利用Cre-loxP系统构建AT2细胞特异性敲除HDAC3基因小鼠

熊 锐 李国瑞 邹诗施 李 宁 耿 庆

组蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3，HDAC3)是组蛋白去乙酰化酶家族的一员，具有调节生物节律、代谢和发育的功能，位于细胞核中，在特定条件下可以从细胞核转位到胞质中发挥作用[1]。笔者团队前期研究显示，HDAC3参与了多种疾病的病理过程，包括缺血再灌注损伤、纤维化、神经退行性变、感染和炎症[2]。特别是在肺损伤中，HDAC3在促进炎性细胞因子的表达中起着多方面的作用，这是由HDAC3的酶活性决定的，因此在基因层面抑制HDAC3的表达或者在药理学层面抑制其酶活性可能是减轻肺损伤的重要策略[3,4]。

肺泡2型上皮(alveolar type 2 epithelial，AT2)细胞在产生肺表面活性物质方面具有独特的功能，并在肺损伤中作为祖细胞发挥作用[5,6]。此外，AT2细胞的损伤与肺纤维化和炎症有关[7，8]，而HDAC3作为肺稳态重要的调节酶，在AT2细胞中如何发挥生物学功能鲜见报道。因此，笔者聚焦于AT2细胞来探讨HDAC3在肺部疾病中的作用及机制。

本研究利用Cre-loxP系统，选取HDAC3flox/-小鼠与AT2细胞特异性表达Sftpc-Cre重组酶的工具鼠进行数代杂交，成功构建了AT2细胞特异性敲除HDAC3的基因小鼠，为探究肺部疾病的发病机制及治疗靶点提供了动物研究模型。

材料与方法

1.实验动物：HDAC3-flox(+/-)小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，交付2雌1雄，6～8周龄，体质量为20～25g。Sftpc-Cre(+/-)小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，交付2雄1雌，6～8周龄，体质量为20～25g。所有动物均饲养于武汉大学人民医院动物实验中心SPF 级动物间(25℃，光暗周期12h/12h),实验操作均获得武汉大学人民医院动物伦理委员会批准[WDRM动(福)第20210305号]。

2.主要试剂：动物基因组DNA快速抽提试剂盒及Taq Master Mix购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；基因鼠所用鉴定引物分别由上海南方模式生物科技股份有限公司和江苏集萃药康生物科技有限公司设计，北京擎科生物科技有限公司负责合成，鉴定HDAC3-flox小鼠所需引物序列为P1上游引物: 5′-GACACCTCTGTGATGAGCCA-3′，P2下游引物:5′-CCCCTCTTGTCACTTTCCCC-3′。鉴定Sftpc-Cre小鼠所需引物序列为:①3′arm上游引物:5′-TGTGAGGAAACTGATCCTCGAG-3′, 下游引物: 5′-AGGCCACCTCTTCCCGTCCCGT-3′;②WT上游引物:5′-TGCTTCACAGGGTCGGTAGAAAC-3′, 下游引物: 5′-TAACACCCGTGTATGGCACCC-3′。TNF-α检测试剂盒(H052-1)购自南京建成生物工程研究所。ABCA3抗体(A6862)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司, HDAC3抗体(BF0230)购自江苏亲科生物研究中心有限公司, CY3标记山羊抗兔(SA00009-2)，CY3标记山羊抗小鼠(SA00009-1), CoraLite488标记山羊抗兔(SA00013-2)和CoraLite488标记山羊抗小鼠(SA00013-1)均购自武汉三鹰生物技术有限公司。DAPI染液(G1012)，HE染液(G1005),SerRed核酸染料10000(G3606)，DNA marker(G3361、G3367)等其他试剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

3.AT2胞HDAC3基因条件性小鼠模型的建立：(1)将Sftpc-Cre(+/-)小鼠自交获得杂合Sftpc-Cre(+/-)小鼠。(2)将HDAC3flox/-小鼠自交获得HDAC3flox/flox小鼠和HDAC3flox/-小鼠。(3)将Sftpc-Cre(+/-)小鼠与HDAC3flox/flox小鼠或HDAC3flox/-小鼠杂交，得到双杂合小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre(+/-)。(4)将获得的双杂合小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre(+/-)与HDAC3flox/flox小鼠或HDAC3flox/-小鼠杂交，获得目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre(+/-)。

