基于网络药理学与分子对接的“鬼箭羽-白花蛇舌草”治疗子宫内膜异位症的作用机制研究

王 珺，徐传花

（1.南京中医药大学研究生院，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学附属常州市中医医院妇科，江苏 常州 213000）

子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）是指子宫内膜组织（腺体和间质）出现在子宫体以外的部位，是一种激素依赖性的疾病，临床常以痛经、慢性盆腔痛、月经失调、不孕等为主要症状。近年来EMT 发病率为10%～15%，严重影响患者的身心健康[1]。目前EMT 以药物和手术治疗为主，虽在临床中取得了较好疗效，但仍存在周期长、易复发、不良反应明显等弊端。因此，寻找新的治疗药物具有极高的临床价值和广阔的市场前景。EMT 在古医籍中无确切病名记载，但根据其主要症状与体征，可归属于“痛经”“癥瘕积聚”“月经不调”“不孕”等范畴。唐容川《血证论》曰：“离经之血，虽清血鲜血，亦是瘀血”[2]。中医认为，该病常因外感或情志不调等因素，致使经血瘀阻胞宫，血不归经，不通则痛所致，主要病机为血瘀，治疗当以活血化瘀为大法。徐传花教授经过长期临床经验总结，常用鬼箭羽-白花蛇舌草药对治疗EMT，颇具成效。鬼箭羽性寒味苦，《神农本草经》中记载鬼箭羽“主女子崩中下血，腹满汗出，除邪，杀鬼毒虫注”[3]。现代药理学研究表明[4-7]，鬼箭羽具有多重临床功效，如抗糖尿病、降脂、降压、降糖、抗肿瘤、抗过敏、抑菌、抗炎、抗氧化、减轻心肌损伤等作用。白花蛇舌草性寒味苦淡，寒性清热，苦味燥湿，研究表明其具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫的作用[8-11]。当前对于“鬼箭羽-白花蛇舌草”药对的研究较少，其作用于EMT 的机制尚未被阐述清楚。网络药理学具有整体性、系统性的特点，将系统生物学、生物信息学与药理学相结合，是研究中药和疾病复杂关系的有效方法。本研究拟采用网络药理学方法，通过对鬼箭羽-白花蛇舌草治疗EMT 的活性成分和作用靶点进行预测，探讨其治疗EMT 的作用机制，为后续临床应用提供新的理论依据和研究方向参考。

1 资料与方法

1.1 鬼箭羽-白花蛇舌草活性成分筛选 应用中药系统药理学数据库与分析平台（https://tcmsp-e.com/，TCMSP），以“鬼箭羽”“白花蛇舌草”为检索词查找药物化学成分，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 的标准进行筛选，得到鬼箭羽和白花蛇舌草的主要活性成分。

1.2 鬼箭羽-白花蛇舌草活性成分靶点预测 通过PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到药物活性成分的Canonical SMILES，将其代入SwissTargetPrediction 平台（http://www.swiss targetprediction.ch/）进行药物靶点的预测。

1.3 获取子宫内膜异位症相关靶点 利用GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）、人类孟德尔遗传数据库（https://www.omim.org/，OMIM）、TTD 数据库（http://db.idrblab.net/ttd/），以“endometriosis”为检索词，获取子宫内膜异位症相关靶点。在GeneCards 数据库获得相关靶点后，由于靶点较多，故按照上述方法计算出子宫内膜异位症靶点Relevance Score 的中位数为0.74，设定Relevance Score＞0.74 为进一步筛选条件。将3 个数据库所获得靶点去除重复后得到总靶点。

1.4 鬼箭羽-白花蛇舌草活性成分与子宫内膜异位症靶点网络的构建 利用在线工具Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）取鬼箭羽-白花蛇舌草活性成分靶点与EMT 靶点的交集，获得共同靶点。然后使用Cytoscape 3.9.1 软件进行“中药-活性成分-靶点”网络构建并进行拓扑分析筛选出鬼箭羽-白花蛇舌草药对作用于子宫内膜异位症的关键化合物。

1.5 共同靶点的富集分析 利用DAVID 2021 在线数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对共有靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。GO 分析主要包括生物学过程（biological processes，BP）、细胞组分（cellular components，CC）、分子功能（molecular functions，MF）。

