 ℃, 甲醇为洗脱剂, 流速1 mL/min, 检测波长294 nm。

6）大黄鱼油甾醇测定。大黄鱼油中甾醇测定采用气相色谱-串联质谱联用仪, 具体方法[28］：精确称取5 mg 油样于具塞试管, 加入2 mg 5-α-胆甾烷-3-β 醇（胆甾烷醇）为内标, 加入2 mol/L 氢氧化钾-乙醇溶液2 mL, 摇匀超声5 min, 70 ℃皂化1 h, 皂化液冷却后, 加入4 mL 水和6 mL 正己烷, 漩涡振荡, 静置分层, 收集上清液。下层相5 mL 正己烷再次萃取, 合并有机层, 氮气吹干, 加400 μL 硅烷化试剂BSTFA:TMCS（99:1）, 70 ℃反应30 min, 1 mL 正己烷溶解, 取1 μL 上GC-MS 进样。

GC-MS 色谱条件：色谱柱TG-SQC（0.25 μm, 30 m×0.25 mm）, 载气为氢气, 流速36 cm/s, 分流比1:20, 电离方式EI, 电子能量70 eV, 离子源温度200 ℃, 检测器温度及进样口温度320 ℃, 柱温用程序升温方式, 以4 ℃/min 速度从240 ℃增加至255 ℃, 进样量1 μL。

7）大黄鱼油色差测定。参照朱建龙等[29］方法略有修改：色度计测定大黄鱼油颜色, 鱼油色差值以L*[黑（0）至白（100）］、a*[绿（-）至红（+）］、b*[蓝（-）至黄（+）］的颜色参数。

8）大黄鱼油热变性温度测定。DSC-200F3 型差示扫描量热仪测定大黄鱼油热变性温度, 准确称取10 mg 大黄鱼油放入坩埚中, 以空坩埚作为参比。样品经过设置参数, 起始温度20 ℃, 升温速率20 ℃/s, 终止温度210 ℃, DSC 配套软件分析大黄鱼油吸热峰所对应峰值温度。

9）大黄鱼油CSCP 细胞毒性试验。参照陈锐等[30］方法略作修改：使用CCK-8 试剂盒检测0.00%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.50%不同质量浓度鱼油细胞的存活率, 37 ℃培养4 h, 450 nm 波长处测定其OD。按下列公式进行：

式中,OD1为药物组OD值；OD2为空白对照组OD值；OD3为空白孔OD值。

10）大黄鱼油皮肤吸收值测定。测定大黄鱼油皮肤吸收值参考艾丽奇[31］方法略加修改。

1.3.5 数据处理 所有试验均平行测定3 次, 采用Origin 软件作图, 得到数据以 “平均值±标准差” 表示, SPSS 24.0 软件Duncan 分析数据, 多重比较得差异显著性分析结果（P＜0.05）, Design-Expert 8.0.6 软件分析响应面。

2 结果与分析

2.1 有机溶剂对大黄鱼油提取率的影响

4 种有机溶剂为提取剂, 按照提取温度70 ℃, 时间120 min, 有机溶剂体积40 mL 进行大黄鱼油提取, 结果如图1 所示。由图1 可知, 石油醚与正己烷+乙醇的混合液（3:1,v/v）提取鱼油率相当, 石油醚提取率为（31.26±1.04）%, 正己烷+乙醇（3:1,v/v）提取率为（31.27±1.09）%, 均无显著性差异（P＞0.05）。根据自动索氏抽提国标法, 选取石油醚提取鱼油具有便捷、快速、环保等优点。石油醚提取鱼油率为（31.26±1.04）%, 得到清澈且呈深黄色外观、强烈油脂气味, 并略带面包香味的鱼油。其次提取鱼油效果依次为正己烷提取率（25.27±1.09）%, 乙醇提取率（22.43±1.13）%, 乙醇得油率为4 种有机溶剂最低。有机溶剂提取率差异性可能源于各自相似相容原理[32］。因此从鱼油感官品质、色泽、风味综合考虑, 本试验按照国标法——石油醚的方法优化提取鱼油。

图1 有机溶剂对大黄鱼油提取率的影响

2.2 提取温度对鱼油提取率的影响

由图2 可知, 在70 ℃时鱼油提取率最高（30.10±0.94）%, 随着温度升高提油率显著降低, 当提取温度为100 ℃时, 鱼油提取率与70 ℃相比相差（4.64±0.32）%, 可能是油脂在高温会发生脂质氧化[33］, 产生其他小分子醛酮等杂质成分, 从而降低了鱼油提取率。因此综合考虑, 选取适宜提取温度为70 ℃。

