滇重楼优良野生种源评价与筛选

徐永艳 李 昆 焦 蓉 汪 琼 王占娣 石冰杰 徐 荣

（1. 西南林业大学，云南 昆明 650233；2. 中国林科院资源昆虫所 云南 昆明 650224；3. 玉溪师范学院，云南 玉溪 653100）

滇重楼（Paris polyphyllavar.yunnanensis）为延龄草科（Trilliaceae）重楼属多年生草本植物，是我国西南地区重要的林下中药资源。其根茎具有止血散瘀、清热解毒、抗肿瘤、免疫调节等功效[1-2]。是云南省传统道地药材，历来为我国众多著名中成药如云南白药等的主要原料[3]。滇重楼在云南分布广，且地理种源较多[4]，具有丰富的遗传多样性。但是近年来，滇重楼野生资源持续掠夺式采挖，加之滇重楼根茎生长周期漫长、生长速度缓慢，生产上亟待筛选出优良种源加以保护利用。皂苷是重楼药材主要有效药用成份[5-6]，重楼皂苷含量及药材质地受栽培环境、土壤、气候等因素影响[7-8]，不同地理种源的滇重楼品质不同，皂苷含量差别较大，这也是滇重楼作为云南传统道地药材最为重要的特点之一。目前对滇重楼报道研究主要集中在化学成分提取分离、药理活性、栽培技术、分子生物学、内生菌等方面，鲜有资源质量评价的研究，系统对云南主分布区滇重楼野生种质资源收集与评价未见报道。丹参（Salvia miltiorrhiza）、黄芪（Astragalus membranaceus）、人 参（Panax ginseng）、山 茱 萸（Cornus officinalis）等茎类药用植物筛选种源时，通常以生长指标和药用成分含量作为筛选标准，因此本研究以根茎生长速度、皂苷成分含量作为优质种源筛选标准较为科学。

本研究选用了目前市面上认可度较高的普洱景东、玉溪澄江、文山丘北、楚雄大姚、曲靖马龙、昭通镇雄、大理剑川、丽江永胜8 个地理种源，通过测定其皂苷含量及生长速度，筛选出皂苷含量较高、生长较快、来源丰富的滇重楼种源，对于滇重楼野生种质资源保护和产业发展意义重大，研究结果可为滇重楼中药材栽培和产业发展提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料的收集与处理

滇重楼种源种质的收集，选择曲靖马龙、玉溪澄江、昭通镇雄、楚雄大姚、大理剑川、丽江永胜、普洱景东、文山丘北共8 个云南省主要地理分布区的地理种源收集[9]。分别采集50 株7 年生野生滇重楼（经西南林业大学曾觉民教授鉴定为滇重楼），实地采样记录样地海拔、经纬度及植被状况等（表1）。

表1 滇重楼不同地理种源地信息表Table 1 Information of different geographical provenances

1.2 试剂

对照品重楼皂苷Ⅰ（YJ-111591）、皂苷Ⅱ（YJ-111592）、皂苷Ⅵ（YJ-111593）和皂苷Ⅶ（YJ-111594）均从中国药品生物制品检定所购买，供含量测定用。乙醇、甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯。

1.3 样品检测与分析

1.3.1 滇重楼样品中重楼皂苷的提取

采用加热回流法提取重楼皂苷。每个地理种源随机抽取20 株根茎部干燥粉碎，40 目的细筛过筛，称取0.5 g 置于100 mL 的圆底小烧瓶。加入25 mL 乙醇后称量（W），80 ℃加热回流30 min；冷却后再次称量，乙醇补足至原来的W；混匀后移取1 mL 至离心管，2 800 r/min 转离心15 min。

1.3.2 高效液相法测定重楼皂苷含量

色谱柱DIKMA 公司LeapsilC18，（100×4.6 mm，2.7 μm），乙腈-水流动相，203 nm 检测波长，30 ℃柱温，1 mL/min 流速，10 μL 进样量。称取对照品适量，加甲醇制成每1 mL 分别含重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ为0.372 08、0.377 34、0.355 64、0.380 00 mg 的混合溶液即得，0.45 μm 的微孔滤膜过滤对照品及样品溶液备用。

1）线性关系分析。由低浓度到高浓度精密吸取重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的标准品溶液10 μL 依次注入色谱仪。分别以进样量、峰面积为横坐标（X）、纵坐标（Y），绘制出标准曲线，计算线性回归方程、相关系数以及相应的线性范围。各标准品在表2范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

表2 滇重楼标样的线性关系考察表Table 2 Calibration data of saponins reference substances

2）精密度试验。精密吸取对照品溶液（0.539 mg/mL）适量，按上述色谱条件重复进样6 次，记录峰面积。RSD 的结果为0.39%，说明所采用仪器的精密度良好。

