黄果茄中绿原酸超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性

郭蒙　郭纯　蒋青　高林晓

关键词：黄果茄；绿原酸；超声波辅助提取工艺；工艺优化；抗氧化活性

中图分类号：R284 文献标识码：A

黄果茄系茄科茄属直立草本植物，在我国星散分布于贵州、四川、台湾等地，而国外也可见于其他热带亚洲、大洋洲以及非洲等地[1]。一直以来，中外科研人员对黄果茄的研究非常重视，近年的研究主要集中在成分、药理等方面，展现出一定的经济开发价值。XU 等[2]从黄果茄果中分离出2 个具有16，17-仲胆甾烷骨架的甾体皂苷，而刁克鹏等[3]从其果中分离出黄酮（6 个）、酰胺（4 个）、香豆素（2 个）等12 个单体，其中5-羟基-8-甲氧基-6，7-亚甲二氧基黄酮为未见报道的化合物。CHAUDHARY 等[4]用高效薄层色谱法（high-performance lamina liquid chromatography，HPTLC）分别对黄果茄根、茎、果中的茄定碱和薯蓣皂苷元同时进行定量分析，以帮助草药的质量控制。李学玲等[5]研究发现，用气质联用分析鉴定出黄果茄果的挥发性物质22 种，其中醛酮类、脂类为主要成分，分别为51.03%、32.70%，而在最优化条件下，总黄酮提取率可达4.35%，并对清除DPPH·、·OH 均展现出较好的效果[6]，此外，SHIVNATH 等[7]发现黄果茄果醇提取物可通过促进软骨细胞生存和增殖来改善骨关节炎。USMAN 等[8]研究发现咖啡酸、咖啡酸甲酯、东莨菪碱、七叶苷等次生代谢物具有抗糖尿病、抗衰老等性能。GUPTA 等[9]发现，黄果茄果中分离出的槲皮素能够提供更好的肝脏防御作用，从而可预防肝毒性。NATARAJAN 等[10]报道，黄果茄的甲醇提取物能够治疗微生物伤口感染，并有成为抗菌剂的潜力，尤其对科氏葡萄球菌菌株更有效。CHOUDHARY 等[11]和REDDY 等[12]分别发现黄果茄全株的水和脂提物具有免疫抑制、抗癌等的特性。ZAMAN 等[13]利用黄果茄果样品颗粒作为吸附剂直接从水溶液中去除亚甲蓝，吸附能力可达到0.051 mmol/g。此外，李学玲等[14]用水提法优化了黄果茄果中绿原酸的提取工艺，提取率为0.28%。

绿原酸广泛存在于双子叶植物中药材或食物中[15]，具有抗氧化、抗菌等药理作用[16-17]，目前仍需要拓宽绿原酸的新来源[18-19]。绿原酸的化学提取主要有水提、醇提、酶提等方法，尤其超声辅助醇提法的绿原酸具有更加稳定、收率高和溶剂易回收等特性[20]，本研究拟用超声辅助醇提取黄果茄中绿原酸。此外，高效的单因素实验仅能得出较粗略的参数范围，而正交试验设计并不能明确回归方程，因此，通过响应面法建模，以期得到更加准确的工艺条件[21]，为其今后的工业开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 成熟的黄果茄果实采自贵州都匀。

绿原酸标准品（纯度≥98%），维生素C 标准品（Vc，纯度≥98%，合肥博美生物科技公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，纯度≥98%），2，2-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）（ABTS，纯度≥99%，合肥巴斯夫生物科技有限公司），过硫酸钾（分析纯，北京化工厂有限责任公司）；无水乙醇（分析纯，成都金山化学试剂有限公司）。

1.1.2 仪器与设备 T6 新世纪紫外可见分光光度计购于北京普析通用仪器有限公司；AR224CN电子天平购于奥豪斯仪器公司；KH2200DE 数控超声波清洗器购于昆山禾创超声仪器公司；80-1电动离心机购于金坛市城东新瑞仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 绿原酸标准曲线制作 称取绿原酸标准品0.0010 g，适量乙醇溶解后，转移至100 mL 容量瓶定容，得到浓度为0.1 mg/mL 溶液。准确移取0.20、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 的标准溶液分别于7 个容量瓶（10 mL）中，純乙醇定容，静置15 min。纯乙醇作空白对照，在波长为328 nm 下分别测吸光度A 值[19， 22]。以绿原酸样品浓度C 与吸光度A 绘制标准曲线图，得到二者关系：A=48.1297C–0.0107（R²=0.9941）。

