利用CRISPR/Cas9技术创制广亲和水稻温敏雄性不育系

段敏 谢留杰 高秀莹 唐海娟 黄善军 潘晓飚,*

利用CRISPR/Cas9技术创制广亲和水稻温敏雄性不育系

段敏1谢留杰1高秀莹2唐海娟2黄善军1潘晓飚1,*

(1台州市农业科学研究院 作物研究所, 浙江 临海 317000；2南京农业大学 作物遗传发育国家重点实验室, 南京 210095；*通信联系人, email: xbpan163.com)

【目的】为突破传统杂交转育方法对水稻两系不育系选育的限制，利用CRISPR/Cas9技术对籼型恢复系台恢31的温敏雄性核不育基因进行编辑，以获得全新水稻温敏雄性不育系。【方法】选择水稻温敏不育基因第1外显子的2段序列作为靶点，构建双靶点pHUE411--gRNA载体，通过农杆菌侵染获得116株T0代转基因植株。【结果】经鉴定获得3种类型纯合突变体、和，每一种突变均导致TMS5氨基酸序列的缺失。分期播种试验结果显示，幼穗分化敏感期温度为27℃时，和自交结实率分别为0.56%、0.03%，表现为高度不育，而则完全不育。与野生型台恢31相比，不育系（即）单株穗数增多，穗长变短，株高及每穗总粒数相较WT均下降25%，花药发白瘦小，无花粉粒充实，柱头、颖壳没有显著差异。幼穗分化4期时进行温度处理，确认的育性转换温度为26℃。分别与籼、粳型恢复系配组，F1的结实率超过90%。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对籼型恢复系台恢31的温敏雄性核不育基因进行编辑，获得能够稳定遗传的水稻广亲和温敏雄性不育系，为两系不育系选育提供新的技术支撑。

CRISPR/Cas9；水稻；幼穗分化敏感期；自交结实；育性转换温度

水稻是我国第一大粮食作物，自20世纪60年代三系杂交水稻问世后，我国的水稻产量发生了第一次质的飞跃。随后光温敏核不育水稻的发现，又为水稻杂种优势的利用开辟了新途径。1996−2014年，我国有900多个两系杂交水稻品种通过审定，目前年推广面积550万hm2左右[1]。两系杂交水稻已经成为我国水稻生产中不可或缺的类型。

光温敏雄性核不育基因是两系不育系的核心，它与不育系的育性稳定性、育性转换有最直接的联系[2]。随着分子生物学技术的发展，许多光温敏核不育基因被成功定位及克隆，例如光敏核不育基因[3]、[4]、[5, 6]，光温敏核不育基因[7]等。光敏雄性不育基因大部分是由农垦58S 转育而来的，而温敏雄性不育材料较为丰富，不育基因来源广泛。目前已经定位的温敏核不育基因有[8]、[9]、[10]、[11]等数十个位点，其中是少数已被克隆的功能基因。编码一个保守短板RNA酶Z，命名为RNase ZS1。单个碱基突变导致安农S-1和株1S中RNase ZS1编码蛋白质的翻译提前终止。通过RNA-seq的方法找到了RNase ZS1加工的基因UbL40（泛素核糖体L40蛋白）。RNase ZS1能够将3个UbL40的mRNA加工成多个片段，在温敏不育系中由于RNase ZS1功能的缺失，不能正常加工UbL40，使其过度积累引起了雄性不育；而常规品种中的UbL40的mRNA能被RNaseZS1正常降解，不会造成积累，育性正常[12]。

CRISPR/Cas9是一种由导向RNA介导的基因组定向编辑技术[13]，通过非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）和同源重组（homologous recombination, HR）实现对基因组DNA的定点敲除、替换、插入等精准修饰[14]，目前已成功应用于如水稻、玉米、小麦等多种作物的重要农艺性状遗传改良。CRISPR/Cas9技术最大特点是只对生物自身的内源基因进行编辑和改造，并非外源基因转入，可消除民众对改造后的作物存在安全隐患的顾虑。2022年，农业农村部制定《农业用基因编辑植物安全评价指南（试行）》为基因编辑材料在我国的应用和推广指明了方向。近些年有不少研究者针对温敏核不育基因进行编辑，获得了多个粳型[12, 15-16]、籼型[17-18]的不育系资源。本研究以自主选育的具有广亲和性的水稻籼型恢复系台恢31为研究材料，利用CRISPR/Cas9技术对其进行编辑，以期获得具有广亲和性的籼型温敏不育系，扩大配组范围，丰富水稻两系不育系资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料及载体

