岩黄连栓微生物限度检查方法的适用性试验

庞云娟, 庞兰英, 曾 金, 刘康连, 梁晓玲, 龙文洲, 肖 萍

（1.玉林市食品药品检验检测中心/玉林市中药材（含香辛料）质量监测与评价工程技术研究中心, 广西 玉林 537000；2.柳州市妇幼保健院, 广西 柳州 545001）

岩黄连栓是柳州市妇幼保健院的制剂方, 具有抗炎、镇痛等作用[1］, 常用于慢性盆腔炎的治疗[2］, 为慢性盆腔炎治疗提供中医药的诊疗方案。岩黄连栓的主药成分是岩黄连（Corydalis saxicolaBunting）提取物, 岩黄连为罂粟科紫堇属植物石生黄堇的全草及肥大的根茎部, 是广西壮族自治区重要的特色壮药材之一[3, 4］。岩黄连全草性苦、凉, 其活性成分为岩黄连总生物碱[5］, 具有抗菌、消炎、止痛、抗肿瘤、增强免疫功能等作用[6］。岩黄连栓的辅料组成是混合脂肪酸甘油酯（38 M）[7］（熔点在35～37 ℃）、混合脂肪酸甘油酯（38H）[8］（熔点在37～39 ℃）、羊毛脂[9］（熔点在36～42 ℃）、液体石蜡、吐温-80。岩黄连栓是不含药材原粉的半固体直肠给药制剂, 其微生物限度标准为需氧菌总数103CFU/g、霉菌和酵母菌总数102CFU/g、不得检出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌（1 g）[10］。

本研究结合岩黄连提取物的抑菌作用[11, 12］、辅料熔点影响溶解的问题以及其微生物限度的规定, 按照《中国药典》2020 年版的要求, 优选出科学、合理、便于操作的微生物限度检查方法。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003］、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001］、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501］、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003］, 均从广东环凯微生物科技有限公司购买西林瓶冻干粉菌种, 按照菌种说明书进行复活传代并制备成甘油冻存管在超低温冰箱保存（第2代）。

1.2 培养基与试剂

胰酪大豆胨液体培养基（Trypticase soy broth, TSB）、沙氏葡萄糖液体培养基（Sabouraud dextrose broth, SDB）、胰酪大豆胨琼脂培养基（Soybean-casecin digest agar, TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（Sabouraud dextrose agar, SDA）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（Mannitol salt agar）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基基础（Cetrimide agar medium base）, 均为北京陆桥技术有限责任公司生产；氯化钠（分析纯）, 丙三醇（分析纯）, 均为广东光华科技股份有限公司生产；吐温-80（分析纯）, 为天津市大茂化学试剂厂生产。

1.3 仪器

LRH-150-M 型霉菌培养箱（广东省医疗器械厂）, SPX-150F-Ⅱ型生化培养箱（上海龙跃仪器有限公司）, BHC-1300HA2 型生物安全柜（苏州安春游空气技术有限公司）, SQ810C 型立式压力蒸汽灭菌器（雅马拓科技贸易有限公司）, EK-1200i 型电子天平（日本岛津公司）, SHZ-88 型水浴恒温振荡器（江苏金怡仪器科技有限公司）, 微生物培养箱（德国宾得公司）, HTY-310 型微生物检验仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）, S25 型圆周振荡器（德国IKA公司）, Easypet 3 电动助吸器、移液器（德国Eppendorf公司）等。

1.4 试验样品

岩黄连栓（批号：20020701、20020702、20020703、20060301、20060302、20060303、200712, 柳州市妇幼保健院）。常温下为半固体直肠栓剂, 其中批号20020701、20020702、20020703 是2020 年2 月7 日生产, 批号20060301、20060302、20060303 是2020 年6月3 日生产, 批号200712 是2020 年7 月12 日生产。

