基于指纹图谱对金银花与山银花的区分及各品种金银花质量评价

齐大明，董诚明, 2*，刘天亮，高启国，杨林林，侯文川

基于指纹图谱对金银花与山银花的区分及各品种金银花质量评价

齐大明1，董诚明1, 2*，刘天亮1，高启国3，杨林林1，侯文川1

1. 河南中医药大学，河南 郑州 450046 2. 呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南 郑州 450046 3. 河南太龙药业股份有限公司，河南 郑州 450001

建立金银花和山银花指纹图谱，对河南封丘金银花与湖南不同基原山银花进行区别比较，并对封丘不同品种金银花进行质量评价。利用HPLC法构建金银花和山银花药材的指纹图谱；利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行相似度评价、以“SIMCA13.0”软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）分析；通过HPLC法测定河南封丘不同品种金银花成分含量。河南封丘产金银花相似度均在0.95以上，湖南各基原山银花相似度在0.97以上，金银花和山银花相似度在0.57～0.79，豫金二号与金银花及山银花药材相似度均在0.6以下，共有多成分PCA分析也能显著区分金银花和山银花。金银花各品种中北花1号酚酸类以绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C之和为5.1%，比其他品种高约15%；木犀草苷豫金1号含0.062%、北花1号0.064%，比四季花高约25%、比羊角花高约50%。该化学指纹图谱方法能显著区分金银花和山银花，二者间的化学成分差异亦能为金银花指标性成分的选择提供参考。金银花不同栽培品种成分含量差异明显，豫金1号和北花1号药材质量较优，是具有进一步开发利用的潜在优质种质资源。

金银花；品种；山银花；HPLC指纹图谱；质量评价；绿原酸；异绿原酸A；异绿原酸C；质量标志物

金银花是忍冬科植物忍冬Thunb.的花蕾或带初开的花。山银花为灰毡毛忍冬Hand.-Mazz.、红腺忍冬Miq.、华南忍冬DC.或黄褐毛忍冬Hsu et S. C. Cheng的干燥花蕾或带初开的花。自《中国药典》2005年版起，金银花与山银花分开单列。

中药材质量及临床疗效的物质基础是化学成分[1]，化学成分种类及含量的差异会造成疗效的差异。中药材多靶点、多成分的整体性表明以某一种或者几种化学成分来判定品质优劣是不科学的[2]。中药化学指纹图谱是一种能够全面体现化学成分的方法，能够全面清晰地表现出中药材成分种类差异及成分间的量比关系。现有金银花及山银花化学指纹图谱区别的研究[3]。

遗传物质对中药材品质影响巨大，种质种源是遗传物质的体现，遗传物质是药用植物品种的内在特性，它决定了中药品种的基本品质[4]。种质种源对中药材规范化种植意义重大，优质种源是药材品质及临床疗效的基本保证[5]。金银花种质资源丰富、栽培品种繁多，且各品种间成分含量差异明显[6]。金银花品种间质量评价对金银花的品种改良、生产实践和引种等均具有重要意义[7]。

本课题组建立金银花和山银花的指纹图谱，全面比较金银花与山银花二者间成分种类及含量的差异，为金银花及山银花的鉴别及成分差异研究提供依据。也能为金银花的质量标志物研究提供部分参考。此外课题组还对当前河南封丘具有一定栽培面积的各忍冬栽培品种进行质量评价，为金银花的优质育种和金银花规范化种植基地选种提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司），IMS105DU型半微量天平（瑞士梅特勒-托利多集团），KQ-500DV型超声波清洗机（昆山市超声波清洗器）等。

1.2 材料

绿原酸（批号140322），中国食品药品检定研究院；香豆酸（批号wkq17110212）、芦丁（批号wkq16101104）、新绿原酸（批号wkq18030107）、獐牙菜苷（批号wkq18042610）、异绿原酸A（批号wkq18041207）、异绿原酸C（批号wkq18050905）、异绿原酸 B（批号wkq19012301）均购于维克奇生物科技有限公司；断马钱子酸（批号DST190719-136）、异槲皮苷（批号DST191012- 006）、忍冬苷（批号DST190708-048）均购于德思特生物科技有限公司；幼枝含断氧化马钱子苷（批号P27N8L49194）、木犀草苷（批号Y26A9H59973）均购于源叶生物科技有限公司；咖啡酸（批号MUST-16060613）、莫诺苷（批号MUST-15102911)均购于成都曼斯特生物科技有限公司。所用对照品质量分数均≥98%。色谱甲酸（北京迈瑞达公司），色谱甲醇、色谱乙腈（Fisher Scientific公司），甲醇（分析纯，天津富宇公司），超纯水等。

