miRNA在脓毒症治疗中研究进展

孙文杰 霍景瑞 贾力 刘英富

(1沧州医学高等专科学校,河北 沧州 061000；2沧州市纳米抗体技术创新中心)

最新脓毒症国际共识定义为机体对感染的反应失调而导致的危及生命器官功能障碍〔1〕。脓毒症是一个全球性公共卫生问题，是感染导致死亡的主要原因，据统计在ICU中脓毒症的死亡率要高达20%～45%〔2〕。脓毒症的高死亡率与延迟诊断和治疗不当有直接关系。脓毒症的发病机制复杂且尚未完全明确，目前其治疗手段以抗感染、液体复苏、血流动力学支持等为主。免疫治疗相关靶点药物，包括肿瘤坏死因子(TNF)-α拮抗剂、程序性死亡分子(PD)-1、白介素(IL)-7、干扰素(IFN)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、高迁移率族蛋白(HMG)B1等在实验阶段取得了一定进展，但是临床疗效还未明确〔3〕。微小RNA(miRNA)在细胞和体液中广泛存在，广泛调控免疫细胞的行为及免疫、炎症反应、脏器损伤等多种生理病理过程〔4,5〕，在脓毒症的各个阶段发挥调控作用，有可能成为新型脓毒症治疗靶点，具有重要的研究意义。

1 miRNA的特征及疾病中的应用

miRNAs是一类21～25个核苷酸组成的小分子非编码RNA，在细胞质中合成，以核糖体蛋白复合物、脂质囊泡、外泌体等形式释放到细胞外，不被核糖核酸酶(RNase)消化，在一些体液中稳定存在〔6〕。miRNAs通过囊泡转运或蛋白载体机制被细胞输出或输入，介导组织间的旁分泌和内分泌的通讯，从而调节远端细胞功能。大部分miRNAs靶向mRNA，抑制mRNA转录后翻译或降解mRNA使基因沉默〔7〕，也有少部分诱导转录或上调蛋白的表达〔8〕。

目前在人类基因组中已发现2 000～3 000个miRNAs，广泛调控细胞的分化、增殖、凋亡途径，参与调节代谢、造血分化、免疫及炎症反应等多种生理过程。miRNAs临床应用需要搭载有效的载体，保护其免受RNase降解并递送至感染部位。生物体内miRNAs的理想载体是外泌体，干细胞来源的外泌体有望代替干细胞移植疗法用于疾病治疗〔9〕，而miRNAs的人工载体包括无机材料载体、脂质纳米载体等也取得了一定进展〔10〕。目前miRNAs的研究领域逐渐扩大，涉及肿瘤、帕金森病、阿尔茨海默病、肥胖、糖尿病、心血管疾病、脓毒症等多种疾病〔4,5〕，miRNAs具有成为新型药物靶点的潜力，成为多种疾病研究的热点。

2 miRNA与脓毒症的治疗

脓毒症发病机制复杂，除了病原微生物及其毒素的直接损伤作用，感染导致机体炎症激活状态和免疫功能紊乱，进而导致器官功能障碍甚至危及生命。目前脓毒症的治疗手段和治疗药物都收效有限〔2,3〕。脓毒症中多种miRNAs异常表达，通过介导细胞间信息传递和调控基因表达，调控免疫细胞等增殖、分化、凋亡过程，并调控抗体产生、炎症介质释放等过程。miRNAs对脓毒症过程中通过调控Toll样受体(TLR)信号传导通路，调节炎症因子的产生〔11,12〕。miRNAs可调节脓毒症中内皮细胞的功能，减轻微血管功能障碍，减轻组织器官损伤〔13,14〕。miRNAs参与脓毒症的固有免疫和适应性免疫应答〔15〕免疫抑制及抗感染作用。miRNAs在脓毒症的各个阶段发挥调控作用，有潜力成为新型脓毒症治疗靶点。

