细胞自噬与猪流行性腹泻病毒相互作用的研究进展

蓝小媛，徐 瑶，张 伟，高 崧，郇长超

（扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

1 自噬

细胞自噬（Autophagy）是一种广泛存在真核生物中的细胞内降解过程，并在进化上高度保守（张林琳等，2021），其中产生自噬体能将长寿的蛋白质、蛋白质聚集物和受损的细胞器运送到溶酶体进行降解和循环。根据细胞物质运送到溶酶体的方式，自噬可以分为三种类型：巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬（Yu，2014），而通常说的自噬指的是巨自噬。细胞自噬的发生具有复杂性和动态性，与环境相关并受到严格的调控反应，涉及许多上游信号调控通路。自噬主要通过磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路进行诱导，而其他调控信号则是直接或间接通过这两条通路发挥作用。多种细胞外和细胞内的刺激均可以诱导自噬（Miller等，2020），比如营养饥饿、内质网应激、病原体相关分子模式和病毒感染等过程。在病毒生命周期和疾病发病机制中病毒与宿主之间的相互作用起着重要作用，而巨自噬/自噬等细胞途径被证明对病毒的复制和成熟是有害或有益的（Miller等，2020）。对机体是保护还是损害主要取决于应激的性质、细胞的类型和状态。自噬在维持细胞平衡和内稳态发挥着重要的作用，研究已表明，自噬参与天然免疫应答和特异性免疫应答（高书峰等，2017），并且证明自噬基因的突变与各种疾病的发生存在关联（Yu，2020）。

2 猪流行性腹泻病毒

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科甲型冠状病毒属的一种有囊膜的单股正链RNA病毒，可引起新生仔猪发生急性水样腹泻、呕吐、脱水和高死亡率的高度传染性疾病 （Jung等，2020），其主要感染猪小肠上皮细胞（Krishna等，2020）。PEDV的基因组长度约为28 kb，有一个5'帽和一个3'聚腺苷化的尾巴，其包含至少7个开放阅读框（Kong等，2020；Yu等，2020），其中2/3的基因组包含两个重叠的ORF，分别是ORF1a和ORF1b，它们编码指导基因组复制、转录和病毒多蛋白加工的非结构蛋白，其余的PEDV基因组包含5个ORF，编码4个结构蛋白和一个附属蛋白（Lin等，2016），结构蛋白包括糖基化刺突（S）、包膜（E）、糖基化膜（M）和RNA结合核衣壳（N）蛋白（黄宗洋等，2022）。研究表明，S是最大的结构蛋白，其氨基酸的变化会影响PEDV的毒力和致病性，而且S基因突变广泛，因此常被用作病毒遗传变异分析的靶基因（Yu等，2020）。N蛋白是病毒颗粒中含量最丰富的蛋白质，其为病毒基因组周围的螺旋核衣壳提供了结构基础，N蛋白参与病毒的多种生物和免疫活动。M和E蛋白通过组装形成病毒包膜。

3 自噬与猪流行性腹泻病毒的相互作用

3.1 猪流行性腹泻病毒诱导自噬 自噬不仅是一种自我降解的生理细胞途径，也是一种保护宿主细胞免受病原体感染的防御机制，当病原体入侵机体，细胞通过将病原体运输到溶酶体进行清除。研究发现PEDV的结构蛋白（S、M、E、N）不足以触发自噬，而PEDV的非结构蛋白6（nsp6）和ORF3能够诱导猪肠上皮细胞（IPEC-J2）发生明显的自噬（Lin等，2020）。因此，nsp6和ORF3是PEDV诱导自噬的两个关键因子。

3.1.1 PEDV通过内质网应激诱导自噬 错误折叠的蛋白质在内质网腔内积累，触发未折叠蛋白反应（UPR）以恢复稳态，这种情况被定义为内质网应激（黄宗洋等，2022）。许多冠状病毒科在复制过程中，会产生大量的病毒跨膜糖蛋白来诱导内质网应激反应（Xu等，2013；Minakshi等，2009），Zou等（2019）启动了多种表达PEDV的ORF3蛋白的重组质粒的构建，并发现ORF3以聚集的方式定位于细胞质中，PEDV的ORF3蛋白也是一种定位于内质网的跨膜蛋白。Sun等（2021）研究发现，PEDV感染可以诱导内质网应激，并通过蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、肌醇依赖酶（IRE）信号通路激活自噬，内质网应激和自噬在机制上是相互关联的。经研究证明ORF3通过上调葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和激活PERK-真核翻译起始因子2α（eIF2α）信号通路触发内质网应激，同时PEDV的ORF3蛋白可以通过诱导LC3-I向LC3-II的转化来诱导自噬，相比之下，内质网应激抑制剂4-PBA可显著抑制LC3-I/LC3-II的转化，说明PEDV的ORF3蛋白诱导的自噬依赖于内质网应激反应（Zou等，2019）。同时累积的活性氧（ROS）在PEDV感染过程中调节内质网应激介导的自噬发挥了重要作用（Surviladze等，2013）。