3）稳定性试验。吸取适量的同一供试品溶液，于放置0、4、8、12、16、24 h 时分别按上述色谱条件进样测定。RSD 的结果表明供试品的溶液在24 h 内稳定性良好。

4）重复性试验。取同一产地样品适量制备供试品溶液，分别在上述色谱条件下测定重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ的含量。RSD 的结果表明：该方法重复性良好。

实验设置3 次重复。

1.3.3 不同地理种源滇重楼的年生长量测定

滇重楼样本栽培于西南林业大学树木园苗圃（25°3′N，102°45′E），70%遮 阴 网 下 统 一 管理。滇重楼地上茎倒苗后，每个种源随机挖取30 株地下根茎称量鲜重后种回，1 a 后再次挖取称量，2 次称量的差值测算每株根茎年增长量和年增长率。

1.4 数据分析

利用EXCEL 进行原始数据整理和统计，SPSS 26.0 进行方差分析、多重比较、相关性和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 滇重楼根茎皂苷含量的种源差异

由表3 可知不同种源滇重楼根茎皂苷含量具有很大差异，皂苷Ⅰ、皂苷Ⅱ、皂苷Ⅵ、皂苷Ⅶ和总皂苷（Ⅰ + Ⅱ + Ⅵ + Ⅶ）含量中，总皂苷含量变异幅度为2.145～15.749 mg/g。其中普洱景东种源含量最高，丽江永胜种源含量最低，前者是后者的7.342 倍，除大理剑川和丽江永胜外6 个种源样品皂苷含量均达到0.6%的药典标准，属于优良种源。不同种源皂苷Ⅰ含量变异范围为0.534～10.639 mg/g，皂苷Ⅱ含量变异范围为1.248～6.793 mg/g，皂苷Ⅵ含量变异范围为0.000～1.208 mg/g，皂苷Ⅶ含量变异范围为0.000～0.546 mg/g。仅普洱景东、大理剑川种源检测出皂苷Ⅵ，大理剑川、文山丘北种源未检测出皂苷Ⅶ。方差分析表明，不同种源滇重楼根茎皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ和总皂苷（Ⅰ + Ⅱ + Ⅵ + Ⅶ）的含量存在极显著差异（P＜ 0.01），8 个地理种源重楼皂苷含量：普洱景东＞玉溪澄江＞文山丘北＞楚雄大姚＞曲靖马龙、昭通镇雄＞大理剑川＞丽江永胜。8 个地理种源滇重楼皂苷成分以薯蓣类的重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ为主，偏诺类的重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ为辅。

表3 不同种源滇重楼皂苷含量差异Table 3 The difference of saponins contents of P. polyphylla var. yunnanensis from 8 provenances mg/g

2.2 滇重楼根茎皂苷含量与气候生态因子的相关分析

由表4 可知，滇重楼根茎皂苷含量与气候生态因子间相关性的显著性检验表明，滇重楼根茎皂苷I 含量与经度及年平均温度、 总皂苷含量与经度及纬度间相关性显著（P＜0.05），相关系数值分别为0.797、0.826、0.787 和-0.725。说明皂苷I 含量与经度、总皂苷含量与经度、皂苷I 与年平均温度间存在非常紧密正相关关系，总皂苷含量与纬度间存在非常紧密负相关关系。总皂苷含量与海拔间相关系数为-0.371，未达到显著水平，存在紧密的负相关性，而总皂苷含量与年均气温和年均降水量间相关系数分别为0.668 和0.672，存在紧密的正相关性。

表4 滇重楼皂苷含量与种源地气候生态因子相关分析Table 4 Correlation analysis of saponins contents and ecological factors of P. polyphylla var. yunnanensis

2.3 不同种源滇重楼根茎生长分析与比较

由表5 可知，不同种源滇重楼根茎生物年生长量及年生长速率具有很大差异，大理剑川种源滇重楼根茎生长速度最快，年生物量为35.3 g，年生长速率为21.41%，远高于其他地理种源，丽江永胜、普洱景东、玉溪澄江种源次之，根茎生物量年生长速率分别为18.70%、17.76%、17.26%；文山丘北、楚雄大姚、曲靖马龙、昭通镇雄4 个地理种源的年生长速率较低，生长速度较慢。多重比较表明，曲靖马龙和文山丘北两地的皂苷根茎生物量年生长速率差异不显著，其他种源根茎生物量之间差异均呈显著差异（P＜0.05）。8 个地理种源的滇重楼根茎生物量年生长速率：大理剑川＞丽江永胜＞普洱景东＞玉溪澄江＞楚雄大姚＞文山丘北、曲靖马龙＞昭通镇雄。