1.2.2 黄果茄果绿原酸提取流程 常规流程如下：样品→自然晾晒→烘箱烘干→粉碎、过筛→超声乙醇提取→离心→绿原酸醇提液。

将干燥的黄果茄果粉碎成末，过孔径40 目筛，得样品粉末。称0.25 g 粉末置于具塞比色管中，后以拟定工艺参数提取（定100 W 超声功率），自然冷却至室温，离心，取上清液，即为样品醇提液。

1.2.3 黄果茄果绿原酸的测定 取超声后的样品醇提液0.5 mL，用纯乙醇定容至10 mL，静置15 min，在波长为328 nm 下测吸光度，代入上述回归方程，进一步计算，即可得到绿原酸提取率。

1.2.4 单因素实验设计 单因素实验工艺参数设计见表1。

1.2.5 Box-Behnken 响应面实验设计 据上述实验结果，设计Box-Behnken 响应面实验，见表2。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力 最佳工艺条件下黄果茄果醇提物和Vc 用无水乙醇配制成不同浓度的待测液，并用无水乙醇配制0.20 mmol/LDPPH 溶液[23]。取2 mL DPPH 溶液与2 mL 无水乙醇或不同浓度的2 mL 待测液避光混合，37 ℃水浴保持30 min，517 nm 处测吸光度，分别记为A₁和A₂。DPPH 清除率计算公式：

DPPH 清除率=（A₁– A₂）/A2×100%

1.3 数据处理

所有试验均重复2 次，试验数据以平均值±标准差表示。采用Design expert V8 软件进行响应面设计和分析，采用Excel 软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇浓度对黄果茄绿原酸得率的影响 图1 结果表明，乙醇浓度低于35%时，提取的绿原酸量增加幅度相对较小，最终稳定在1.79%左右。这表明，水含量较多时不利于目标产物绿原酸的提取。随着乙醇浓度逐渐增加到65%，绿原酸提取率迅速增加到最大值3.50%。因此，后续实验将拟定乙醇浓度在65%。但是，乙醇浓度继续增加，反而会抑制绿原酸提取，原因可能是溶剂的低极性会致使强亲脂性等物质的溶出减少[25]。

2.1.2 液料比对黄果茄绿原酸得率的影响 图2结果显示，绿原酸提取率随着液料比的增加呈逐渐增大的趋势，并在50 mL/g 附近得到最佳值（约4.57%），与液料比为10 mL/g 时的绿原酸提取率相比，提取率值增加了约2 倍。而在液料比60 mL/g附近的目标物提取率略微降低，其原因可能是液料比过大导致黄果茄醇提取物增加了一些难溶物，为了后续实验节省成本等原因，后续实验选取液料比的最适宜值为50 mL/g[18]。

2.1.3 超声时间对黄果茄绿原酸得率的影响 由图3 可知，提取时间较短或较长均不利于黄果茄绿原酸的提取，最适合的时间值为60 min。提取时间较短时，绿原酸显然不能够充分溶出，而提取时间较长时，样品中可能会溶出更多的非目标物，影响到目标物的稳定。最终选定最佳时间为60 min[20]。

2.1.4 超声温度对黄果茄绿原酸得率的影响 由图4 可知，较低的超声温度不能够保证足够多的黄果茄绿原酸克服其周围的环境阻力而溶出[26]，从而导致绿原酸提取率相对较低，而较高的温度也会抑制绿原酸提取。温度适当时，传质扩散系数的增加会明显增加提取效率，在40 ℃时可以得到最优化的提取率值。

2.2 响应面分析实验

以黄果茄绿原酸的提取率为评价指标，Box-Behnken 实验结果及分析见表3、表4，而由Design Expert V11 可以得到二次多元回歸方程：Y=–225.05+4.93α+1.15β+0.75γ+0.94δ–3.75×10^–3αβ+2.50×10^–4αγ+1.30×10^–3αδ–5.08×10^–3βγ–1.75×10^–4βδ–5.25×10^–4γδ–0.04α²–5.56×10^–3β²–4.09×10^–3γ²–0.01δ2，R²为0.9967。

