基于“浊邪”探讨铁死亡与心肌缺血再灌注损伤的相关性

李鹏飞，徐寒莹，李双娣，成光宇，兰天野，李洪禹，刘爱东

（1.长春中医药大学中医学院，长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，长春 130021；3.长春中医药大学附属第三临床医院，长春 130117）

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指心肌在缺血性损伤的可逆阶段恢复供血后造成的损伤[1]。针对急性心肌缺血性事件，血运重建是有效的治疗策略。已有研究证实早期再灌注治疗可以有效挽救心肌梗死面积[2]，一定程度上降低了急性心肌梗死的早期死亡率[3]。然而，早在1960 年Jennings 等[4]就观察到再灌注会加速心肌细胞损伤，这一观点也在后续研究中被不断验证。再灌注损伤（reperfusion injury，RI）存在着区别于细胞缺血性损伤的病理机制[5]，涉及细胞电生理、能量代谢、微结构等变化以及氧自由基爆发性生成等复杂环节[1]，是对心肌细胞的二次打击，使其成为治疗的“双刃剑”。MIRI 严重影响患者临床获益水平，并为后期心脏病康复管理带来极大负担[6]。因此，亟需新的干预措施来降低MIRI 风险，改善患者的下游生存效果。铁死亡作为一种新型程序性细胞死亡形式近年来受到广泛关注[7]。现有研究表明[8-9]，铁死亡与多个器官再灌注损伤机制存在密切关联。浊邪理论是中医学的重要组成部分，初步形成于秦汉时期，具有丰富的生理、病理内涵及所致独立疾病的自身属性[10]。运用浊邪理论搭建铁死亡机制与MIRI 的桥梁关系，对于拓展MIRI的中医论治角度具有重要意义。本文立足于“浊邪”角度探讨铁死亡与MIRI 的内在关联，为中医药参与MIRI 的预防和治疗提供理论依据。

1 浊邪概念与致病特点

“浊”与“清”相对，为液体浑浊之意。中医学对“浊”的阐释最早可追溯至《内经》，书中将“浊”的生理与病理内涵进行了简要区分[10-11]。“浊”的生理含义有二：《素问·经脉别论》言“食气入胃，浊气归心，淫精于脉”，可见“浊”为饮食精微物质中稠厚的部分。《素问·阴阳应象大论篇》中“清阳出上窍，浊阴出下窍”也可见其还有代谢废物之意。“浊”的病理含义有二：其一为《灵枢·逆顺肥瘦》中所言“其血黑以浊”，为血液稠浊之意。其二指阴邪，《灵枢·忧恚无言》中“两泻其血脉，浊气乃辟”既可体现。《内经》也设立了《灵枢·阴阳清浊》作为专篇探讨了清浊的概念、来源、阴阳属性与相互关系，为浊邪理论的发展奠定了理论基础。《金匮要略·脏腑经络先后病脉证》中首次提出了“浊邪”之名，其中“清邪居上，浊邪居下”体现出“浊”作为一种病理邪气具有重着趋下的属性。

浊邪有“无形”与“有形”之分，无形之浊气氤氲于清窍、脏腑、经脉，病状虽不显著，但机体已处于邪气蓄势的量变之态。若浊气、浊阴不能及时消散，结聚为阻碍气血津液运行的痰、湿、水、瘀，胶结凝滞形成“浊毒”，此即为浊邪由无形之态向有形之实转变的过程。浊邪属阴，病性归属为因脏腑虚衰而导致的“因虚致实”。历代医家对浊邪的理解存在差异，但并未影响其作为关键致病因素在疾病中的重要作用。浊邪理论现已广泛应用于糖尿病、肥胖、冠心病、动脉粥样硬化、慢性肾脏病的治疗[12]，成为中西医探讨同一疾病不同认识的交流纽带。