2.1miRNA与抗炎作用 脓毒症的主要机制之一是感染激活炎症反应，经一系列炎症因子级联瀑布反应，形成过度炎症状态。miR-146a是脂多糖(LPS)诱导的炎症反应和器官损伤的有效负调节剂。在LPS诱导脓毒症模型中，miR-146a过表达通过靶向酪氨酸蛋白激酶受体(ErbB)4基因，抑制IL-1受体相关激酶(IRAK)1和TNF-α受体相关因子(TRAF)6的表达，抑制核转录因子(NF-κB)的活化，降低TNF-α和IL-1β等促炎因子水平，减少细胞损伤和凋亡，减轻LPS诱导炎症反应和心肌功能障碍〔16〕。LPS诱导巨噬细胞中，miR-146a水平升高，通过靶向跨膜受体Noth蛋白(Notch)1基因，降低IL-1β、IL-6和趋化因子配体(CCL)-2水平，抑制NF-κB激活，减轻炎症反应及脏器损伤〔17〕。

miR-23b在脓毒症中也具有抗炎和保护脏器的作用。在脓毒症患者外周血单核细胞和LPS诱导的单核细胞中miR-23b表达下调，miR-23b通过靶向金属蛋白酶(ADAM)10基因，抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6产生和细胞凋亡，减轻炎症反应〔18〕。Cao等〔19〕发现脓毒症性心肌病患者早期miR-23b上调，miR-23b过表达通过靶向髓样分化因子初次应答基因(MyD)88基因调控TRAF6和NF-κB抑制物激酶(Iκκ)β，抑制NF-κB活化，减少心肌细胞凋亡和炎性因子分泌，减轻炎症反应，提高生存率，是在脓毒症性心肌病的潜在早期疗法。

miR-223、miR-718、miR-181a通过多靶标调节炎症反应。Wang等〔20〕发现，在盲肠结扎穿刺(CLP)脓毒症模型中，miR-223-3p和miR-223-5p显著下调，miR-223通过负向调控信号传导与转录活化因子(STAT)-3和IL-6，抑制炎症反应，保护脓毒症性心肌损伤。miR-718通过靶向肿瘤抑制性磷酸酶与张力蛋白同源性基因(PTEN)基因，调节磷脂酰肌醇激酶/丝氨酸激酶(PI3K/Akt)信号，促进Akt磷酸化，抑制促炎因子IRAK1和NF-κB的产生，而且磷酸化的Akt诱导miR-let-7e表达，下调TLR并弱化促炎信号，减轻炎症反应〔11〕。miR-181a通过直接抑制TLR4的表达、抑制NF-κB活化和活性氧的积累，减少炎症因子的产生，发挥抗炎作用〔12〕。

此外，还有很多miRNA在脓毒症中具有调控炎症反应的作用。miR-15a/16抑制LPS诱导脓毒症炎症途径的关键分子TLR4和IRAK-1，在新生儿脓毒症的炎症反应调控中起重要作用〔21〕。Xu等〔22〕研究发现脓毒症患者血清中的miR-19b-3p水平比健康对照组显著降低，而存活组的脓毒症患者与非存活组相比miR-19b-3p水平显著较高。miR-19b-3p的过表达可以降低IL-6和TNF-α水平，减轻LPS诱导的脓毒症炎症反应，可能是脓毒症患者诊断和预后的潜在靶标。

2.2miRNA与增强免疫功能 在脓毒症进程中，免疫抑制状态长时间持续存在，固有免疫失衡，树突细胞(DC)和巨噬细胞的抗原提呈能力降低，T细胞和免疫抑制细胞因子在损伤部位大量聚集，患者极易受到继发性感染〔23〕，与脓毒症后期的高死亡率直接相关。因此，增强免疫功能对脓毒症治疗尤为重要。

miR-155是调节免疫抑制的潜在靶点。精氨酸酶(Arg)2是DC中主要的酶，miR-155靶向Arg2 mRNA抑制其表达，通过控制细胞外精氨酸的利用来调控T细胞活化〔24〕。CD39+T细胞具有免疫抑制的作用。miR-155可以诱导CD39+T细胞增加，增强免疫抑制，而抑制miR-155可以减少CD39+T细胞，改善免疫抑制状态〔15〕。