供试样品经由河南中医药大学生药学科董诚明教授鉴定，样品1～4为忍冬科植物忍冬Thunb.，5为忍冬变种（不做药用），6～7为红腺忍冬Miq.，8为华南忍冬DC.，9为灰毡毛忍冬Hand.-Mazz.。信息详见表1。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件 以Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱：0～10 min，8%～9% A；10～15 min，9% A；15～20 min，9%～10% A；20～25 min，10%～11% A；25～30 min，11%～14% A；30～50 min，14%～16% A；50～60 min，16%～20% A；60～65 min，20%～22% A；65～70 min，22%～24% A；70～80 min，24%～40% A。进样体积10 μL，检测波长245 nm，体积流量0.6 mL/min，柱温38 ℃。

表1 金银花及山银花采集信息及性状描述

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称定香豆酸、新绿原酸、莫诺苷、绿原酸、断马钱子酸、咖啡酸、当药苷、断氧化马钱苷、芦丁、异槲皮素、木犀草苷、忍冬苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C，以50%甲醇溶解，配制成质量浓度分别为0.570、0.252、0.966、0.480、0.460、0.420、0.825、0.550、0.954、0.271、0.373、0.284、0.448、0.430、0.672 mg/mL的贮备液，再分别精密量取各贮备液200 µL，即得混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取金银花粉末1 g置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL，称定记录质量，室温超声提取30 min（功率250 W、频率35 kHz），冷却后以50%甲醇补足减失质量，摇匀过滤，即得。

2.1.4 精密度试验 取混合对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下，连续进样6次，15个峰面积的相对保留时间RSD均小于2%，相对峰面积RSD均小于3%，证明该法精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取四季花粉末6份，按“2.1.3”项下制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下测定。15个峰面积的相对保留时间RSD均小于2%，相对峰面积RSD均小于3%，证明该法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 取四季花供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下，分别在0、2、4、8、16、24 h进样，15个峰面积的相对保留时间RSD均小于2%，相对峰面积RSD均小于3%

2.2 金银花含量测定

参照《中国药典》2020年版金银花项下含量测定并进行线性关系考察，线性关系见表2。

表2 成分线性关系

2.3 结果与分析

2.3.1 金银花及山银花指纹图谱相似度评价 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版）”对样品图谱进行相似度评价，相似度数据见表3。但是为了清晰看出样品间差别，将金银花和山银花重叠图谱放在了不同图上，见图1～3。

由图1、2可知，不同品种金银花药材共有峰22个，已知化合物15个；不同基原山银花共有峰16个，与金银花共有峰15个，共有已知化合物9个，分别为新绿原酸、绿原酸、断马钱子酸、当药苷、断氧化马钱子苷、异槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C。由图3可知金银花有而山银花没有的峰有5、10、13、15（木犀草苷）、16（忍冬苷）、17、22号峰。金银花含量较山银花较高的的有7号峰（断马钱子酸）和12号峰，山银花较金银花含量高的有1（新绿原酸）、6（绿原酸）、11（断氧化马钱苷）、14（异槲皮素）、19（异绿原酸A）和21（异绿原酸C）号峰。

四季花、豫金1号、北花1号和羊角花相似度超0.95；但豫金1号、四季花含有少量香豆酸及芦丁，相似度达0.994，北花1号和羊角花则不含有。山银花样品相似度均在0.97以上，白米花和青米花（同属红腺忍冬）相似度达0.993，其中山白花（灰毡毛忍冬）与红腺忍冬及华南忍冬峰有些许差异，尤其以4号峰（莫诺苷）和J2号峰（芦丁）含量较高。

表3 各样品间相似度

1-新绿原酸 4-莫诺苷 6-绿原酸 7-断马钱子酸 8-咖啡酸 9-当药苷 11-断氧化马钱苷 14-异槲皮素 15-木犀草苷 16-忍冬苷 18-异绿原酸 B 19-异绿原酸 A 21-异绿原酸 C J1-香豆酸 J2-芦丁

豫金2号与药用的金银花和山银花两者差别较大，和每个样品相似度都低于0.60，可以完全独立出来，故而该忍冬变种在产地不做药用。由图4可知豫金2号环烯醚萜类中11号峰断氧化马钱苷含量较金银花与山银花高。