2 铁死亡概念与调控机制

2.1 铁死亡特征概述 铁死亡是一种调节性细胞死亡形式，以铁依赖性与脂质过氧化物沉积为主要特点。早在2003 年，Stockwell 团队筛选并鉴定出化合物Erastin 可以诱导肿瘤细胞出现不可逆转的非凋亡性细胞死亡[13]。在后续研究中，研究者发现铁螯合剂与亲脂性抗氧化剂可以有效阻断这种细胞死亡[14]，并在2012 年正式将其命名为“铁死亡”。铁死亡的形态特征以线粒体结构改变为主，包括线粒体体积减小、膜密度增加[7]。铁死亡的生化特征主要表现为铁与活性氧（reactive oxygen species，ROS）累积，细胞抗氧化能力破坏。在遗传特征方面，Dixon 等人通过沉默了铁代谢相关基因的表达可对细胞产生保护性作用，进一步证明铁死亡存在着独特的遗传调控网络和其鲜明的铁依赖特征[7]。细胞死亡是细胞正常新陈代谢过程中的重要环节，铁死亡具有可调节性，通过对铁死亡过程中铁代谢、脂质过氧化等关键环节的调控，可以实现对疾病的有效干预。

2.2 铁死亡的调控机制 铁死亡具有复杂的调控机制，因铁代谢紊乱而造成的铁沉积是铁死亡发生的第一步骤。细胞内活跃的Fe2+来源于不稳定铁池、铁蛋白自噬和含铁细胞器代谢降解3 个主要途径。细胞外的Fe3+与转铁蛋白（transferrin，Tf）结合经转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TfR1）进入细胞。内涵体上的金属还原酶3 将Fe3+还原为Fe2+后由二价金属离子转运体转运至细胞质内，存储于铁池[15]。过量铁可以储存于铁蛋白能有效避免铁离子参与ROS 生成，起到保护性缓冲作用，但铁蛋白的自噬降解会增加细胞内铁含量，增加铁死亡敏感性[16-17]。Fe2+与通过Fenton反应产生高活性的羟基自由基，可以与细胞膜脂启动过氧化反应。脂质双分子层的不饱和程度直接影响铁死亡的敏感性[18]。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）作为细胞膜磷脂的主要组成成分，最易受到ROS 攻击，也是发生脂质过氧化的原料底物[19]。脂质过氧化的启动机制尚未完全明确，当前考虑以酶促或非酶促两种形式启动，此两种形式均需要铁作为催化因子[19]。非酶促方式可能是由Fenton 反应产生的自由基启动，在酶促方式中，细胞色素P450 氧化还原酶、脂氧合酶家族等铁依赖性酶类发挥了重要催化作用，这些酶类会加速脂质过氧化物到达诱发铁死亡的临界阈值[20]。

2.2.1 System xc-/GSH/GPX4 调控 谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是一种过氧化物分解酶，可以分解脂质过氧化物，是铁死亡的调控核心因子[18]。GPX4 受到抑制后导致细胞抗氧化能力减弱[21]。GPX4 以谷胱甘肽（glutathione，GSH）作为底物，GSH 合成直接影响GPX4 活性。胱氨酸是合成GSH 的前体，细胞外的胱氨酸被胱氨酸谷氨酸转运受体（system xc-）摄取并转运至细胞内部参与GSH 合成。system xc-/GSH/GPX4 也是目前铁死亡领域内研究最为成熟、经典的上游调节通路，促进System xc-，增加GSH 合成，提高GPX4 活性可以降低细胞氧化损伤风险[18]。system xc-由一条重链基因（SLC3A2）和一条轻链基因（SLC7A11）组成，可受到多种途径调节，其中与核因子NF-E2 相关因子（Nrf2）相关的Nrf2/keap1[22]，与肿瘤抑制因子p53 相关的p53/SLC7A11[23]是较为代表性的下游通路。