髓样抑制细胞(MDSC)可以促进免疫抑制状态。在脓毒症中miR-21和miR-181b通过诱导髓系祖细胞成熟分化，增加MDSC数量，抑制miR-21和miR-181b可减少MDSC，改善免疫抑制状态〔25〕。还有研究发现，miR-375通过阻断酪氨酸激酶(JAK)2-STAT3途径，下调miR-21水平，调控MDSC数量，削弱免疫抑制，参与晚期脓毒症的调节〔26〕。

miRNAs还具有调控T细胞功能的作用。在脓毒症中，miR-31调节Th1/Th2平衡状态，miR-31表达下调促进CD4+T细胞向Th2表型转化，从而促进高炎症状态到免疫抑制状态的转变〔27〕。miR-31在败血性CD4+T细胞中的作用，有助于免疫制剂机制的研究和开发miRNA对脓毒症诊疗的新方法。

2.3miRNA与器官保护作用 脓毒症通常会导致器官功能受损，多器官功能障碍综合征是主要致死原因，而器官保护是治疗脓毒症的一个重要原因。

短暂性缺血引起的缺血预处理是器官保护的先天机制。肾脏缺血预处理可诱导miR-21上调，miR-21在外泌体和远端器官中表达增加，减少对应器官中的细胞凋亡和炎症因子的产生〔28〕。外泌体递送miR-21在脓毒症急性肾损伤中具有抗炎、抗细胞凋亡、保护脏器的作用〔29〕，是其有效的治疗策略。

脓毒症诱导心肌损伤的潜在机制包括心肌收缩力受损、过度炎症、氧化应激、心肌细胞凋亡等。miR-30a-3p过表达通过PTEN/PI3K/AKT信号途径减少脓毒症诱导心肌细胞和肺组织细胞的凋亡，具有保护脓毒症性心肌病和肺损伤的作用〔30,31〕。miR-18a-5p过表达通过下调Notch2表达，抑制内皮-间充质转化和心脏纤维化〔13〕。内皮祖细胞来源的外泌体通过体外递送miR-126-3p和miR-126-5p抑制内皮细胞中HMGB1及血管细胞黏附分子(VCAM)-1水平，减轻脓毒症性器官损伤，预防微血管功能障碍〔14〕。Zheng等〔32〕研究发现在脓毒症患者血清中miR-135a上调，通过p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB途径加重了脓毒症诱导的心肌炎症反应和心脏功能障碍，而miR-135a抑制剂通过调节p38 MAPK/NF-κB途径，能够改善脓毒症诱导的心肌性疾病。在CLP脓毒症模型中miR-214表达上调、miR-214过表达、减轻炎症反应和心肌细胞凋亡，对脓毒症诱发心肌损伤具有保护作用〔33〕。

2.4miRNA与抗感染作用 miRNAs可以调节宿主对抗微生物感染的防御能力，对继发性脓毒症患者抗感染的防治有重要意义。

miRNAs具有抗细菌作用。结核分枝杆菌感染巨噬细胞诱导miR-125a-3p上调，靶向巨噬相关基因(UVRAG)基因，抑制吞噬体的成熟和自噬，而抑制miR-125a的表达可增强巨噬细胞的吞噬功能和杀菌活性〔34〕。沙门菌通过上调肠道上皮miR-128的表达，抑制M-CSF及其介导的巨噬细胞募集，促进细菌存活，而抑制miR-128可增加巨噬细胞募集，抑制沙门氏菌感染〔35〕。

miRNAs具有抗真菌作用。miR-132-5p和miR-212-5p在烟曲霉和白色念珠菌感染期间调节靶基因FK506结合蛋白(FKBP)1B基因、Kruppel样因子(KLF)4基因、多杀菌素合成基因(SPN)的表达，调控自然杀伤细胞(NK)和DC等先天免疫细胞抗真菌的免疫作用〔36〕。miR-204和miR-211通过负调控血红素加氧酶(Hmx)1表达，介导了机体免疫抑制和念珠菌感染型脓毒症引起的肾脏损伤，而miR-204/miR-211模拟物可以显著下调Hmx1，改善念珠菌引起的肾脏损伤〔37〕。

miRNAs还具有抗病毒作用。肠道病毒(EV)-71通过诱导宿主细胞中miRNA-146a上调，抑制IFN产生，而抑制miR-146a可上调IRAK1和TRAF6的表达，增加IFNβ的产生，抑制病毒繁殖并提高感染小鼠的存活率，用于防治EV感染〔38〕。寡核苷酸抑制剂(RG)-101靶向miR-122，通过调控NK细胞，调控IFN水平，显著降低丙型肝炎病毒载量，发挥抗病毒作用〔39〕。miR-134通过调控RAS相关核蛋白(RAN)调节脊髓灰质炎病毒、EV71等病毒的复制〔40〕，为抗病毒感染提供了一种新方法。