图2 山银花样品HPLC指纹图谱叠加图

图3 金银花与山银花对照指纹图谱

2.3.2 金银花及山银花已知共有化学成分主成分分析（principal component analysis，PCA） 就样品中已知的9个共有峰面积（表4），分别为新绿原酸、绿原酸、断马钱子酸、当药苷、断氧化马钱子苷、异槲皮素、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C，采用SIMCA13.0对样品进行PCA分析，模型检验R＝0.95、2＝0.654，表明该模型预测信度很好。结果如图5所示，与相似度评价结果一致，金银花与山银花各聚为一类，且四季花与豫金1号相似度高，白米花与青米花相似度高。

图4 豫金2号HPLC指纹图谱

2.3.3 金银花及山银花已知共有化学成分含量差异分析 以封丘种植历史较久的四季花中9个共有已知成分作为参照，比较各药材间化学成分差异，用各药材对应峰面积除以四季花对应峰面积，数值大于1表示含量高，小于1表示含量低。由表5可知山银花中新绿原酸峰面积是金银花的5.05～14.16倍，山银花较金银花中绿原酸偏高、异绿原酸B是金银花的2.00～5.06倍、异绿原酸A是金银花的2.29～4.85倍、异绿原酸C是四季花的1.29～7.86倍。金银花是山银花中断马钱子酸峰面积的3.33～10倍，金银花是山银花中当药苷峰面积的1.14～5.24倍。豫金2号断氧化马钱子苷较其他样品高15倍左右。由图6可知金银花聚为一类时起主要作用的成分为当药苷和断马钱子酸；山银花聚为一类的成分有异槲皮素和有机酸类成分；豫金2号与其他样品差异性大的主要原因就是断氧化马钱子苷。

表4 金银花和山银花已知共有化合物峰面积

图5 样品PCA得分分布图

2.3.4 不同品种金银花质量评价 由表6可知，不同品种金银花间成分量存在显著性差异，含酚酸类以绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸C三者之和计北花1号较高；就木犀草苷而言，豫金1号和北花1号量较高。

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法及色谱条件考察

指纹图谱的建立过程中，本课题组对提取溶剂种类：水及不同浓度的甲醇和乙醇进行比较，最后发现50%甲醇提取出的化学成分种类较多。课题组也对提取方式（回流及超声）进行比较，因差异性不大，故选择了超声提取。而后对料液比、超声功率、提取时间、都进行过考察；确定了供试品的提取方法。同时对流动相梯度变化、检测波长、色谱柱温、体积流量等参数进行优化，最终确定了该色谱指纹图谱条件。该色谱条件在能较全面分离金银花化学成分的同时较现有金银花指纹图谱时间也有所缩减。

表5 金银花和山银花已知共有化合物峰面积比

图6 样品PCA品名、成分双标图

3.2 化学成分与指标性成分

在化学指纹图谱相似度计算时，将大面积峰对应的高含量的化学成分进行严格的控制，次要峰和小峰则允许有较大变化或直接忽略不计，这对评价有效成分不明确的中药并不合适。有研究称指纹图谱间的细微差异可能才是质量评价的关键[8]。刘昌孝院士[9-10]提出的质量标志物其具有“有效性”“特有性”“传递与溯源性”“可测性”及“相关配伍”等特点。而实际情况下标志物的选择很难兼顾所有特性。以金银花中绿原酸为例，现代药理研究表明绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和抗炎的作用，这就是有效性的体现，可测性是质量标志物的基础，但绿原酸大多数中药材中都含有，比如山银花、菊花、苍耳等，相对于金银花绿原酸的专属性就不强。通过对比金银花及山银花指纹图谱，可以发现5、10、13、15（木犀草苷）、16（忍冬苷）、17和22号峰，均是金银花有而山银花没有的峰，现代研究表明木犀草苷具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗皮肤老化、抗局部缺血的生物活性[11]。相对于绿原酸来说木犀草苷在有效性的基础之上专属性也更强一些。而除木犀草苷和忍冬苷外，5、10、13、17和22这5个未知峰或许也能够为金银花的质量标志物提供参考。

表6 不同品种金银花含量测定

不同小写字母表示差异显著（＜0.05）

Different lowercase letters indicate significant differences (< 0.05)

3.3 化学指纹图谱与基因相关性

基因是指通过有性繁殖或无性繁殖在亲代与子代间传递的遗传物质，不同药用植物栽培品种来源的药材可能具有各自相对稳定的核酸序列，也具有各自独特的蛋白表达。生物指纹图谱是从基因水平上对药用植物进行种质亲缘关系检测的有效工具[12]。在产地调查中了解到豫金1号是四季花芽变选育出的新品种，故而这2个品种相似度达0.994，而且相对于北花1号及羊角花都多含有J1号峰（香豆酸）、J2号峰（芦丁）。白米花和青米花虽然颜色性状差异较大，但是同属红腺忍冬，可能是采收花期及干燥方式不同造就了颜色的差异，但后期的这些因素并不会对基因序列造成影响，而两者化学指纹图谱相似度达0.993，在一定程度上也表现了基因序列的信息。化学指纹图谱与DNA指纹图谱必然存在一定相关性，故而采用DNA指纹图谱表征药效组分含量及化学指纹图谱特征，挑选忍冬优良品种也不失为一条研究路线。