2.2.2 FSP1/CoQ10/NAD（P）H 调控 铁死亡抑制蛋白-1（ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）是平行于GPX4 的另一个关键的铁死亡调节因子。在GPX4 失活条件下，FSP1 过表达仍起到抗铁死亡作用，在敲除FSP1 后，GSH 水平也未受到影响[24-25]，可见FSP1 具备独立的作用机制。FSP1 的N 端存在肉豆蔻酰化修饰的序列，有助于FSP1 与脂质双分子层结合，进而发挥抑制脂质过氧化的作用[24]。在抗铁死亡过程中，FSP1与辅酶Q10（CoQ10）存在协同效应，FSP1利用NAD（P）H 将CoQ10 还原为泛醇进而阻止脂质过氧化传播[24-25]。FSP1/CoQ10/NAD（P）H 是一条独立于GPX4 的新型铁死亡调节通路，然而二者均是通过调节细胞抗氧化能力干预下游脂质过氧化环节实现对铁死亡的调控。

2.2.3 GCH1/BH4 调控 具有抗氧化性质的四氢生物蝶呤（BH4）也可通过将CoQ10 还原为泛醇的途径阻滞脂质过氧化物生成。BH4 在酶催化位点存在铁的情况下，是芳香族氨基酸、神经递质和一氧化氮所必需的辅因子[26]，参与炎症反应、氧化应激等重要病理过程[27]。BH4 缺乏可致一氧化氮合酶解偶联和ROS生成[28]。GTP 环化水解酶1（GTP cyclohydrolase1，GCH1）既是BH4 合成的催化酶，也是限速酶，对于维持人体内BH4 动态平衡至关重要。通过基因筛选证实GCH1 是铁死亡的抑制基因，BH4 与BH2（BH4 的氧化型）是过表达GCH1 产生抗铁死亡作用的来源[26]。在铁死亡诱导剂处理的细胞中，GCH1 过表达可以上调CoQ10 水平，进而对细胞产生保护作用[26]。另有研究表明[29]，GCH1/BH4受到抑制后会激活铁蛋白自噬，进而提升细胞Fe2+水平，增加铁死亡敏感性。此外，BH4 还具有改善心室舒张功能、抑制心肌纤维化的作用，可以有效预防MIRI，其具体作用机制包括阻止血管紧张素Ⅱ浸入心肌，以及对于PI3K/Akt[30]、cGMP/PKG[31]等通路的调节。

3 浊邪理论与MIRI 的病因病机关联

3.1 中医学对MIRI 的认识 中医学理论未明确定义“再灌注损伤”的相关概念，但仍可发现与其相关的描述。《素问·痹论》：“脉痹不已，复感于邪，内舍于心。”《玉机微义》言：“然亦有病久气血虚损及素劳作赢弱之人患心痛者，皆虚痛也。”均体现出在已有心系疾病的基础上有再损伤的表现。MIRI 属中医“胸痹”范畴，其病机是在脏腑本虚的基础上浊邪滞留于心之脉络，气血运行不畅以致心脉痹阻，引发心脉痹阻的浊邪可为痰、瘀、湿等缠结产物。当前阶段，对MIRI 的致病浊邪的研究侧重于痰浊与血瘀，这与现代医学对于MIRI 诱发病因的认识密切相关。

