HD-BioP3 细胞电转染条件的优化

2023-03-18 01:53王亚萍宋路萍邢体坤李静波张静静通信作者
医疗装备 2023年4期
关键词:活率常温缓冲液

王亚萍,宋路萍,邢体坤,李静波,张静静(通信作者)

河南晟明生物技术研究院有限公司 (河南新乡 453500)

电转染主要通过物理电流击穿细胞膜形成瞬时孔隙,目的基因通过孔隙进入细胞[1],这种方法具有操作简便、毒性小、电转染效率较高等优点,其转染效率通常在30%~90%之间[2-4]。电转染在克隆操作以及表达中具有重要作用,因此,提升基因电转染效率是当前基因工作研究人员关注的重点问题[5]。电转染效率受很多因素的影响,包括电转染缓冲液[6-8]、电转染程序[9-11]、细胞数量[12]、电转染质粒量[13-15]、电转染前后温度[16]等。不同的细胞系有不同的最佳电转染条件[17]。哺乳动物细胞的电转染通常在磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、PBS+蔗糖或培养基中进行[18-19]。本研究分析电转染缓冲液、电转染温度和电转染质粒量3 个因素对细胞活率及电转染效率的影响,从而确定HD-BioP3 细胞的最佳电转染条件。

1 材料与仪器

1.1 材料

HD-BioP3 细胞购自Horizon 公司;GFP 质粒购自Lonza 公司;EX-CELL®CD CHO Fusion 培养基、L-Glutamine solution、蔗糖购自默克公司;CD Forti CHOTM培养基、PBS 购自赛默飞世尔科技公司;0.2%台盼蓝溶液购自Countstar 公司。

1.2 仪器

电穿孔系统(品牌:Bio-Rad 伯乐,型号:Gene Pulser Xcell,用于转染每种细胞类型的模块化电穿孔系统);叠加式恒温振荡器(品牌:精骐,型号:IS-RDS6C,带CO2);二氧化碳培养箱(品牌:Heal Force,型号:HF90);洁净工作台(品牌:苏净安泰,型号:SW-CJ-2FD);电热恒温水浴锅(品牌:上海一恒,型号:HWS-28);全自动荧光细胞分析仪(品牌:Countstar,型号:Rigel S2);离心机(品牌:Eppendorf,型号:5804R)。

2 实验方法

2.1 HD-BioP3细胞电转染优化前准备

37 ℃水浴复苏一支HD-BioP3 细胞,待细胞生长至1.5×106~4.0×106cells/ml 时,按0.2×106cells/ml 接种至生长培养基(含4 mmol/L L-Glutamine solution的CD Forti CHOTM培养基)中;电转染前一天将细胞以0.5×106cells/ml 接种至生长培养基中培养(培养条件:转速为120 rpm,二氧化碳浓度为5%,温度为37 ℃,振幅为26 mm),24 h 后用于电转染优化。

2.2 HD-BioP3细胞电转染优化

2.2.1 HD-BioP3细胞电转染缓冲液和电转染温度优化

准备PBS、PBS+5%蔗糖、EX-CELL®CD CHO Fusion 培养基、CD Forti CHOTM培养基4 种介质作为电转染缓冲液并分别标记为Buffer1~Buffer4 备用;取2.1 中准备的细胞,将0.2%台盼蓝溶液与细胞悬液按照1‥1 比例混合,采用全自动荧光细胞分析仪对细胞进行计数;根据计数结果取5×106个细胞,以220 rcf 速度离心5 min,弃上清液;取电转染缓冲液 600 μl 重悬细胞,再加入20 μg GFP 质粒,轻轻吹打混匀细胞和质粒转入电击杯,按上述步骤,Buffer1~Buffer4 各做两组,一组于常温条件下进行电击,另一组于4 ℃条件下放置5 min 后进行电击。电击参数设置如下,电压为300 V,电容为950 μF,脉冲为指数衰减,将电击后的细胞迅速转至含预热后的5 ml 生长培养基的T25 方瓶中,温度为37 ℃,二氧化碳浓度为5%,湿化过夜培养。