1.6 共同靶点蛋白-蛋白互作（PPI）分析 应用STRING 11.5 在线数据库（https://cn.string-db.org/）进行共有靶点PPI 分析，以最小相互作用分值0.7分作为阈值。通过使用Cytoscape 3.9.1 软件拓扑分析出PPI 中关键靶蛋白。

1.7 分子对接 通过RCSB PDB 数据库（https://www.pdbus.org/）获得PPI 中度值靠前的关键靶点蛋白的结构，再由TCMSP 平台下载“鬼箭羽-白花蛇舌草”药对关键化合物的结构，采用Discovery Studio2019对靶点蛋白与关键化合物进行分子对接，根据得到的LibDockScore 值评价靶点蛋白与关键化合物的结合情况。

2 结果

2.1 鬼箭羽-白花蛇舌草主要活性成分筛选 利用TCSMP 数据库共获得鬼箭羽24 个活性成分、白花蛇舌草37 个活性成分，以OB≥30%，DL≥0.18 为筛选条件，筛选后共获得15 个有效活性成分，其中鬼箭羽8 个、白花蛇舌草7 个，其中Quercetin 槲皮素、beta-sitosterolβ-谷甾醇为共有成分，即共有13个有效成分，见表1。

表1 鬼箭羽-白花蛇舌草的主要活性成分

表1 （续）

2.2 鬼箭羽-白花蛇舌草活性成分作用于EMT 的靶点筛选 将得到的13 个有效成分通过PubChem 数据库得到药物活性成分Canonical SMILES，将其代入SwissTargetPrediction 平台进行药物靶点预测，一共获得696 个主要靶点，其中鬼箭羽564 个，白花蛇舌草487 个，合并筛除重复项后共得到靶点366 个。GeneCards、OMIM、TTD 3 个数据库所获得疾病靶点取并集得到总靶点1721 个。

2.3 鬼箭羽-白花蛇舌草活性成分 应用Venny2.1.0在线软件取二者交集，共获得130 个共有靶点，见图1。

图1 鬼箭羽-白花蛇舌草活性成分与在子宫内膜异位症交集靶点韦恩图

2.4 EMT 靶点网络 应用Cytoscape3.9.1 软件制作“中药-活性成分-靶点”网络图，见图2。并进行拓扑分析得出度值前4 的化合物为：Quercetin 槲皮素（度值46）、Kaempferol 山柰酚（度值45）、（2R）-5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one（2R）-5，7-二羟基-2-（4-羟基苯基）色满-4-酮（度值 45）、5，7 -dihydroxy -2 -（3 -hydroxy -4 -methoxyphenyl）chroman-4-one 5，7-二羟基-2-（3-羟基-4-甲氧基苯基）色满-4-酮（度值38），这些可能是在EMT 治疗中发挥重要作用的关键化合物。

图2 中药-活性成分-靶点网络图

2.5 共有靶点的GO 分析、KEGG 富集分析 将鬼箭羽-白花蛇舌草药对治疗EMT 的130 个共有靶点导入DAVID6.8 在线数据库，进行GO、KEGG 富集分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。GO 富集分析显示，BP 共富集到493 个条目，主要为凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化、基因表达的负调控、炎症反应、对药物的反应等；CC 共富集到63 个条目，主要为细胞质、胞质溶胶、质膜、细胞外空间、质膜的组成部分等；MF 共富集到126 个条目，主要为相同蛋白质结合、ATP 结合、酶结合、蛋白激酶活性、血红素结合等，见图3。KEGG 分析主要富集129 个条目，将按P值由升级排序前20 的条目前绘制气泡图，主要为癌症通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、化学致癌-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌-活性氧等，见图4。

图3 GO 富集分析BP、CC、MF 三合一柱状图

图4 KEGG 富集分析气泡图

2.6 PPI 分析及关键基因筛选 应用STRING11.0 在线数据库以默认值为条件构建共有靶点PPI 蛋白互作网络图，无游离靶点，并导入Cytoscape 3.9.1 软件进行拓扑分析，计算出PPI 中靶点度值排名前20个，主要包 括STAT3、SRC、EGFR、AKT1、MAPK3等，这些蛋白靶点是鬼箭羽-白花蛇舌草药对治疗EMT 的关键靶点，见图5。