2.5miRNA的载体 基于miRNAs的疗法可能是抗过度炎症反应、增强免疫应答、抗微生物治疗、保护脏器功能的有效手段，miRNAs有潜力成为治疗脓毒症的新型靶点，但其临床使用仍存在一些问题，包括核酸的阴离子电荷、亲水性及给药方法和药物设计需要保护miRNA模拟物/拮抗剂免受循环RNase降解、递送系统须确保将miRNAs有效递送至感染部位等。天然存在的miRNAs可以通过液囊或与其相连的蛋白质来保护其免受RNase降解，但治疗性引入的miRNAs需要搭载有效的载体，才能顺利进入细胞并发挥治疗效果。

在生物体，外泌体是miRNAs的理想载体。外泌体是一类由细胞产生的30～100 nm的胞外囊泡，具有稳定、两亲特性、免疫原性低、跨生物屏障等特点，可以作为miRNAs的输送载体转运细胞间的miRNAs等发挥细胞间通讯作用〔41〕。外泌体可以用于脓毒症及其相关脏器损伤的治疗，在炎症反应、免疫抑制、抗原呈递、抗体产生及血管修复等过程中起重要的调节作用〔9，41〕。而且，从间充质干细胞(MSC)纯化的外泌体可起到与MSC相似的治疗效果，有望代替MSC干细胞移植疗法治疗脓毒症〔9〕。Zhang等〔42〕通过研究证明，人脐带间充质干细胞来源的外泌体通过上调miR-146b水平降低IRAK1表达，导致NF-κB活性受到抑制，并最终减轻脓毒症性肾损伤并改善脓毒症小鼠的存活率，可能成为治疗脓毒症相关肾损伤的新型治疗药物。Wang等〔43〕研究发现野生型间充质干细胞含有miR-223的外泌体通过miR-223向受体细胞的转移而减轻脓毒症触发的心肌抑制，下调信号素(Sema)3A和Stat3的表达，从而减少炎症反应和细胞死亡，可对脓毒症小鼠提供心脏保护作用。

miRNAs的人工合成载体也取得一定进展。据研究，脱乙酰化的聚-N-乙酰基葡糖胺(DEAC-pGlcNAc)纳米载体具有良好的生物相容性和非特异性的抗菌性，可以作为miRNAs 载体，在脓毒症小鼠模型中有效地递送miRNA-126-5p免受RNase的破坏，并通过荧光标记成功将其传递到细胞核中，显著提高脓毒症小鼠的存活率〔44〕。此外，miRNAs的病毒载体、无机材料载体、脂质纳米载体、树状聚合物的载体、细胞衍生膜囊泡、3D支架载体在多种疾病研究中都取得了一定进展〔10〕，为miRNAs作为新的脓毒症治疗靶点和治疗途径奠定了基础。

综上，脓毒症是ICU患者高死亡率的主要原因，大量研究证实miRNAs在脓毒症的抗炎、抗感染、增强免疫功能及脏器保护方面具有重要的调节作用，但其潜在机制还不明确。研究结果之间存在差异，可能是由于研究多在ICU或动物实验中进行，研究设计和实验样本等存在差异。miRNAs种类繁多，广泛参与细胞活动，涉及很多信号通路，同一个miRNA可能在感染的不同阶段调节不同的靶标，或同时靶向多靶标产生不同的功能，因此miRNAs的应用中可能产生脱靶效应，限制其疗效和安全性，需要探索其确切机制提高研究的可重复性。患病时长的差异也会在数据中产生干扰，miRNAs水平的纵向研究将提供脓毒症进程中miRNAs表达谱的变化，还需要实验研究区分出最有效的干预靶点，并探讨如何随着疾病进展交替调节miRNAs治疗脓毒症。随着研究的深入，miRNAs可能会成为新型的脓毒症治疗靶标，通过调控炎症反应和免疫功能等，改善患者预后、降低死亡率、改变脓毒症的治疗策略。