3.2 浊邪理论与MIRI 的病因病机关联 MIRI 本质应属心之血脉病变。基于现代医学理论角度，血液是心脏功能活动的物质前提，血管是心血管病变的解剖基础。血液成分与循环状态是影响发挥心脏生理功能的重要因素，血液成分异常会直接造成血液流变学改变并影响血管内皮的屏障作用与分泌功能。基于中医学理论角度，血是有形有质的精微物质载体，脉为血之运行通道，脉络与血可相互影响引发气血运行失常。MIRI 病性为本虚标实，由原发病引起的心体受损是本虚之因，再灌注后的二次损伤为虚上加实。机体在未复流期间已处于脏腑虚衰的正虚之态，气血无力推动血液正常运行，局部心肌失养并出现因虚致瘀、因虚湿聚、因虚痰凝等浊邪壅滞的表现，浊邪久滞加重局部气血运行不畅，也可使津液留聚成饮，这均成为后续复流阶段出现损伤的影响因素。再灌注治疗意味着在心脉痹阻之处通过物理性手段将其再次疏通，使局部气血运行得以复通。然而，此类“破血”“破气”“豁痰”的治法会导致气血骤然冲泻，体内阳气妄动进而生风动血，更加耗损人体正气，加剧阴阳失衡状态[32]。血液骤然恢复且血流量高于缺血前水平会形成局部心肌的充血反应，并伴随着心肌细胞内外的离子环境、PH值急剧变化，影响细胞代谢稳态，进而诱发细胞的损伤与死亡[33]。经过再灌注治疗后心肌仍存在微血管阻塞（microvascular obstruction，MVO），心肌MVO 区域也伴随着微血管破坏现象，导致心肌内出血进而影响心功能[34]。MVO 可以合理解释再灌注治疗后血管中存在的微小栓子对心肌血液循环造成的隐患。微栓子与浊邪所具备的黏滞、稠浊之性存在潜在共性，即便在血管再通后也会加剧了血液的黏聚程度，改变血液流变学与动力学特点，成为加剧再灌注后心肌损伤的重要原因。

4 浊邪理论与MIRI 铁死亡的关联

4.1 MIRI 与铁死亡 心脏是一个高耗能器官。反复损伤加剧了心肌细胞代谢异常，最终导致细胞死亡，这其中就包括了由铁代谢异常、氧化应激反应、线粒体损伤等机制共同介导的铁死亡[35]。已有研究证明抑制铁死亡对MIRI 的保护性作用[9]，Gao 等发现应用谷氨酰胺（参与合成GSH）分解抑制剂或铁螯合剂均能够显著减轻离体心脏模型的再灌注损伤。受损后的心肌对于外界刺激的耐受性已明显降低，细胞内的铁代谢也随之发生变化。已有研究证实再灌注心肌存在铁过载现象[36]。许多铁调节蛋白对环境变化十分敏感，缺血缺氧环境下铁调节蛋白活性降低，Tf 表达上调，在缺氧诱导因子 HIF-1α 的刺激下TfR 基因转录被激活，可达到常氧环境下的8 倍[37]，可见细胞对铁的摄取能力增强。在心肌缺血缺氧期间，红细胞会大量裂解并释放出具有细胞毒性的血红素，导致心肌细胞直接受损并且引起铁离子水平急剧升高[38]。此外，血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，Hmox1）作为血红素分解代谢过程中的限速酶。心肌缺血状态下，Hmox1 活性增强，可介导血红素分解，也会释放大量游离铁[39]。研究表明[35]，应用Hmox1 抑制剂或敲除上游调控分子Nrf2 可减轻心肌细胞铁蓄积。在过量铁暴露的环境下，ROS 快速生成并累积，直接增加了心肌细胞氧化应激的易感性[40]。ROS既是RI的参与者也是病理产物，会逆向加剧心肌细胞损伤程度。线粒体是ROS 产生的主要场所，也是细胞铁代谢的核心部位，线粒体通过Fenton/Haber-Weiss 机制代谢H2O2诱导氧化应激反应，过量ROS 会刺激线粒体氧化应激进而导致ROS 生成的恶性循环。无论是急性的ROS 暴露还是慢性ROS累积均会损伤线粒体的生物能力进而导致功能障碍，可见线粒体通过调控铁代谢、氧化应激反应及ROS 生成影响着心肌细胞铁死亡[41]。