2.2.2 HD-BioP3细胞电转染质粒量优化

根据2.2.1 选择合适的电转染缓冲液和电转染温度,在10~100 μg 之间设置10 个梯度的电转染质粒量进行最佳电转染质粒量的优化,电击参数设置如下,电压为300 V,电容为950 μF,脉冲为指数衰减,将电击后的细胞迅速转到含预热后的5 ml 生长培养基的T25 方瓶中,温度为37 ℃,二氧化碳浓度为5%,湿化过夜培养。

2.3 分析方法

HD-BioP3 细胞电转染优化24 h 后,用0.2%台盼蓝溶液与细胞悬液按照1‥1 比例混合,采用全自动荧光细胞分析仪对细胞进行电转染效率检测及计数。

3 结果分析

3.1 HD-BioP3细胞电转染缓冲液和电转染温度优化结果分析

电转染效率检测结果显示,在常温条件下Buffer1~Buffer4的细胞电转染效率依次为8.4%、18.8%、48.8%、22.4%,在4 ℃条件下Buffer1~Buffer4 的细胞电转染效率依次为20.9%、25.2%、67.3%、15.7%;Buffer1 在常温和4 ℃条件下的细胞电转染效率相差12.5%,依次类推,Buffer1~Buffer4 在常温和4 ℃条件下的细胞电转染效率相差在6.4%~18.5%之间;在同一温度下,4 种电转缓冲液的电转染效率差距较大,在常温条件下,Buffer2 和Buffer4 的细胞电转染效率相差3.6%,而Buffer3 和Buffer1 的细胞电转染效率相差40.4%,因此在常温条件下细胞电转染效率相差3.6%~40.4%,依此类推,在4 ℃条件下细胞电转染效率相差4.3%~51.6%(图1~4)。

图1 在常温条件下HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率

图2 在4 ℃条件下HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率

HD-BioP3 细胞电转染优化24 h 后,结果显示,在常温条件下,Buffer1 和Buffer3 细胞活率均>80%,Buffer4 细胞活率<60%(图3);在4 ℃条件下Buffer3 细胞活率>80%,Buffer1 和Buffer4 细胞活率<60%(图4)。

图3 常温条件下HD-BioP3细胞在电转缓冲液Buffer1~Buffer4中细胞活率和电转染效率

图4 在4 ℃条件下HD-BioP3细胞在电转缓冲液Buffer1~Buffer4中细胞活率和电转染效率

3.2 HD-BioP3细胞电转染质粒量测试

根据3.1 选择细胞转染效率和细胞活率均最高的实验条件,即选择Buffer3 作为电转染缓冲液在4 ℃条件下进行电转染质粒量优化,结果显示,随着电转染质粒量的增加,细胞活率呈逐渐下降,10~30 μg 电转染质粒量细胞活率>70%,40~70 μg 电转染质粒量细胞活率在60%~65%之间,80~100 μg 电转染质粒量细胞活率均<50%。随着电转染质粒量的增加,电转染效率逐渐升高;电转染质粒量为30 μg 时电转染效率达到平台期,电转染质粒量>70 μg 时电转染效率出现下降趋势,电转染质粒量不同造成电转染效率最大相差24.6%(图5~7)。

图5 HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率

图6 HD-BioP3细胞电转染24 h 后电转染效率

图7 HD-BioP3细胞不同电转染质粒量细胞活率和电转染效率

4 讨论

电转染是一种常用的细胞转染方法[20],目的基因能否进行表达,取决于表达目的基因能否成功进入细胞[21];这种电转染方式虽然操作简单,电转染效率高,但不合适的电转染条件容易导致细胞无法形成电穿孔或死亡,造成电转染效率下降[22]。

本研究结果显示,在测试3 个因素对电转效率的影响实验中,不同电转染缓冲液对电转染效率影响最大相差51.6%,其次为不同电转染质粒量,电转质粒量对电转染效率影响最大相差24.6%,电转染温度影响较小,不同电转染温度对电转染效率影响最大相差18.5%。故在EX-CELL®CD CHO Fusion 作为电转染缓冲液、电转染温度为4 ℃、电转染质粒量为30 μg 的条件下,电转染效果最好。

综上所述,优化HD-BioP3 细胞的电转染条件,可为研究外源基因电转染HD-BioP3 细胞提供基础数据。

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