乙醇冷凝回流与超声波辅助提取葛根药材总黄酮

曾建光, 徐雨生, 徐 翔, 余正勇, 金晨钟

（1.湖南人文科技学院农业与生物技术学院, 湖南 娄底 417000；2.湖南农业大学农学院, 长沙 410128；3.文山学院三七医药学院, 云南 文山 663000）

葛根（Pueraria edulis）又名葛藤、葛麻叶、粉葛藤等, 为豆科植物野葛或甘葛藤萝的块根, 其味甘、辛, 性平, 用于外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、眩晕头痛、中风偏瘫、胸痹心痛、酒毒伤中[1, 2］。葛根是一种药食同源类植物, 历来有 “千年人参” 之美称[3］, 具有很高的食用及药用价值。药理学研究表明, 葛根具有美容养颜、平稳血糖血压、保护心脏、预防骨质疏松等作用[4］。葛根的药用功能始载于《神农本草经》, 《名医别录》记载葛根粉可直接吞服或泡服, 还可以熬汤食用, 可用于治疗伤寒、中风、头痛解肌发表出汗, 开腠理, 疗金疮, 止痛和胁风痛叫, 其品质直接关系到公众药食的安全性及有效性[5, 6］。

目前, 工业中药生产和检测中常用的传统提取工艺（索式提取和回流提取等方法）, 具有提取时间长, 影响提出率, 且有的药材还因加热时间长, 某些有效成分受到破坏等[7, 8］。为克服传统方法的不足之处, 寻找对设备要求简单、操作简便的提取方法, 利用现代科学技术, 努力开发祖国的植物资源[9］。

本研究通过乙醇冷凝回流和超声波辅助2 种提取法, 对比分析了3 个不同产地葛根样品的总黄酮含量, 为后期葛根的规范化种植及其合理开发利用提供试验依据, 为葛根总黄酮质量标准的建立提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

KQ-300E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S2s 型恒温水浴锅（金坛市大地自动化仪器厂）；BSA224S 型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；UV-2600 型紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。芦丁（浓度≥98%, 北京世纪奥科生物技术有限公司, 生化试剂）；95%的乙醇溶液、无水乙醇溶液（湖北兴东城化工有限公司, 分析纯）；亚硝酸钠（NaNO2）（夏县运力化工有限公司, 分析纯）；硝酸铝[Al（NO3）3］（济南坤丰化工有限公司, 分析纯）；氢氧化钠（NaOH）（沧州彰化工产品有限公司, 分析纯）。

1.2 样品处理

以产自云南省、广东省、广西壮族自治区的野生葛根作为检测样本, 样品编号见表1。样本冲洗干净后带回, 再经去离子水反复冲洗数次, 置于预冻（-40.5 ℃）2 h、低温（-15 ℃）保持5 h、干燥（35 ℃）16.5 h、升华（15 ℃）8 h 的冻干机冻干。将冻干完全的葛根用粉粹机进行粉碎, 过3 号筛后装入不同编号的广口瓶中备用。

表1 样品来源

1.3 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品2 mg, 缓慢加入80%乙醇溶液溶解, 定容至50 mL 的具塞容量瓶中, 摇匀, 制备1 mL 含40 μg的对照品溶液。

1.4 波长的选择

用5 mL 的移液管吸取芦丁对照品溶液5 mL 转移至25 mL 具塞比色管中, 用0.5 mL 的移液管精密吸取0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液加入比色管中, 摇匀, 静置6 min, 用0.5 mL 的移液管精密吸取0.3 mL 10%的硝酸铝溶液加入其中, 摇匀, 静置6 min, 加入4.0 mL 4%的氢氧化钠溶液, 最后用80%乙醇溶液定容至10 mL, 塞上塞子将其混匀, 静置15 min。以不加芦丁对照品溶液的混合液为空白对照, 在波长为200～900 nm 的范围内扫描, 确定了最大吸收波长为476 nm[10］。

1.5 乙醇冷凝回流提取法提取

精密称取葛根干燥粉3 g 置于经过干热灭菌的具塞锥形瓶中, 用25 mL 的移液管精密加入80%乙醇溶液50 mL, 称定其样品锥形瓶溶剂的总重量, 分别用恒温水浴锅冷凝回流30、20、10 min, 放冷, 称重, 补足失重过滤后待用。

取1 mL 滤液到50 mL 具塞容量瓶中, 最后用80%乙醇溶液定容到刻度处, 盖上塞子摇匀。取5 mL供试品溶液至10 mL 具塞比色管中, 紫外分光光度计依次测定吸光度。

1.6 超声提取法提取

精密称取葛根干燥粉3 g 置于具塞锥形瓶中, 用移液管精密加入浓度为80%乙醇溶液50 mL, 称定其重量, 分别用超声波清洗器超声10、20、30 min, 放冷, 称重, 补足失重过滤后待用。