4.2 浊邪理论与铁死亡 血液充盈、心气充沛、脉道通利是心正常行使生理功能的必要保证，由心、血、脉的所构成的循环体系有序运行对人体正常生命活动的具有重要意义。在经历了原发性心肌损伤后，心血生成不足，心气无力推动，气血亏耗以致无法保证心之血脉系统有序运转，人体处于阴阳失衡，正气亏损的病理状态。心肌因缺血缺氧损伤而出现的红细胞大量裂解、线粒体的氧化应激反应、白细胞与炎症因子的趋化作用、PH 值急剧变化引发酸中毒等表现都会损伤人体正气，也是诱发MIRI 的危险因素。血管再通后血流会迅速涌入血管，Bolli 等[42]报道再灌注后最初10 分钟就可见到骤然产生的大量ROS，这些ROS 在后续出现的心肌顿抑中起到重要作用。

在MIRI 过程中，多种细胞异常代谢互为影响，使心肌细胞呈现出铁过载、抗氧化能力降低的状态，为诱导铁死亡营造出有利环境。铁沉积、大量ROS 及脂质过氧化产物是心肌细胞铁死亡的代表性病理产物，也是导致细胞死亡的直接原因。毒性代谢产物在细胞内的沉积与中医理论对于痰、瘀、湿等浊邪痹阻心脉而致胸痹发病的观点不谋而合。脉道为气血运行之通道，与现代医学中“血管”的生理功能相同[43]。毒性病理产物会损伤血管内皮功能，加剧动脉粥样硬化程度、诱导易损斑块形成。浊邪阻滞可致脉络狭窄或闭塞则影响血液正常循环，中医学称之为“脉道艰涩不利”。痰是人体物质代谢过程异常时产生的过量病理性产物的累积，既是致病因素也是诱发其他类型浊邪产生的重要条件。现有文献报道显示[44]，血脂、血糖、免疫球蛋白、病毒感染后大量复制的抗原抗体等均是痰浊产生的物质基础，而ROS 等机体代谢产物被视为是启动病理产物的痰向致病因素的痰转变的激活剂，这与中医学对“浊邪”向“浊毒”的转变过程的认识存在潜在的共通点，也是值得中医研究者开展科学研究的创新角度。血瘀是各种原因而导致的血液运行不畅，停滞于局部的表现，血瘀的成因与局部的微循环障碍、血液动力学和血液成分异常相关[45]。铁死亡过程中的脂质过氧化作用与浊邪化毒病因机制存在潜在共通性，脂质过氧化物是浊邪质变化毒的产物，铁死亡过程中涉及的铁代谢、脂代谢紊乱、抗氧化功能损伤是浊邪致病潜在的生物学机制，也是日后亟待验证的重要课题。

5 小结

浊邪理论内涵广泛。本文对浊邪的生理、病理特性进行简要分析，阐述了铁死亡的特征与调控机制，并通过分析MIRI中医病因病机、铁死亡的中医学内涵，运用浊邪致病特点解释了MIRI 与铁死亡的关联。细胞死亡对于疾病发生发展起到至关重要的作用。铁死亡是MIRI 过程中的关键细胞死亡类型，探究铁死亡调控机制，对于日后开展中医药预防、改善MIRI 后的心功能降低有长远意义。本课题组在前期致力于研究具备宣痹、通瘀、化浊功效的中药复方在改善血液流变学、预防血栓形成、促进血管新生等方面的作用机制。血液流变学与血液成分的异常是浊邪生成的直接原因，铁离子、血脂蛋白等血液成分是参与铁死亡过程的主体元件，可见浊邪与铁死亡存在共有的物质基础。浊邪胶结凝聚，渐成浊毒的过程与脂质过氧化物过量沉积损伤细胞存在潜在联系。以痰、瘀、湿、气等浊邪的生成作为切入角度探究MIRI 铁死亡过程中出现的铁代谢异常、氧化应激反应、细胞抗氧化能力受损等关键环节具有广阔的研究前景与良好的临床转化价值，在日后的研究中，中医研究者们也可继续拓展研究思路，将浊邪的病理特性与现代医学理论中MIRI 的相关机制进行结合，以求新的突破。