晚期食管鳞状细胞癌患者外泌体PD-1/PD-L1 的表达与PD-1 单抗免疫治疗效果的关系

沈辉，陆坤，陈茜，辛勇

食管癌为癌症相关性死亡的第6 大主要原因，流行病学调查结果显示，其发病率呈逐年上升的趋势，给人类的健康带来巨大威胁［1］。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是一种常见的食管癌病理类型，约占食管癌的90%［2］。近年来，随着免疫治疗的快速发展，免疫检查点抑制剂在胃癌等多种恶性肿瘤的疗效已被证实，免疫检查点抑制剂主要针对细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白-4（cytotoxic T lymphocyte-associated protein-4，CTLA-4）、程序性细胞死亡受体1（programmed cell death receptor 1，PD-1）、PD 配体1（PD-ligand 1，PD-L1）［3］。PD-1 主要分布于NK 细胞、B 细胞以及T细胞中，PD-L1 可与PD-1 结合来抑制抗肿瘤免疫应答，从而发挥增强局部抗肿瘤功能［4］。免疫检查点抑制剂纳武单抗为抗PD-1 IgG4 单克隆抗体，其在非小细胞癌、肝细胞癌、ESCC 等多种恶性肿瘤中取得良好疗效，但部分患者5 年生存率仍不甚理想［5］。外泌体为一种细胞外囊泡（直径为30～100 nm），肿瘤早期大量外泌体会进入循环细胞，检测外泌体上PD-1、PD-L1 有助于疾病的精准治疗与早期诊断［6］。目前，国内有关晚期ESCC 患者外泌体PD-1/PD-L1的表达与PD-1 单抗免疫治疗效果的关系的研究较少，为此，本研究选取收治的95 例晚期ESCC 患者进行研究。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019 年2 月至2021 年11 月徐州医科大学附属宿迁医院收治的95 例晚期ESCC 患者为研究对象。纳入标准：（1）均符合《中国早期食管鳞状细胞癌及癌前病变筛查与诊治共识（2015 年，北京）》［7］中ESCC 的诊断标准，且均经术后病理学证实；（2）均行PD-1 单抗免疫治疗；（3）至少有1 个可测量病灶；（4）预计生存期＞3 个月；（5）美国东部肿瘤协作组活动状态评分0～1 分；（6）均签署知情同意书。排除标准：（1）中枢神经系统转移；（2）活动性感染；（3）获得性或先天性免疫功能缺陷；（4）合并其他类型恶性肿瘤者；（5）有自身免疫疾病史；（6）肝肾等脏器功能不全者；（7）间质性肺炎；⑧伴远处转移者。

1.2 研究方法

1.2.1 治疗方法 95 例患者均接受PD-1 单抗免疫治疗。静脉输注卡瑞利珠单抗（批准文号：S20190027，苏州盛迪亚生物医药有限公司，规格为200 mg/支）1 支/次，静脉输注时间大于30 min，每3 周1 次，持续用药至患者不能耐受或疾病进展。

1.2.2 外泌体PD-1、PD-L1 的表达的检测方法 通过乙二胺四乙酸抗凝管采集患者4 ml 静脉血，于4 ℃下2 000 g 离心20 min，取上清液（血浆）用1.5 ml EP 管分装，于-80 ℃冰箱中保存，通过超速离心法从血浆中分离外泌体（离心半径为8 cm），首先300 g离心10 min，随后2 000 g 离心10 min，然后10 000 g离心30 min，最后将上清液100 000 g 离心70 min，离心完成后将外泌体重悬于磷酸盐缓冲液中，于-80 ℃冰箱中保存。采用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（美国BD 公司）测定表型，圈出CD14 单核细胞门，建立针对CD14-FITC/PD-1-PE 与CD14-FITC/PD-L1-PE 的峰图，分析外泌体PD-1、PD-L1 表达率。

1.2.3 治疗效果判定 治疗3 个疗程后，参照《实体瘤免疫治疗疗效评价标准》［8］，根据患者治疗效果分为有效组（n=43）与无效组（n=52）。完全缓解：原病灶及临床症状消失，且持续超过4 周，部分缓解：原病灶缩小＞50%，临床症状明显改善，且持续超过4 周，疾病稳定：原病灶增幅≤25% 或增大≤50%，临床症状未见减轻，且持续超过4 周，疾病进展：原病灶增大＞25%或出现新病灶，临床症状恶化。其中，部分缓解与完全缓解记为有效；疾病进展与疾病稳定记为无效。

1.2.4 收集资料 收集可能影响晚期ESCC 患者PD-1 单抗免疫治疗无效的危险因素，包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、基础疾病（高血压、高脂血症、糖尿病）、肿瘤最大直径、肿瘤部位（颈椎、胸椎、腹部）、淋巴结是否转移、T 分期、分化程度、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、细胞角蛋白19 片段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen21-1，Cyfra21-1）、外泌体PD-1、PD-L1 表达率。

1.3 观察指标

（1）比较有效组与无效组的临床资料；（2）分析晚期ESCC 患者PD-1 单抗免疫治疗无效的危险因素；（3）分析外泌体PD-1、PD-L1 表达率对晚期ESCC 患者PD-1 单抗免疫治疗无效的预测价值。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 有效组与无效组的临床资料比较