1.5 方法

1.5.1 菌悬液的制备 按照《中国药典》2020 年版四部关于菌种的培养制备要求[10］, 并参考菌悬液制备方法进行制备[13］, 从超低温冰箱取出甘油冻存管菌种解冻至室温, 分别取200 μL 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的甘油冻存管菌液接种至10 mL TSB 肉汤试管, 33 ℃振摇培养24 h；取200 μL 白色念珠菌的甘油冻存管菌液接种至10 mL SDB 肉汤试管, 23 ℃振摇培养48 h；取1 000 μL 黑曲霉的甘油冻存管菌液接种至200 mL SDA 琼脂大斜面, 23 ℃培养7 d, 用5 mL 灭菌生理盐水洗下孢子, 吸出孢子悬液至无菌试管[14］。将上述肉汤试管和黑曲霉孢子菌悬液试管放置2～8 ℃保存, 作为工作用菌液, 试验前逐级稀释计数。

1.5.2 供试液的制备 供试品溶液的制备[15, 16］：取样品10 g, 加至90 mL 稀释液中, 置45 ℃水浴振摇15 min, 作为1:10 的供试液。用稀释液依次稀释成1:20、1:50、1:100、1:200 的供试液, 并置于45 ℃备用。稀释液和冲洗液：0.9%氯化钠溶液（即灭菌生理盐水）, 置于45 ℃保温备用。

1.5.3 微生物计数法的适用性试验

1）平皿倾注法预试验。

①试验组[17］：取已灭菌的试管, 每管分别分装10 mL 1:10、1:20、1:50、1:100、1:200 的供试液, 分别加入0.1 mL 的金黄色葡萄球菌菌悬液（含菌量不超过10 000 CFU/mL）或白色念珠菌菌悬液（含菌量不超过10 000 CFU/mL）, 充分摇匀, 平行注2 皿, 并浇注相应的培养基。

②菌液组[18］：取已灭菌的试管, 每管分装10 mL灭菌生理盐水, 加入0.1 mL 的金黄色葡萄球菌菌悬液（含菌量不超过10 000 CFU/mL）或白色念珠菌菌悬液（含菌量不超过10 000 CFU/mL）, 充分摇匀, 平行注2 皿, 并浇注相应的培养基。

③供试品对照组：除不加入菌液, 操作同试验组。

2）薄膜过滤贴膜法预试验。

①试验组[19］：取已灭菌的薄膜过滤器, 每个滤器先加入20 mL 保温的稀释液润湿滤膜[20, 21］, 分别加入1 mL 1:100 供试液, 再分别加入1 mL 金黄色葡萄球菌菌悬液（含菌量不超过100 CFU/mL）, 抽滤, 滤干后, 取膜贴种于提前准备好的琼脂培养基平板。

②菌液组：取已灭菌的薄膜过滤器, 每个滤器先加入20 mL 保温的稀释液润湿滤膜, 分别加入1 mL稀释液, 再分别加入1 mL 金黄色葡萄球菌菌悬液（含菌量不超过100 CFU/mL）, 抽滤, 滤干后, 取膜贴种于提前准备好的琼脂培养基平板。

③供试品对照组：除不加入菌液, 操作同试验组。

需氧菌总数计数用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）, 霉菌和酵母菌总数计数用沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）。胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）于33 ℃培养, 其中枯草芽孢杆菌试验组、薄膜过滤贴膜的铜绿假单胞菌试验组培养18～24 h, 黑曲霉试验组培养3 d, 白色念珠菌试验组培养3～5 d, 其他细菌试验组培养不超过3 d；沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）于23 ℃培养, 其中黑曲霉试验组培养3 d, 白色念珠菌试验组培养5 d[22］。

结果判断：试验组菌落数减去供试品对照组的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2.0 范围内[23, 24］。

1.5.4 控制菌检查方法的适用性试验

1）金黄色葡萄球菌检查预试验。分别取1:10供试液10 mL 分别接种至100、200、500、1 000 mL TSB 培养基中, 加入不大于100 CFU 的金黄色葡萄球菌, 33 ℃培养18～24 h, 划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板, 33 ℃培养18～72 h, 观察平板的菌落形态[25, 26］。

2）铜绿假单胞菌检查预试验。分别取1:10 供试液10 mL 分别接种至100、200 mL TSB 培养基中, 加入不大于100 CFU 的铜绿假单胞菌, 33 ℃培养18～24 h, 划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板, 33 ℃培养18～72 h, 观察平板的菌落形态[27-29］。