图2 不同提取温度对鱼油提取率的影响

2.3 提取时间对鱼油提取率的影响

由图3 可知, 100～120 min 时鱼油提取率恒速上升, 这可能是由于在自动索氏抽提试验中, 随着提取时间延长, 鱼油分解速度较大且提油率提高。提取时间为120 min 时, 鱼油提取率达到最高（30.43±0.11）%, 显著高于提取时间130 min 时的鱼油提取率（P＜0.05）。可能是因为提取时间过长, 油脂发生氧化产生其他杂质成分导致鱼油量下降[34-36］。因此综合考虑, 选最佳提取时间120 min。

图3 不同提取时间对鱼油提取率的影响

2.4 溶剂体积对鱼油提取率的影响

由图4 可知, 溶剂体积30～40 mL 时, 鱼油提取率随溶剂体积增加而增加, 体积40 mL 时鱼油提取率最高为（30.79±0.37）%, 溶剂体积越大, 鱼油提取率越低, 这主要是因为鱼油浸出速率减缓, 提取成分减少, 导致鱼油提取率下降。因此, 选取适宜溶剂体积40 mL 做下一步试验条件要求。

图4 不同溶剂体积对鱼油提取率的影响

2.5 响应面试验结果分析

试验结果通过软件分析, 选取A（提取温度）、B（提取时间）、C（溶剂体积）3个因素, 试验结果见表2。

表2 响应面分析试验方案

用软件对上表中的数据进行分析, 方程为：

式中,Y为提取率,A、B、C分别为提取温度变化量、提取时间变化量、溶剂体积添加量。

提取率响应面方差分析结果如表3, 模型的P＜0.01, 说明该模型是极显著的。失拟项P=0.252 0＞0.05, 说明失拟项与纯误差之间的差异不显著, 可以应用该式。A、B、C、AC、A2、B2、C2影响均显著（P＜0.01）,AB、BC影响不显著（P＞0.05）。根据F大小, 得出3 个因素提取效果排序为：溶剂体积（C）＞提取时间（B）＞提取温度（A）。

表3 提取率响应面方差分析结果

2.6 回归模型的建立及分析

由响应面方差分析结果可知, 三个因素之间, 提取温度变化量和溶剂体积变化量对鱼油提取率交互作用较显著, 可视化分析如图5响应面及等高线所示。

由图5 可以得出, 曲线变化显著, 说明提取温度变化量和溶剂体积添加量对鱼油提取率影响大。等高线图呈椭圆形, 其提取率随着提取温度变化量和溶剂体积增加量而增大, 出现先增加后减少趋势, 因而存在极值, 且AC两因素的交互作用P=0.001 9, 显著性极强。由表3 可知,A因素的F值比C因素的F值小, 推断出提取温度变化量对鱼油提取率影响程度小于溶剂体积对提取率的影响程度, 与图5 形状符合。

图5 提取温度和溶剂体积对大黄鱼鱼油提取率的响应面及等高线

2.7 验证试验

采用响应面分析优化功能软件, 预测出鱼油提取率配额比例为：提取温度69.48 ℃, 提取时间121.26 min, 溶剂体积39.44 mL。此时, 得出鱼油提取率为（35.21±0.18）%。

为验证此配额可靠性, 设计优化试验, 将配方修改为提取温度70 ℃, 提取时间121 min, 溶剂体积40 mL。在优化条件下进行3 次平行试验, 如表4所示。

表4 最佳工艺验证结果

由表4 可知, 在最优工艺下得出的平均值为（35.18±0.88）%, 与响应面法软件算出最佳提取率值（35.21±0.18）%相近, 从而进一步证实了试验结果的可靠性。此时, 按照优化后配比进行试验, 得出鱼油色泽亮丽、富有浓厚油样香气味, 鱼油外观见图6。

图6 大黄鱼油

2.8 大黄鱼油基本理化、脂溶性指标检测结果

由表5 可知, 大黄鱼油酸价为（0.53±0.02）mg/g, 与姚仕彬等[37］测定鱼油0 d 酸价值（0.51±0.04）mg/g接近, 符合GB 5009.229—2016 酸价检测范围。大黄鱼油过氧化值（3.06±0.27）g/100 g 符合优质鱼油评判标准[38］, 它是衡量氢过氧化物的氧化产物[39］, 本试验过氧化值测定反映了鱼油氧化初期状态。大黄鱼油茴香胺值新鲜指标0.29±0.04, 测定茴香胺值含量主要利用2, 4-二烯醛量化油的二次氧化产物, 确定每种已经分解的氧化物质含量。大黄鱼油共轭二烯值21.84±0.34, 其反映鱼油所含共轭二烯数量以及判断鱼油氧化程度、分解物多少[40］。大黄鱼油中含有少量生育酚4.23 mg/100 g, 以α-生育酚为主, 其次β-生育酚为0.11 mg/100 g、γ-生育酚0.13 mg/100 g、δ-生育酚0.21 mg/100 g。大黄鱼油胆固醇含量367.58 mg/100 g, 有报道胆固醇过多会增加动脉粥样硬化等一系列疾病[41］, 而降低大黄鱼油胆固醇含量方法仍需进一步研究。此外大黄鱼油中还有角鲨烯含量37.53 mg/100 g, 角鲨烯在人体内可供给氧气, 净化血液, 改善酸性体质, 大黄鱼油中含有角鲨烯可以为人体健康发挥一定作用。