4.小鼠基因组DNA提取及扩增：取1周龄左右小鼠，剪取鼠尾约5mm，使用动物基因组DNA快速抽提试剂盒提取小鼠基因组DNA：首先加入400μl Buffer Digestion和40μl蛋白酶K溶液，置于65℃水浴裂解3h；裂解完成后，加200μl Buffer PA，充分颠倒混匀置于-20℃放置5min，室温10000r/min离心5min并转移上清；接下来加入等体积异丙醇，充分混匀后室温放置2～3min，室温10000r/min离心5min，弃上清后用75%乙醇清洗两遍，开盖室温倒置5～10min至乙醇完全挥发；最后将得到的基因组DNA用50μl TE Buffer溶解，溶解液即为基因组DNA。将提取的基因组DNA测定浓度后用PCR扩增目的基因，PCR反应体系25μl为：2×San Taq PCR Mix 12.5μl，DNA模板1μl，上游引物(10μmol/L) 1μl，下游引物(10μmol/L) 1μl，Sterilized ddH2O 9.5μl。PCR反应程序为：①95℃，5min；②98℃，30s；③65℃ (-0.5摄氏度/循环)，30s；④72℃，45s；②③④20个循环；⑤98℃，30s，⑥55℃，30s；⑦72℃，45s；⑤⑥⑦20个循环；⑧72℃，5min；⑨10℃，维持。对HDAC3-flox小鼠的鉴定只需进行一组PCR反应；对Sftpc-Cre小鼠的鉴定需进行两组PCR反应，分别为WT反应组和3′arm反应组。

5.扩增产物的琼脂糖凝胶电泳：将5×的TAE用超纯水稀释成1×的TAE，配制2%琼脂糖凝胶，煮沸充分混匀后以1∶10000加入SerRed核酸染料，再次混匀后倒入制胶器中并插入梳子进行凝胶制作。约30min后，拔出梳子。将凝胶置于电泳槽中，每个梳孔上样10μl扩增产物后开始电泳，恒压160V，约30min可结束电泳。取出凝胶，于BioRad成像仪下进行DNA成像。

6.基因型鉴定结果的判读：根据上海南方模式生物科技股份有限公司和江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供的鉴定方案进行结果判读。对于HDAC3-flox小鼠，HDAC3flox/flox小鼠可见356bp一条条带，HDAC3flox/-小鼠可见290bp 和356bp 两条条带, 野生型可见290bp一条条带。对于Sftpc-Cre小鼠，Sftpc-Cre(+/+) 小鼠在WT反应组无条带，在3′arm反应组可见838bp一条条带；Sftpc-Cre (+/-)小鼠在WT反应组可见386bp一条条带，在3′arm反应组可见838bp一条条带；野生型在WT反应组可见386bp一条条带，在3′arm反应组无条带。

7.免疫荧光验证敲除效果：小鼠断颈处死后，取出肺组织，4%多聚甲醛固定24h以上，再将肺组织按程序经乙醇、二甲苯和石蜡之后，进行脱水浸蜡、包埋，蜡块凝固后取出备用。在切片机上，将蜡块切片成2～3μm厚。切片脱蜡至水，依次放入二甲苯115min，二甲苯215min，无水乙醇15min，无水乙醇25min，90%乙醇5min，75%乙醇5min，自来水洗。微波炉加热进行抗原修复后冷却至室温，PBS洗3次，每次5min。切片滴加适量一抗工作液(ABCA3-1∶150, HDAC3-1∶150)，4℃过夜。次日复温，PBS洗3次，每次5min。再滴加适量二抗工作液(CY3标记山羊抗兔-1∶100， CoraLite488标记山羊抗小鼠1∶100)，37℃水浴锅,避光孵育40min，PBS洗3次，每次5min。滴加DAPI染核，室温避光孵育20～30min，PBS洗。用抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下测量HDAC3在ABCA3阳性细胞即AT2细胞中荧光强度。每只小鼠肺组织切片在400倍镜下随机选取3个视野进行测量，总荧光强度值与ABCA3阳性细胞数的比值作为该小鼠AT2细胞中HDAC3的相对表达量。

8.苏木精-伊红(HE)染色观察两组小鼠各组织形态：小鼠断颈处死后，取出肺组织，4%多聚甲醛固定24h以上，再将肺组织按程序经乙醇、二甲苯和石蜡之后，进行脱水浸蜡、包埋，蜡块凝固后取出备用。在切片机上，将蜡块切片成2～3μm厚。切片依次经二甲苯110min，二甲苯210min，无水乙醇15min，无水乙醇25min，90%乙醇5min，75%乙醇5min，自来水洗。处理好后，苏木精染液染色3～5min，自来水洗；再经苏木精分化液2～5s，自来水洗；苏木精返蓝液2～5s，自来水流水充分冲洗；切片依次经85%、95%梯度乙醇脱水，各5min。然后进入伊红染液(醇溶)中染色5min，经两次无水乙醇脱水各5min；切片再经新鲜无水乙醇脱水5min，二甲苯透明5min，更换新鲜的二甲苯再透明5min；最后，滴加中性树胶进行封片，显微镜下拍照。