表5 滇重楼不同种源根茎年生长Table 5 Annual growth of rhizomes of different provenances

2.4 不同种源滇重楼聚类分析与优良种源筛选

以滇重楼根茎皂苷含量和根茎年生长速率为特征指标，对8 个滇重楼种源聚类分析。从图1可以看出，以欧氏距离17 为分界阈值，可将滇重楼种源聚类为3 个类群，分别为低皂苷含量、高生长速率类群，高皂苷含量、高生长速率类群和中皂苷含量、低生长速率类群。其中大理剑川和丽江永胜种源属低皂苷含量、高生长速率类群，普洱景东和玉溪澄江属高皂苷含量、高生长率类群，昭通镇雄、曲靖马龙、楚雄大姚和文山丘北属中皂苷含量、低生长速率类群。

图1 不同种源滇重楼总皂苷含量、年生长率聚类分析Fig. 1 Cluster analysis of total saponin contents and annual growth rate in different provenances

通过不同地理种源滇重楼总皂苷含量及根茎年生长速率2 个指标综合比较，普洱景东种源最优，玉溪澄江次之，普洱景东种源和玉溪澄江种源的滇重楼为优质种源。大理剑川、丽江永胜种源的皂苷含量未达到药典要求，但其光合面积大，芽多，根茎年生长量较大，也可以适当引种栽培。

3 结论与讨论

滇重楼皂苷含量与光照强度、日照时数、病虫害、土壤养分、微生物等因素密切相关[10-11]，李泽东等[12]发现日照、温度、营养等影响三七（Panax notoginseng）生长和皂苷类成分的合成。滇重楼为阴生植物，喜斜射光或散光，适宜的遮荫率对重楼生长和产量有重要作用[13-14]。普洱景东地区年均温度18.3℃、年均降雨量1 087 mm，均高于其他种源地，研究发现人参皂苷含量与与日照时数和年降水量呈明显的正相关[15]，故推测其皂苷含量高与日照时数和年降水量高有很大关系。本研究结果显示气温较低地区，滇重楼根茎生长速度并非最慢，推测该地区昼夜温差大，导致根茎生长量积累较多。不同地理种源生物量差异比较大[16]，大理剑川、丽江永胜种源生长快，该两地种源具有矮杆多芽多叶的特点，其光合面积较大故根茎年生长量较大；普洱景东、玉溪澄江种源生长也较快，跟生长期长、芽壮、茎粗而高大等特性有关。降雨量、日照时数、昼夜温差、土壤等因素都会影响其根茎生长速度，本研究皂苷含量与生态因子相关性分析表明总皂苷含量与海拔有一定的负相关性，而总皂苷含量与年均气温和年均降雨量间相关系数存在一定的正相关性，与人参、枸杞（Lycium chinense）、龙葵（Solanum nigrum）等有效成分累积的研究结果一致[17-19]。优良的气候条件是道地药材的形成基础，重楼品质与气温、湿度、土壤pH 值及土壤微生物等有关[20-23]。普洱景东位于云南省中南部，横断山脉南端，属亚热带季风型气候，海拔高、垂直变化明显，年平均气温18.3 ℃，年平均相对湿度77%，年均降水量1086.7 mm，年均日照2 131.6 h，无霜期355 d，非常适合滇重楼生长及生物量积累[24]。昭通镇雄、曲靖马龙气温较低且为单芽滇重楼，故生长最慢。通过聚类分析可将滇重楼种源分为3 个类群，大理剑川和丽江永胜种源属低皂苷含量、高生长速率类群，普洱景东和玉溪澄江属高皂苷含量、高生长速率类群，昭通镇雄、曲靖马龙、楚雄大姚和文山丘北属中皂苷含量、低生长速率类群。

目前，滇重楼栽培生产中存在种源混乱、良莠不齐、品质不佳等诸多问题。利用滇重楼在云南分布区域多样性的特点筛选优质种源，是解决滇重楼产业发展中高品质原材料短缺问题的必要前提。本研究结果显示，普洱景东种源总皂苷含量最高达1.57%，生长速度较快，根茎年生物量为30.1 g，增长率为17.76%，为优质地理种源；不同地理种源中的生长速度差异显著，大理剑川种源生长速度最快，根茎年增长率达21.41%，可以在合适区域种植；综合皂苷含量和根茎生长速度两个指标，玉溪澄江种源也可作为优良滇重楼种源。通过筛选出普洱景东和玉溪澄江种源为优良种源，对于滇重楼野生种植资源保护及产业发展具有一定的科学意义。