图5 鬼箭羽-白花蛇舌草药对活性成分与子宫内膜异位症基因的PPI 网络

2.7 分子对接 采用Discovery Studio2019 对PPI 中度值前5 位靶点蛋白与鬼箭羽-白花蛇舌草药对的4 个关键化合物进行分子对接，得到分子对接吻合度（LibDockScore 值），一般认为其＞90 时配体与受体结合活性较高，值越大则活性越高。结果显示LibDockScore＞90 的有19 种，见表2，其中MAPK3与5，7-二羟基-2-（3-羟基-4-甲氧基苯基）色满-4-酮、山柰酚、槲皮素，AKT1 与5，7-二羟基-2-（3-羟基-4-甲氧基苯基）色满-4-酮结合度最高，表明“鬼箭羽-白花蛇舌草”关键化合物与关键靶点蛋白分子对接吻合度活性较高，与网络药理学筛选结果较为符合。LibDockScore 排名前4 位的分子对接情况见图6。

图6 LibDockScore 前4 位分子对接情况

表2 鬼箭羽-白花蛇舌草关键化合物与关键靶点分子对接LibDockScore 分值汇总

3 讨论

EMT 多发于生育期妇女，是导致痛经、不孕和慢性盆腔痛的主要原因之一，具有性激素依赖的特点，其病变广泛、形态多样、极具侵袭性和复发性。EMT 发病机制复杂，目前主要有种植学说、体腔上皮化生学说、诱导学说[12]。而种植学说包括Sampson经血逆流、血管及淋巴转移、医源性种植学说，其他发病机制有免疫炎症学说、干细胞理论、遗传及相关基因表达和调控异常等[13]。研究表明，EMT 与性激素、炎症、免疫、遗传等因素皆密切相关。

EMT 内膜组织周期性出血，故中医学称为“离经之血”。血瘀是贯穿其发生发展过程的中心环节，也是EMT 最基本的病理基础。瘀血阻滞，气血运行不畅，不通则痛，引发痛经；瘀滞日久化热，则形成热证；瘀血内停，阻滞冲任胞宫，不能摄精成孕，故婚久不孕。

EMT 的治疗药物主要分为非甾体类抗炎药（NSAID）、孕激素类、复方口服避孕药（COC）、促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）及中药5 大类[14]。因EMT 无法治愈，药物治疗需持续使用到绝经或计划妊娠时，患者生育后亦应尽快继续恢复药物长期管理，且极易复发[14]。有研究显示[15]，口服中药复方相比西药治疗EMT，在一定程度上能提高临床有效率、痛经缓解率、妊娠率，同时不良反应发生率低。鬼箭羽-白花蛇舌草药对是徐传花教授根据临床经验所拟制的核心药对，鬼箭羽破血通经，白花蛇舌草清热解毒，临床疗效显著。

本研究基于网络药理学筛选出鬼箭羽-白花蛇舌草中治疗EMT 的关键化合物为槲皮素、山柰酚、（2R）-5，7-二羟基-2-（4-羟基苯基）色满-4-酮、5，7-二羟基-2-（3-羟基-4-甲氧基苯基）色满-4-酮。研究表明[16]，槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用，通过下调CLDN6 表达，抑制ILK 信号通路，抑制异位内膜生长。亦有研究表明[17]，槲皮素能抑制EMT 细胞End1/E6E7 的增殖，促进细胞凋亡，且能促进Bax 的表达，抑制Bcl-2 的表达，进一步说明其可促进异位细胞凋亡。山柰酚能通过抑制转录因子激活蛋白1（AP-1）和MAPK 信号通路，抑制MMP-9 的活性，从而抑制癌细胞黏附、迁移和侵袭[18]，降低IL-6、IL-17A 等细胞因子，抑制炎症发生[19]。（2R）-5，7-二羟基-2-（4-羟基苯基）色满-4-酮是柚皮素的一种，具有抗炎、免疫调节、神经保护的作用[20]，其在激活MAPK 通路的同时可提高JUK 与p38 的磷酸化，调节线粒体膜电位，使活性氧增加（ROS），脂质过氧化和DNA 片段化，导致细胞凋亡[21]。5，7-二羟基-2-（3-羟基-4-甲氧基苯基）色满-4-酮属于类黄酮的一种，具有抗炎、抗肿瘤的作用，在多种癌症治疗中发挥作用[22]。