9.小鼠肺匀浆中TNF-α含量以及心脏、肝脏和肾脏功能的测定：经小鼠尾静脉抽取静脉血0.5ml，4℃，3500r/min，离心5min，取上清液通过全自动生化仪检测血清肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase-MB,CK-MB)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、肌酐(creatinine)。断颈法处死小鼠，取新鲜肺组织制成匀浆，4℃，5000r/min，离心10min，取上清液根据肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的Elisa检测试剂盒说明书按步骤进行测定。

结 果

1.HDAC3-flox小鼠基因型鉴定结果：引进的HDAC3-flox杂合子小鼠雌雄合笼繁殖出3 种基因型子代小鼠，基因型鉴定结果，详见图1。PCR电泳实验结果显示纯合子HDAC3flox/flox小鼠可见356bp一条条带，HDAC3flox/-杂合子小鼠可见290bp和356bp 两条条带，野生型可见290bp一条条带。

图1 HDAC3-flox小鼠基因型鉴定655、660.WT反应组；697、698.HDAC3flox/-；656、657、658.HDAC3flox/flox

2.Sftpc-Cre小鼠基因型鉴定结果：引进的Sftpc-Cre杂合子小鼠雌雄合笼繁殖出两种基因型子代小鼠，基因型鉴定结果详见图2。PCR电泳实验结果显示纯合子Sftpc-Cre(+/+) 小鼠在WT反应组无条带，在3′arm反应组可见一条838bp条带。Sftpc-Cre (+/-) 杂合子小鼠在WT反应组可见一条386bp条带，在3′arm反应组可见一条838bp条带。

图2 Sftpc-Cre小鼠的基因型鉴定A.WT反应组；B.3′arm反应组。14、15.Sftpc-Cre (+/-)；16、17.Sftpc-Cre(+/+)

3.双杂合基因小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre (+/-)的鉴定结果：将子代Sftpc-Cre (+/-)小鼠与子代HDAC3flox/-小鼠或者HDAC3flox/flox进行杂交，以获取双杂合小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre (+/-)，此步尤为关键。综合PCR电泳实验结果详见图3，816、818、819和820为双杂合小鼠，817为Sftpc-Cre (+/-)小鼠。

图3 HDAC3flox/-Sftpc-Cre (+/-)小鼠基因型鉴定A.816、818、819、820: HDAC3flox/-，817：WT; B. 816、817、818、819、820: Sftpc-Cre (+/-)

4.AT2细胞敲除HDAC3基因小鼠的鉴定结果：将获得的双杂合小鼠HDAC3flox/-Sftpc-Cre(+/-)与HDAC3flox/flox小鼠或HDAC3flox/-小鼠杂交，以获取目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)，综合PCR电泳实验结果详见图4，29、32、33和35均为目的小鼠。

图4 HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)小鼠基因型鉴定A.29、32、33、35:HDAC3flox/flox，27、28、30、31、34：HDAC3flox/-；B. 29、32、33、35：Sftpc-Cre (+/-)，27、28、30、31、34：Sftpc-Cre (+/+)

5.HDAC3在小鼠肺AT2细胞中敲除效果：免疫荧光结果显示，HDAC3在HDAC3flox/flox小鼠肺中有表达，且和ABCA3存在共定位，说明正常生理条件下AT2细胞中存在HDAC3表达。在获得的目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)中，可见HDAC3在小鼠肺中表达显著降低，未见明显HDAC3和ABCA3共定位(P<0.001,图5)。这些都说明HDAC3在AT2细胞中几乎全被敲除，敲除效果满意。

图5 免疫荧光染色验证HDAC3 在小鼠AT2细胞敲除效果(×400)A.两组小鼠肺组织石蜡切片免疫荧光结果示ABCA3和HDAC3共定位情况(n=3),红光指示ABCA3，绿光指示HDAAC3，Merge为红光和绿光融合；B.对免疫荧光结果的定量分析显示与HDAC3flox/flox小鼠比较，HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)小鼠肺组织HDAC3在AT2细胞中的相对表达量明显减少