3.1.2 PEDV通过PI3K/Akt/mTOR诱导自噬PEDV属于冠状病毒科甲型冠状病毒属，冠状病毒nsp6是一种完整的膜蛋白，被认为参与了双膜囊泡（DMV）的形成，冠状病毒nsp6蛋白通过一个巨大的中间体从内质网产生自噬体，并激活自噬（Cottam等，2011），已有研究表明，nsp6也可促进PEDV自噬，但nsp6诱导自噬的机制尚不清楚。研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路在自噬过程中起着至关重要的作用（Surviladze等，2013；Saiki等，2011）。Lin等（2016）通过分析nsp6表达的IPEC-J2细胞中未磷酸化和磷酸化的mTOR、P70S6激酶（p70S6K）和p53的表达发现，nsp6通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬，通过干扰RNA实验进一步证实了自噬与PEDV复制的关系。内源性p53基因被特异性沉默，与模拟处理组相比，干扰RNA介导的p53表达沉默降低了病毒滴度。这些数据也证明PEDV触发的自噬是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路进行的 （Cottam等，2011）。

3.2 自噬促进猪流行性腹泻病毒复制 自噬是一种内在的宿主防御机制，但随着病毒的进化，已经发展出许多机制来阻止自噬，甚至利用自噬使其有利于自身的发展，如今自噬被认为是病毒复制的平台（Guo等，2017）。冠状病毒科成员的复制机制各不相同，例如传染性支气管炎病毒能够诱导自噬，但不需要自噬来进行复制（Maier等，2013）；传染性胃肠炎病毒感染诱导自噬，自噬负调控其复制（Guo等，2016）。

为了确定自噬与PEDV复制的关系，Lin等（2020）使用自噬增强剂和自噬抑制剂来检测自噬对PEDV复制的影响。羟基氯喹可以通过阻断自噬体与溶酶体的融合来抑制自噬，早期用羟氯喹抑制自噬可抑制PEDV感染，雷帕霉素通过抑制mTOR信号通路诱导自噬，而雷帕霉素诱导自噬可使病毒滴度升高。这些结果表明，自噬增强了PEDV在IPEC-J2细胞中的复制（范浩天，2019；Cottam等，2011），因此自噬有助于PEDV复制。Surviladze等（2013）以自噬诱导剂雷帕霉素（1 μM）和自噬抑制剂3-MA（5 mM）作为对照，应用PERK和肌醇依赖酶1（IRE1）抑制剂验证内质网应激介导的自噬对PEDV复制的影响，结果表明PEDV通过PERK和IRE1通路诱导自噬从而促进病毒复制（Surviladze等，2013）。细胞自噬如何促进PEDV复制的分子机制还有待进一步的研究。

4 小结

自噬是一种必要的细胞自降解过程，在维持细胞内环境稳态和能量平衡发挥着重要的作用，还与多种疾病的发生存在关联。目前对自噬的研究范围非常广泛，涉及肿瘤学、神经病学、心血管系统、内分泌、外科、泌尿系和消化系统等。自噬一方面具有抗病毒和抗炎作用，但另一方面它们被病毒进化来抑制、逃逸或操纵各自的宿主成分，病毒可能会出于自身优势而触发自噬促进复制。PEDV作为一种猪肠道冠状病毒，具有高度传染性，给全球养猪场带来了巨大的经济损失。目前研究证明PEDV主要是通过非结构蛋白nsp6和ORF3诱导自噬，nsp6通过激活内质网应激诱导自噬，ORF3通过PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导自噬，目前关于自噬与PEDV之间的相互作用机制研究较少，研究自噬与PEDV感染之间的相互作用，进一步了解PEDV的致病机制，为PEDV的治疗和抗病毒药物的研发提供新的解决途径和思路。同样属于冠状病毒科的新型严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2），在2019年引发全球爆发新型冠状病毒肺炎（COVID-19），极大的影响了医疗和社会经济，给人类带来了极大的挑战，迅速成为全球公共卫生紧急事件（Mijaljica等，2020）。直到现在仍然没有研制出有效的抗击新冠肺炎药物，研究表明自噬与SARSCoV-2同样具有复杂的关系，自噬可以作为抗SARS-CoV-2感染的一种新策略，为治疗新冠肺炎提供新的方法和思路。