水稻材料台恢31为偏粳型广亲和恢复系CR84与偏籼型恢复系K6093杂交后，经数代自交选育出的含有广亲和位点的籼型F6代品系。该品系具有广亲和性好、每穗粒数多、柱头大且外露率高等特点。CRISPR/Cas9载体pHUE411、中间载体pCBC- MT1T2由南京农业大学张红生实验室馈赠。

1.2 基因编辑靶位点的选择

水稻光温敏核不育基因（LOC_Os 02g12290）全长1895 bp。登录Arizona大学网站(http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html)，选取PAM（protospacer adjacent motif）序列（NGG）上游20个寡核苷酸作为靶点，并利用Cas-OFFinder网站(http://www.rgenome.net/cas- offinder/)评估脱靶情况，同时在水稻基因组数据库中比对靶序列的特异性。

1.3 双靶点pHUE411-TMS5-gRNA载体构建

参考Chen等[19]方法，稍作修改。1）PCR扩增。以中间载体pCBC-MT1T2质粒为模板，根据同源重组法原理设计双重引物T5T1-BsF/BsR及T5T1-F0/R0扩增gDNA（gRNA对应序列），引物包含2个去掉离NGG最远端碱基的19 nt大小的靶位点（表1）。2）酶切-连接体系建立。纯化回收上述PCR产物，建立15 μL反应体系：2 μL回收产物；2 μL载体质粒pHUE411；1.5 μL 10×T4 缓冲液；1.5 μL 10×BSA；1 μLⅠ内切酶；1 μL 高浓度T4连接酶，加水补足至15 μL。反应条件为37℃下酶切5 h，50℃下连接5 min，80℃下处理10 min以终止反应。3）转化及阳性验证。取5 μL连接液，利用电转法转化大肠杆菌DH10B感受态，Kan板筛选。以单克隆菌落为模板，设计引物T5U3-F/R进行PCR扩增，片段大小为831 bp。验证为阳性的单克隆提取质粒，根据载体信息设计正向引物T5-SF1、T5-SF2测序。引物序列见表1。

1.4 T0代转基因植株阳性验证及突变位点分析

测序验证正确的大肠杆菌质粒转化农杆菌EHA105，将PCR检测阳性的克隆用于水稻愈伤组织的转化。参考唐海娟[20]方法稍作修改，以台恢31成熟水稻种子诱导的胚性愈伤组织为受体，经根癌农杆菌侵染创制转基因植株。

采用改良的CTAB法提取T0代转基因水稻叶片的DNA，分别利用T5U3-F/R及潮霉素引物HYG-F/R进行阳性验证，以验证转基因是否成功。转基因成功的单株以引物T5-F/R扩增的第1外显子并测序，检测靶序列是否发生突变。

测序鉴定为杂合突变的T0代转基因单株，经自交结实获得T1代种子。提取T1代叶片DNA，继续扩增潮霉素标记以寻找不含载体的无Cas9单株。针对无Cas9单株，以引物T5-F/R扩增的第1外显子并测序，寻找靶序列发生纯合突变的单株，通过生物软件DNAMAN分析突变类型。扩增潮霉素引物HYG-F/R及第1外显子的引物T5-F/R序列见表1。

1.5 不育系花粉育性鉴定及TB52S农艺性状调查

纯合突变体于2021年5月14日至6月14日分4期播种，每期间隔10 d，记录播始历期，以野生型台恢31作对照。同时，在试验地旁安装温度记录仪，每隔30 min记录一次，用以统计幼穗分化敏感期的平均温度。本研究中，将水稻始穗期前20 d开始，持续7 d的时期定义为幼穗分化敏感期。

盛花期后，每种突变体选择3个主穗，用I2-KI染色观察花粉育性，同时在镜检取样的单株上另选1穗套袋自交，30 d后统计结实率。取同时期突变体和WT未开放的小花，置于体式显微镜下观察。成熟期时，突变体选择15个单株，以台恢31作对照，分别考查株高、分蘖、每穗粒数、穗长等农艺性状。

表1 本研究涉及的PCR扩增及测序引物

下划线表示靶位点

The two target sites are underlined.