2 结果与分析

2.1 微生物计数法的适用性试验

2.1.1 需氧菌总数计数方法预试验结果 平皿倾注法加金黄色葡萄球菌预试验结果见表1, 薄膜过滤贴膜法加金黄色葡萄球菌预试验结果见表2。岩黄连栓对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用, 1:200供试品溶液稀释平皿倾注法、1:100 供试品溶液稀释薄膜过滤贴膜法能够消除供试品溶液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。由于受样品处方组分的影响, 薄膜过滤贴膜法的冲洗液要维持在40～45 ℃才能确保不堵膜, 需要较长的保温空间, 采用1:200 供试品溶液稀释平皿倾注法, 操作更为简单方便。

表1 平皿倾注法加金黄色葡萄球菌回收预试验结果

表2 薄膜过滤贴膜法加金黄色葡萄球菌回收预试验结果

2.1.2 霉菌和酵母菌总数计数方法试验结果 平皿倾注法加白色念珠菌预试验结果见表3。1:10 供试液试验组中白色念珠菌回收比值在0.5～2.0 范围内, 表明岩黄连栓对白色念珠菌没有抑制作用, 采用该方法进行霉菌及酵母菌总数计数是可行的。

表3 平皿倾注法加白色念珠菌回收预试验结果

2.2 控制菌检查方法的试验结果

各试验组分别在甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上划线分离培养, 结果见表4。岩黄连栓对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用, 采用1 000 mL 增菌液接种法检查岩黄连栓中的金黄色葡萄球菌, 采用100 mL 增菌液接种法检查岩黄连栓的铜绿假单胞菌是可行的。

表4 控制菌检查预试验结果

2.3 微生物计数法适用性试验验证结果

取7 个批号的岩黄连栓样品, 需氧菌总数按1:200 供试品溶液稀释平皿倾注法、霉菌及酵母菌总数按常规1:10 平皿倾注法进行加菌回收试验, 结果见表5。结果表明, 采用1:200 供试品溶液稀释平皿倾注法对岩黄连栓进行需氧菌总数的测定, 5 种试验菌回收比值均在0.5～2.0 范围内；采用常规1:10平皿倾注法对霉菌及酵母菌总数进行测定, 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）规定的2 种试验菌回收比值均在0.5～2.0 范围内, 均符合《中国药典》2020 年版四部1105（非无菌产品微生物：微生物计数法）的规定, 该方法可行。

表5 微生物计数方法验证试验的回收比值

2.4 控制菌检查方法的验证

取7 个批号的岩黄连栓样品, 金黄色葡萄球菌按照1 000 mL 增菌液接种法进行加菌验证试验、铜绿假单胞菌按照100 mL 增菌液接种法进行加菌验证试验, 结果见表6。结果表明, 采用1 000 mL 增菌液接种法对岩黄连栓的金黄色葡萄球菌的测定进行加菌验证试验, 采用100 mL 增菌液接种对岩黄连栓的铜绿假单胞菌的测定进行加菌验证试验, 符合《中国药典》2020 年版四部1106（非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法）的有关规定, 该方法可行。

表6 岩黄连栓控制菌检查方法验证试验结果

2.5 岩黄连栓的微生物限度检查结果

采用1:200 供试品溶液稀释平皿倾注法进行需氧菌总数测定, 采用常规1:10 平皿倾注法对霉菌及酵母菌总数进行测定, 采用1 000 mL 增菌液接种法检查金黄色葡萄球菌, 采用100 mL 增菌液接种法检查铜绿假单胞菌, 结果见表7。

表7 岩黄连栓的微生物限度检查结果

3 小结与讨论

本研究建立的岩黄连栓微生物限度检查方法科学有效、操作方便, 为有抑菌作用且部分处方组分的熔点在35～42 ℃的栓剂提供供试品溶液制备和适用性试验的方法参考。本研究对7 个批号的岩黄连栓同步进行金黄色葡萄球菌加菌回收预试验研究, 缩短整个适用性试验研究的时间, 提高了工作效率。岩黄连栓是医院制剂, 医院制剂通常产量较小, 批号之间有时存在一定的差异。对产量较小的制剂, 验证样品尽量多一些批号, 能较大程度避免由于批号差异导致的方法不适用的问题, 通过多批次的样品同步试验, 提前发现批号差异并反馈给医院制剂室, 助推医院制剂工艺稳定发展。