3.4 忍冬品种探讨

忍冬各品种间成分含量有明显差异，据本课题组调研，现河南封丘确实存在部分金银花木犀草苷含量低于药典要求的情况，排除金银花花期和茬期的影响，其中品种是一个不可忽视的问题。本课题组前期研究表明，不同生长期金银花中木犀草苷含量由高到低依次为大白期＞二白期＞三青期＞银花期＞金花期[8]。金银花采花时期一般分为四茬，木犀草苷含量与金银花茬期的关系也表现为头茬含量最高。为了避免金银花茬期间差异的影响，这4个忍冬品种均采收于同一时期。排除前面这些因素，化学成分含量偏低的原因可能就是品种退化，封丘产地现栽培面积最大的就是四季花，多年的无性繁殖很可能引起品种退化。4个品种中四季花和豫金1号直立性好、花期长、产量稳定；羊角花稍次之；北花1号的特点是花期持续时间短，长时间不开花，采摘较为方便，但是花期短也就造成产量偏低，而且烘干后的花蕾多开裂，市场认可度不高。而在木犀草苷含量上占据优势的有豫金1号和北花1号。本课题组对忍冬品种间质量评价的研究能够为金银花的优质育种和金银花规范化种植基地选种提供理论依据。

综上所述本实验成功构建的金银花和山银花的化学指纹图谱可对二者进行显著区分，且指纹图谱相似度的结果与共有化学成分PCA分析结果一致，由金银花及山银花已知共有化学成分PCA分析及指纹图谱相似度联合分析，可知多成分同时测定也能在一定程度上反映药材的整体性，多指标定量评价模式较适合于中药的质量控制[13]。木犀草苷、忍冬苷、5、10、13、17和22这7个峰或许能为金银花的质量标志物提供参考。河南封丘现种植忍冬品种中豫金1号和北花1号质量较优，四季花产量占些许优势，虽各有部分缺陷，但仍是具有进一步开发利用的潜在种质资源。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Identification ofandbased on fingerprint and quality evaluation of different varieties of

QI Da-ming1, DONG Cheng-ming1, 2, LIU Tian-liang1, GAO Qi-guo3, YANG Lin-lin1, HOU Wen-chuan1

1. Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment & Chinese Medicine Development of Henan Province, Zhengzhou 450046, China 3. Taloph Pharmaceutical Co., Ltd., Zhengzhou 450001, China

To establish the HPLC fingerprint ofJinyinhua () and Shanyinhua (). The differences ofin Fengqiu of Henan Province andin Hunan Province were compared based on the HPLC fingerprint and the quality of different varieties ofin Fengqiu was evaluated.Fingerprints ofandwere establishd by HPLC. The Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System (2012 version) was used for similarity evaluation, and the PCA analysis was performed by (SIMCA13.0). HPLC was used to detect the content of different varieties ofin Henan.The similarity of all varieties ofin Fengqiu was above 0.95, similarity offrom different origins was above 0.97. The similarity ofandwas 0.57—0.79. The similarity between the Yujin No.2 andandwere less than 0.6. PCA analysis can distinguishandsignificantly. The total contents of chlorogenic acid, isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C in the Beihua No.1 was 5.1%, which was 15% higher than other varieties of. The content of luteoloside in the Yujin No.1 was 0.062% and in the Beihua No. 1 was 0.064%, which were about 25% higher than that in the Sijihua and about 50% higher than that in the Yangjiaohua.The HPLC fingerprint can significantly distinguishand, and the difference of chemical components between them could also provide reference for the selection of Q-markers of. The content of components in different varieties ofwas significantly different. The Yujin No.1 and the Beihua No.1 have better quality, which were potential germplasm resources for further development and utilization.

; variety;; HPLC fingerprint; chlorogenic acid; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid C; Q-Markers

R286.2

A

0253 - 2670(2023)06 - 1946 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.027

2022-09-06

国家自然科学基金资助项目（81603232）

齐大明（1995—），男，硕士研究生，研究方向为中药资源与鉴定。Tel: 18838963870 E-mail: 809735897@qq.com

董诚明，教授，主要从事药用植物学、中药资源学研究。Tel: 13592508163 E-mail: dcm371@sohu.com

[责任编辑 时圣明]