1.6 不育系TB52S育性转换温度鉴定

大田环境下生长的不育系，当主茎幼穗发育至4期左右时移入光照培养箱，分别进行温度、光照处理。温度处理设置23℃、24℃、26℃、30℃，光照条件为14 h光照/10 h黑夜。光照处理设置12 h光照/12 h黑夜、13 h光照/11 h黑夜、14 h光照/10 h黑夜、15 h光照/9 h黑夜，温度条件为30℃。每个处理3个单株，以台恢31作为对照。处理12 d后置于自然条件下正常生长。盛花期后鉴定花粉育性及自交结实率，方法同1.5。

1.7 不育系TB52S配合力分析

2021年初在海南陵水基地，不育系分别与籼、粳型恢复系测配，2021年正季将杂交F1播种于海南小溪基地，成熟后选取中间5株，统计结实率、千粒重、每穗总粒数等相关数据。

2 结果与分析

2.1 gRNA靶点的设计

光温敏核不育基因（LOC_Os02g12290）全长1895 bp，由6个外显子组成，编码302个氨基酸。登录网站http://www.genome.arizona.edu/ crispr/CRISPRsearch.html，选择第1外显子的2个PAM（protospacer adjacent motif）序列（NGG）前20 nt的寡核苷酸作为靶点，以确保该基因能够被编辑，2个靶点之间相距400 bp（图1-A）。利用Golden gate克隆技术[21]，将2个目标序列连入终载体pHUE411，组成双元表达载体pHUE411--Cas9（图1-B）。

图1 gRNA靶点的位置(A)及终载体pHUE411-TMS5-Cas9组成(B)

Fig. 1. Targets site of gRNA (A) and structure of pHUE411--Cas9 (B).

2.2 T0代tms5突变体的鉴定

以台恢31成熟水稻种子诱导的胚性愈伤组织为受体，将构建好的表达载体pHUE411--Cas9经根癌农杆菌侵染转入其中，得到T0代植株。采用改良的CTAB法提取T0代转基因水稻叶片的DNA，分别利用T5U3-F/R及潮霉素引物HYG-F/R进行阳性验证。电泳结果显示，116个T0代单株均能扩增出506 bp大小的潮霉素片段以及831 bp大小的载体+基因片段（图2）。

以引物T5-F/R扩增所有阳性T0代植株的第一外显子并测序，相应的编辑位点序列与台恢31作对比。测序结果显示，所有T0代单株在的第一个靶点位置均呈现双峰，双峰的位置一般在编辑序列第6或第7个碱基开始（图3）。结合PCR及测序结果，认为阳性T0代单株属于突变杂合型。

2.3 无载体的tms5纯合突变株的筛选与鉴定

为了获得无载体的纯合突变单株，将T1代种子播种成苗，抽穗前提取单株DNA，继续以T5U3-F/R及潮霉素引物HYG-F/R进行分析，结果表明，213个T1单株中有49个不含表达载体。继续对49个无载体的单株进行第一外显子序列测序，共获得25个纯合突变株，包含3种类型的突变。3种突变均在靶点2末端有1个碱基插入，靶点1的序列略有差异。如突变体T31-9，靶点1附近缺失7个碱基；突变体T31-100的靶点1附近缺失10个碱基；突变体T31-155的靶点1缺失1个碱基（图4）。靶点1的序列缺失使得蛋白翻译提前终止（图5）。

2.4 tms5突变体育性鉴定及TB52S农艺性状观察

综合测序结果，将T31-9类型突变体命名为，T31-155类型命名为，T31-100类型命名为。3种突变体分期播种于试验田，育性鉴定结果列于表2。可以看出，随着播种日期的延迟，不育系的播始历期逐渐缩短，3种突变体的在同一播始历期内基本一致。分析I-IV期播种株系幼穗分化敏感期平均温度与相对应不育系的自交结实率可以发现，当幼穗敏感期平均温度超过27℃时，3个不育系自交结实率均为0。当幼穗敏感期平均温度为27℃时，和自交结实率分别为0.56%、0.03%，表现为高度不育，花粉经I2-KI染色亦可看到极少数的可育花粉，而则完全不育（图6）。以上结果说明相较于其他2个不育系，的不育性更为稳定彻底，其育性转换温度低于27℃。将作为重点对象分析，命名为。选择5月24日播种于大田的不育系与野生型比较田间性状。与野生型相比，成熟期单株穗数增多、穗长变短；株高达86.1 cm，每穗总粒数243.17，二者相较WT均下降近1/4水平（图7-A、B；表3）。盛花期将及WT的小花置于解剖镜下观察，可以发现的花药发白瘦小，无花粉粒充实，柱头、颖壳没有显著差异（图7-C）。综上所述，的突变导致恢复系台恢31呈现出花粉不育、矮秆、多分蘖等不育系的特征。