表5 大黄鱼油理化、脂溶性指标测定结果

2.9 大黄鱼油脂肪酸组成及含量检测结果

由表6 可知, 采用气相色谱-串联质谱联用仪检测鱼油脂肪酸含量, 大黄鱼油包含单不饱和脂肪酸3 种、多不饱和脂肪酸6 种、饱和脂肪酸5 种, 几种不同脂肪酸含量各不同, 其中单不饱和脂肪酸中油酸含量最高（31.04±0.12）%, 多不饱和脂肪酸中EPA（4.49±0.03）%, DHA（7.20±0.09）%, 必需脂肪酸亚油酸（12.20±0.04）%。刘迪[42］探究不同储存方法对鱼油氧化影响, 分析表明油酸性质稳定, 变化不显著。本试验大黄鱼油中油酸含量高, 说明大黄鱼油性质比较稳定。多不饱和脂肪酸（32.74±0.23）%, 对人体有降低胆固醇功效。魏岱岳等[43］分析了PUFA 对人体的作用, 它可以使人体胆固醇酯化, 降低血中胆固醇和甘油三酯, 提高脑细胞的活性及增强记忆力和思维能力。

表6 大黄鱼油脂肪酸组成

2.10 大黄鱼油色差结果

大黄鱼油新鲜期鱼油色差值如表7 所示。大黄鱼在新鲜期的L*为78.67±0.19,a*为-0.29±0.02,b*为1.98±0.04, 色差鲜艳, 蛋白成分充足, 在新鲜期最大程度上保留鱼油色差。

表7 大黄鱼油色差值

2.11 大黄鱼油热变性温度测定结果

大黄鱼油变性曲线如图7 所示, 鱼油在40～160 ℃时, 放热含量均不同, 而鱼油在121.60 ℃, 出现最高峰值, 此时鱼油变性温度释放热量最高2.50 mW/mg。

图7 大黄鱼油热变性温度

2.12 不同鱼油浓度对Caco-2 细胞存活率的影响

表8 试验数据表明, 随鱼油浓度增加, Caco-2 细胞存活率逐渐降低。添加浓度不高于0.30 mg/mL时, Caco-2 细胞的存活率＞90%, 鱼油添加浓度为0.40 mg/mL 时, 细胞存活率降低至（88.43±0.43）%, 出现明显下降趋势。因此鱼油浓度过高会影响细胞的存活率, 产生腐败菌[44］。

表8 不同鱼油浓度对Caco-2 细胞存活率的影响

2.13 大黄鱼油对皮肤吸收值的影响效果

鱼油富含对人体有益的不饱和脂肪酸、磷脂、维生素等成分, 容易被皮肤表层吸收, 增强皮肤光泽度, 缓解皮肤干燥, 抵抗微生物的侵入。根据表9 皮肤吸收值来判断鱼油对人体皮肤的吸收程度, 结果表明, 鱼油敷在皮肤上可以增强皮肤抵抗能力。鉴于吸收值随鱼油浓度增加先上开后有所下降趋势, 综合考虑使用鱼油在有效浓度范围内对人体皮肤是有益的。

表9 大黄鱼油对皮肤吸收值的影响

3 结论

通过单因素试验获得初步最佳溶剂提取方式, 即当提取温度70 ℃, 提取时间121 min, 溶剂体积40 mL 条件下提取率最高, 这3 个单因素对大黄鱼油提取率影响依次为溶剂体积＞提取时间＞提取温度, 此时, 所测鱼油酸价、过氧化值、茴香胺值、共轭二烯值均在国标限量范围内。α-生育酚含量为4.23 mg/100 g, β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚含量较少。角鲨烯含量为37.53 mg/100 g, 甾醇中胆固醇含量为367.58 mg/100 g, 富含丰富的必需脂肪酸, 必需脂肪酸亚油酸含量（12.20±0.04）%, 鱼油热变性温度121.60 ℃, 对皮肤无毒, 且可以促进皮肤的吸收能力, 增强皮肤光泽度, 缓解皮肤干燥。本试验通过优化大黄鱼油提取条件, 分析大黄鱼油理化品质, 目的是为大黄鱼精加工及开发高品质油脂奠定一定的理论基础。