由表4 可知，F 值为303.35，P<0.0001，说明本实验模型达到了极显著水平；失拟项P 为0.1115>0.05，说明此项不显著。因此，选择实验模型成功，其预测性好、误差较小，可进行进一步的操作。一次项β、δ 和二次项α²、β²、γ²、δ²及交互项αβ、βγ 等8 项对响应值影响极显著，而其他项均不显著。由比较F 值可知，响应增加的顺序为：乙醇浓度<超声时间<超声温度<液料比。

黄果茄中绿原酸提取率的响应面和交互作用见图5。交互项αβ、βδ 等2 项呈现出椭圆形，响应面坡度较陡，交互作用大，但其他4 项的响应面图坡度较缓，交互作用不显著。

2.3 优化与验证试验

通过响应面方程得到最佳工艺参数（64.7%乙醇浓度、55.8 mL/g 液料比、56.0 ℃超声40.5 min）下目标产物的提取率为6.81%。考虑到实际工业生产的可操作性，将最优化条件适当调整为65%乙醇、60 mL/g 液料比、55 ℃下超声40 min，则黄果茄绿原酸得率的3 次平均值为6.83%。此值与理论值非常接近，表明选择的响应面条件稳定可行。

2.4 提取物体外抗氧化能力

2.4.1 DPPH 自由基清除能力 如图6 所示，与Vc 溶液的DPPH 清除率不同，提取液的DPPH 清除率在10～60 mg/L 范围内随着浓度增加而增大，呈现出明显的线性关系，且二者的IC₅₀值分别为18.4、55.7 mg/L。提取液中绿原酸等的酚羟基可提供质子，因此对清除DPPH 有一定的效果。

2.4.2 ABTS 自由基清除能力 如图7 所示，在5～30 mg/L 测试范围内，提取液的ABTS 清除率与其浓度线性相关性强，在提取液为30 mg/L 时，提取液的ABTS 清除率达到最大值，为65.5%。Vc 溶液和提取液的IC50 值分别为6.5、20.1 mg/L，因此Vc 溶液的清除率在测试范围内更好一些。

3 讨论

植物内次生代谢产物的绿原酸主要来源于金银花花蕾、杜仲叶、咖啡豆等，其提取物不仅可用于日用化工和医药等行业[27]，还可作为新型饲料添加剂用于畜禽生产[28]。用水、乙醇或二者混合物等作为溶剂可以促进植物中绿原酸的提取，尤其添加醇水混合物提取物中的绿原酸与其天然状态更接近，但仅添加水作溶剂，其高沸点会致使提取物杂质较多，不利于后续的纯化[15]。超声、微波和二者协同辅助作用均有利于目标物的提取，但考虑到微波参与时，高介电常数的水更有利于微波吸收，而超声辅助能够显著地克服萃取时间较长、回收率较低等缺点[29]。此外，蒲公英叶和野菊花等作为绿原酸的新来源，提取率分别为3.92%和2.86%，尤其栀果中绿原酸提取率可高达5.68%[19， 30]。因此，本研究将超声辅助醇提法应用到黄果茄果中绿原酸的提取中，单因素实验确定液料比等因素对提取率的影响，还用响应面法建立二次回归模型，得到最佳工艺条件，后修正的条件为65%乙醇浓度、60 mL/g 液料比、55 ℃下超声40 min，绿原酸产率可达到6.83%。

在亚健康状况下，人体细胞代谢产生的自由基极可能会导致身体机能下降。植物粗提物中成分较为复杂，为了初步判断其组分或类型等对自由基清除能力的影响，本研究选用了DPPH 和ABTS 等2 种抗氧化体系来进一步评价黄果茄果醇提物的抗氧化性能[31]。黄果茄果醇提物显然具有较好的抗氧化活性，其最佳工艺条件下提取液的DPPH 和ABTS 自由基清除能力的IC₅₀分别为55.7、20.1 mg/L。该实验可为探索黄果茄中绿原酸的药理作用等应用提供依据，还可为实现黄果茄中绿原酸作为药用、保健品、畜禽生产等提供借鉴。