6.小鼠各脏器组织形态学与功能研究：为了证明笔者构建的小鼠安全、可靠，生理情况下不会因为基因的敲除导致小鼠全身脏器受损甚至死亡，笔者通过HE染色观察了目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre (+/-)和对照组小鼠HDAC3flox/flox的心脏、肝脏、肺和肾脏的组织形态。结果表明(图6A), 两组小鼠的各脏器未出现明显的病变和差异。心肌纤维排列整齐，形态完整清晰；肝细胞排列规则，核圆居中，胞质均匀；肺组织无充血水肿，无炎性细胞浸润，肺泡间隔均匀；肾脏结构清晰，肾小球和肾小囊大小正常，无出血。此外，两组小鼠分别反映心脏、肝脏、肺和肾脏组织损伤水平的CK-MB、ALT、肌酐和肺匀浆中TNF-α差异均无统计学意义(图6中B～E)。

图6 两组小鼠心脏、肝脏、肺和肾脏组织形态与功能学A. HE染色显示两组小鼠(n=3)心脏、肝脏、肺和肾脏组织均未出现明显损伤，组织结构清晰，细胞形态正常，排列规律，无炎性细胞浸润，无充血水肿(×100)；B～E. 两组小鼠(n=3)反映心脏、肝脏、肺和肾脏组织损伤水平的CK-MB、ALT、TNF-α和肌酐差异均无统计学意义

讨 论

许多基因在不同的细胞类型中扮演不同的角色，因此，需要将这些基因在特定组织或细胞中进行编辑 (称为条件性基因表达)来充分了解它们的功能。Cre-loxP是一种条件性基因敲除系统，已经被广泛用于小鼠特定组织或细胞的基因敲除，通过在目的基因两端内含子插入loxP序列，运用不同的Cre重组酶工具鼠进行打靶，能够将目的基因在小鼠不同组织或细胞中进行敲除[9]。既往研究中，已经有研究者利用Cre-loxP系统成功构建出肝组织特异性ATF5敲除小鼠模型，乳腺细胞特异性敲除SENP7基因小鼠模型，血管内皮细胞敲除DEPTOR基因小鼠模型等，各自为目的基因在特定组织中的生物学功能研究提供了在体模型，说明该系统比较成熟，技术上可行，便于研究[10～12]。本研究选用Sftpc-Cre工具鼠成功对小鼠AT2细胞中HDAC3基因进行打靶。ABCA3是在AT2细胞中高表达的跨膜蛋白，所以笔者将HDAC3和ABCA3进行免疫荧光共定位以验证敲除效果[13,14]。在对照组小鼠HDAC3flox/flox中，HDAC3在AT2细胞中可见正常表达，而在目的小鼠HDAC3flox/floxSftpc-Cre(+/-)中，HDAC3在AT2细胞中几乎不表达，敲除效果满意。此外，为了提供一个安全、可靠的实验动物模型，笔者还对小鼠的心脏、肺、肝脏和肾脏的组织形态学进行了研究，证明了在生理情况下，AT2细胞中敲除HDAC3对小鼠各脏器无明显损害。

AT2细胞作为呼吸屏障的重要组成部分，具有调节肺部免疫系统，保护肺部免受损伤的功能[15]。研究表明，AT2细胞在特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)发病机制中起着核心作用，因为AT2细胞的功能障碍和反复的细胞损伤是IPF发病的直接原因[16]。笔者前期综述了HDAC3在多种实质性器官损伤特别是肺损伤中发挥重要作用，如印苦楝内酯通过抑制TNF-α介导的NF-κB和HDAC-3核转位预防内毒素诱导的急性呼吸窘迫综合征，HDAC3选择性抑制剂RGFP966通过减弱NF-κB p65转录活性，在小鼠巨噬细胞和小鼠肺组织中发挥抗炎特性，HDAC3缺失通过调节NF-κB和TGF-β/Smad2/3信号通路抑制PM2.5诱导的小鼠肺损伤等[2，17～19]。然而，既往在肺损伤的研究中多是聚焦于HDAC3在肺泡巨噬细胞，肺泡1型上皮(alveolar type 1 epithelial，AT1)细胞和肺动脉内皮细胞中的作用，关于HDAC3在AT2细胞中的作用则鲜见报道[20～22]。

因此，本研究在小鼠AT2细胞中敲除HDAC3，为后续深入研究肺部疾病中HDAC3的生物学功能和相应的调控分子机制提供了安全、可靠的在体实验动物模型。