取1 mL 滤液到50 mL 具塞容量瓶中, 加入80%乙醇溶液到刻度处, 盖上塞子摇匀。摇匀后精密量取供试品溶液5 mL, 置于10 mL 具塞比色管中[11］, 紫外分光光度计依次测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 线性试验结果

在波长476 nm 处检测对照品溶液的吸光度, 测定结果见表2。以对照品吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标, 绘制标准曲线见图1。芦丁回归方程为A=0.352 7C+0.005 4（R2=0.998 9）, 葛根总黄酮对照品浓度在0.4～2.4 μg/mL 符合Beer 定律[12］, 吸光度与浓度呈良好的线性关系。

图1 芦丁对照品标准曲线

表2 线性试验结果

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 精密量取总黄酮对照品溶液制备显色液, 重复测定6 次, 其相对标准差结果见表3。从表3 可以看出,RSD为0.02%, 表明试验精密度良好。

表3 精密度试验结果

2.2.2 重复性试验 精密称取3.000 0 g 云南省葛根粉末6 份制备供试品溶液, 并分别在467 nm 波长下测定显色后的吸光度, 根据标准曲线计算总黄酮含量平均值及RSD, 结果见表4。从表4 可以看出,RSD为0.07%, 表明试验重复性良好。

表4 重复性试验结果

2.3 冷凝回流提取法提取不同产地、不同时间葛根总黄酮

分别称取云南省、广东省、广西壮族自治区不同地方葛根粉各3.000 0 g 置于锥形瓶中, 加入适量乙醇溶解后进行冷凝回流, 结果见表5。并对不同产地样品总黄酮含量进行比较, 结果见表6、图2。云南省葛根总黄酮提取最佳时间20 min, 黄酮含量为0.255 7%；广东省葛根总黄酮提取最佳时间30 min, 黄酮含量为0.210 8%；广西壮族自治区葛根提取最佳时间10 min, 总黄酮含量为0.213 2%；不同产地总黄酮含量：云南省＞广西壮族自治区＞广东省。

图2 不同产地葛根冷凝回流提取黄酮含量对比

表5 不同产地葛根冷凝回流测定试验

表6 不同产地、不同时间冷凝提取总黄酮含量

2.4 超声波辅助提取葛根总黄酮

分别称取云南省、广东省、广西壮族自治区不同地方葛根粉3.000 0 g 于锥形瓶中, 加入适量乙醇溶解后进行超声波辅助提取（表7）。并对不同产地葛根样品总黄酮含量进行比较, 各样品的总黄酮含量见表8、图3。云南省葛根总黄酮提取最佳时间20 min, 黄酮含量为0.171 5%；广东省葛根总黄酮提取最佳时间30 min, 黄酮含量为0.155 9%；广西壮族自治区葛根提取最佳时间30 min, 总黄酮含量为0.204 6%, 不同地区总黄酮含量：云南省＞广西壮族自治区＞广东省。

表7 不同产地葛根总黄酮超声波辅助提取试验

表8 不同产地、不同时间葛根总黄酮的含量测定

图3 不同产地葛根超声波辅助提取黄酮含量对比

3 小结与讨论

近年来, 通过检测药材中成分含量来确定被测药材中成分的数量, 比较不同仪器提取成分含量评价药物质量[13］。冷凝回流提取法提取工艺是指用有机溶剂提取药材中的成分[14］, 将葛根药材粗粉装入容器中, 加适量的溶剂, 安装冷凝装置用恒温水浴锅进行提取, 回流浸提到规定的时间, 将回流液进行过滤, 得其滤液, 再进行相应的检测。与超声波提取法相比, 冷凝回流提取方法具有受外界温度、压力影响小, 不受气液比的影响, 回收效果稳定, 直接回收到有机液体, 无二次污染且、操作方便等优点[15］。

通过紫外分光光度法对云南省、广东省、广西壮族自治区不同产地葛根进行总黄酮含量测定。云南省总黄酮平均含量为0.257 7%；广东省葛根总黄酮平均含量为0.210 8%；广西壮族自治区总黄酮平均含量为0.213 2%, 葛根总黄酮含量云南省＞广西壮族自治区＞广东省。

综上所述, 通过比较超声波辅助提取和冷凝回流提取葛根总黄酮, 得出较科学、较简便的提取方法, 为提取葛根总黄酮的提供参考方法依据。同时对比分析了云南省、广东省、广西壮族自治区3 个不同地方葛根总黄酮含量测定结果, 为后期葛根的规范化种植及合理开发利用提供了依据, 为葛根总黄酮质量标准的建立提供一定的参考价值。