无效组年龄、低分化例数占比、CEA、外泌体PD-1 表达率和PD-L1 表达率高于有效组（P＜0.05）。见表1。

表1 有效组与无效组晚期食管鳞状细胞癌患者的临床资料比较

2.2 晚期ESCC 患者PD-1 单抗免疫治疗无效的危险因素

以年龄、分化程度、CEA、外泌体PD-1 表达率、PD-L1 表达率为自变量（赋值情况：年龄、CEA、外泌体PD-1 表达率、PD-L1 表达率为连续变量；分化程度：低分化=1，中高分化=0），以晚期ESCC 患者PD-1 单抗免疫治疗效果为因变量进行Logistic 多因素回归分析（赋值情况：无效=1，有效=0），结果显示，年龄、低分化、外泌体PD-1 表达率、PD-L1 表达率为晚期ESCC 患者PD-1 单抗免疫治疗无效的危险因素（P＜0.05）。见表2。

2.3 外泌体PD-1、PD-L1 表达率对晚期ESCC 患者PD-1 单抗免疫治疗无效的预测价值

ROC 曲线结果显示，外泌体PD-1、PD-L1 表达率预测晚期ESCC 患者PD-1 单抗免疫治疗无效的AUC 值（95%CI）分 别 为0.785（0.689～0.863）、0.706（0.604～0.795），差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 外泌体PD-1、PD-L1 表达率对晚期食管鳞状细胞癌患者PD-1 单抗免疫治疗无效的预测价值

3 讨论

晚期ESCC 已错过最佳手术时间，临床上常采用化疗来提高患者的生存率。PD-1 单抗免疫治疗为一种新型的恶性肿瘤治疗模式，其在ESCC、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中取得良好效果［9］。但部分患者的肿瘤细胞能够通过多种机制来逃避免疫杀伤，严重影响PD-1 单抗免疫治疗效果［10］。PD-1能够调节相关细胞凋亡与活化；PD-L1 通常表达于肿瘤中活跃的T 细胞炎症区域中，其在免疫细胞与肿瘤细胞上表达能够抑制T 细胞抗肿瘤反应，进而抑制肿瘤生长［11］。临床研究表明，外泌体PD-1/PDL1 表达与多种恶性肿瘤的预后密切相关，然而二者可用于评估接受PD-1 单抗免疫治疗的ESCC 患者的效果目前尚不清楚，鉴于此，本研究特采用前瞻性研究进行分析，期望为指导临床治疗提供一定的参考价值［12］。

本研究结果显示，无效组年龄、低分化例数占比、CEA、外泌体PD-1、PD-L1 表达率高于有效组，Logistic 多因素回归分析结果显示，年龄、低分化、外泌体PD-1、PD-L1 表达率为晚期ESCC 患者PD-1单抗免疫治疗无效的危险因素。随着年龄的增长，人体的免疫功能逐渐下降，年龄较高的晚期ESCC患者免疫功能较低，即使采用PD-1 单抗免疫治疗，其预后不良的风险仍然较高。低分化的晚期ESCC患者肿瘤恶性程度高，临床治疗难度较高，多数患者治疗效果不佳。外泌体PD-L1 为PD-1 单抗免疫治疗的重要靶点，其可与PD-1 结合，发挥负性调节作用，使T 细胞无法正常活化，抑制CD4+T 细胞功能，从而影响患者抗肿瘤作用［14］。相关研究表明，外泌体PD-L1 能够调节肿瘤细胞自身的生物学行为，参与肿瘤的发生、发展及预后其在多种恶性肿瘤中异常表达［15-16］。相关研究表明，在抗PD-1 治疗前检测黑色瘤患者外泌体PD-L1 蛋白，结果显示，低水平外泌体PD-L1 蛋白的患者通常表现为部分应答或完全应答，而对治疗无响应的患者外泌体PD-L1 蛋白水平一般很高［17］。另有研究表明，外泌体外泌体PD-L1mRNA 表达水平与非小细胞肺癌、黑色素瘤患者抗PD-1 治疗响应密切相关，经PD-1单抗治疗后，病情稳定组外泌体PD-L1mRNA 表达水平降低不明显，而响应组外泌体PD-L1mRNA 表达水平明显下降，而病情恶化组PD-L1mRNA 表达水平异常升高［18］。既往研究证实，Cyfra21-1、CEA等肿瘤标志物可用于评估和诊断ESCC 进展，然而生物标志物灵敏度较低［19-20］，本研究结果未证实Cyfra21-1、CEA 与PD-1 单抗免疫治疗效果密切相关，可能与样本量、病情严重程度等因素有关。此外，本研究结果显示，外泌体PD-1、PD-L1 表达率预测晚期ESCC 患者PD-1 单抗免疫治疗无效的AUC 值（95%CI）分 别 为 0.785（0.689～0.863）、0.706（0.604～0.795），提示晚期ESCC 患者外泌体PD-1、PD-L1 表达可用于评估PD-1 单抗免疫治疗效果，值得推广使用。

综上所述，晚期ESCC 患者外泌体PD-1、PD-L1表达在预测PD-1 单抗免疫治疗效果中具有重要价值。然而，本研究纳入病例较少，仍需扩大样本，进一步证实研究结果。