本研究通过PPI 互作网络并拓扑分析得出度值排名靠前的STAT3、SRC、EGFR、AKT1、MAPK3等靶点，可能是鬼箭羽-白花蛇舌草治疗EMT 的核心靶点。STAT3 在体内多种组织和细胞中均有表达，磷酸化后被激活，进而参与细胞的增殖、侵袭转移、分化等各种生物学行为，且在多种肿瘤细胞中STAT3 均呈持续激活状态[23]。SRC 是最早被发现的核受体辅激活子，实现对靶基因转录的调节作用，其中SRC-2 是孕酮受体（PR）的优势辅激活子，SRC-2 表达下降会显著减弱子宫PR 对孕激素的反应性，SRC-2 表达缺失抑制PR 介导的子宫内膜蜕膜样变化[24]。EGFR 是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，在调节细胞的生长、增殖、分化、黏附等方面起重要作用，促进机体生长发育[25]。研究表明[26]，EGFR介导的MMP-7 上调在EMT 发生发展过程中，通过ERK1-AP1 轴促进上皮-间质转化，在妊娠早期调节子宫内膜功能方面也发挥着重要作用。AKT1 在发病过程中可促进子宫内膜基质细胞的增殖、迁移及侵袭能力，降低其凋亡及自噬能力，发挥作用[27]。MAPK3 能将细胞外信号传导至胞质及胞核内，参与调控细胞增殖、分化、雌激素表达、凋亡等过程，尤其在异位组织的侵袭和转移中发挥中介和信号放大的作用[28]。

功能富集分析显示，鬼箭羽-白花蛇舌草治疗EMT 主要涉及的生物过程有凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化、基因表达的负调控、炎症反应、对药物的反应等；细胞组分有细胞质、胞质溶胶、质膜、细胞外空间、质膜的组成部分等；分子功能有相同蛋白质结合、ATP 结合、酶结合、蛋白激酶活性、血红素结合等。鬼箭羽-白花蛇舌草在治疗EMT 上涉及多个重要通路，包括癌症通路、糖尿病并发症的AGERAGE 信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、化学致癌-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌-活性氧等，提示其在治疗EMT 方面在抑制炎性反应、氧化应激、细胞增殖和癌症的发生发展等生理病理过程中具有关键的调控作用。其中，AGE/RAGE信号通路主要与抑制炎症反应相关，可激活多种细胞内信号通路，包括NADPH 氧化酶、蛋白激酶C 和MAPKs，进而导致NF-κB 活化，促进如IL-1、IL-6、TNF-α 等炎性细胞因子和多种动脉粥样硬化相关基因的表达，参与机体免疫、炎症反应及细胞的增殖分化[29]，其治疗EMT 可能通过抑制这些趋化因子，从而抑制炎症反应[30]。同时，其还可通过降低血管内皮生长因子VEGF 的表达，抑制血管生成、阻碍内异灶生长，达到延缓EMT 的发展。另外，研究还发现EMT 有着类似于低度恶性肿瘤的特性，如种植、侵袭、远处转移等特点，与癌症的发生和发展关系密切。鬼箭羽-白花蛇舌草药对中多种成分具有诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、转移、侵袭的作用。因此，推测鬼箭羽-白花蛇舌草对EMT 发展为恶性肿瘤存在一定的预防和治疗作用，为进一步研究其配伍组方提供了一些依据。

分子对接结果显示，MAPK3 与5，7-二羟基-2-（3-羟基-4-甲氧基苯基）色满-4-酮、山柰酚、槲皮素，AKT1 与5，7-二羟基-2-（3-羟基-4-甲氧基苯基）色满-4-酮结合度最高，表明鬼箭羽-白花蛇舌草关键化合物与关键靶点蛋白分子对接吻合度活性较高，与网络药理学筛选结果较为符合。因此，鬼箭羽-白花蛇舌草药对可能通过以上关键靶点干预EMT 的相关通路，达到改善或者治疗EMT 的作用。

综上所述，鬼箭羽-白花蛇舌草药对治疗EMT具有多成分、多靶点、多通路的特点，其治疗EMT 的机制可能主要体现在炎症反应、细胞增殖凋亡、激素分泌和癌症的发生发展中。由于网络药理学本身的局限性，本研究结果还需得到更多实验数据的支持，不过这对以后进一步探究和分析鬼箭羽-白花蛇舌草药对的有效成分与特殊靶点之间的作用机制有一定的参考意义，也为治疗EMT 提供了新思路。