M―标记；1～24―T0单株。A―潮霉素标记, 条带大小506 bp；B―载体+基因片段, 条带大小831 bp。扩增出相应片段表示植株为阳性。

Fig. 2. Positive identification of T0transgenic plants (partial).

A, T0代杂合植株第一靶点测序结果, 箭头表示双峰开始位置；B, 野生型（台恢31）第一靶点测序结果。

Fig. 3. Sequencing of the first target site of TMS5 in T0 transgenic plants and WT (Taihui 31).

图4 tms5突变株与野生型靶位点突变序列比对分析

Fig. 4. Comparison of mutation sequences at target sites between tms5 mutants and WT.

图5 tms5突变株与野生型氨基酸序列比对分析

Fig. 5. Comparison of amino acid sequence between tms5 mutants and WT.

表2 tms5突变体分期播种的不育性鉴定

2.5 TB52S育性转换温度的探索

为了探索的育性转换温度，利用人工气候箱对处于幼穗分化期4期左右的进行温度处理，以台恢31为对照。处理条件为23℃、24℃、26℃、30℃，每日光照14 h，持续12 d，处理后放入自然条件下继续生长。从图8可以看出，23℃、24℃处理下，花粉可育，花药形态与台恢31无异，自交结实率分别为49.1%、59.4%。26℃条件下，花粉经染色具备典败、圆败、可育等多种形态，花药相较台恢31变小，但仍是明显的黄色，自交结实率达33.1%。而30℃处理后基本无花粉，花药发白瘦小，败育彻底。结合分期播种试验的结果可以认为，26℃是的育性转换温度。

图6 tms5突变体在I期和IV期播种时的花粉育性

Fig. 6. Pollen fertility ofmutants seeded at sowing dates I and IV.

图7 不育系TB52S及野生型成熟期表型对比

Fig. 7. Comparison of phenotype betweenmutant and WT.

研究过程中发现一个值得思考的现象，在12月份海南陵水基地繁种时，次年4月时的结实率超过70%，与野生型台恢31接近（数据未公布）。这种可育表现提示研究者育性可能受到光照长短的影响。为了证明这一观点，研究者继续利用人工气候箱对处于幼穗分化期4期左右的进行光照处理，以台恢31为对照。光照处理设置12 h光照/12 h黑夜、13 h光照/11 h黑夜、14 h光照/10 h黑夜、15 h光照/9 h黑夜，温度条件为30℃，持续12 d，处理后放入自然条件下继续生长。结果显示（图9），12 h光照条件下，花粉以典败为主，有极少数可育花粉，花药瘦小呈黄色。13 h、14 h、15 h的光照处理均使基本无花粉，花药发白瘦小。所有处理下自交结实率均为0。该结果说明，在高温条件下，光照在12 h以上可以保持彻底不育的特性。至于光照少于12 h时其育性是否会发生变化，还需进一步探索。

图8 突变体TB52S在不同温度处理下的花粉育性、花药形态及自交结实率（比例尺为5 mm，F表示可育，S表示不育）

Fig. 8. Pollen fertility and self-fertilization rate ofmutant under different temperature treatments during the young panicle differentiation. (Bar=5 mm; F, Fertile; S, Sterile)

Fig. 9. Pollen fertility and self-fertilization rate ofmutant under different photoperiod period treatments during the young panicle differentiation. (Bar=5 mm; S showed sterile)

2.6 TB52S配合力分析

经统计，的柱头外露率达到53.3%（表3），表明其具有较高的异交结实率。将分别与籼、粳型恢复系测配，杂交F1成熟后取样统计农艺性状。从表4可以看出，由于具有广亲和性，除/台恢1628的结实率为88.9%，其余组合结实率均超过90%，最高的为/TP39，达到96.1%。与籼型恢复系配组F1的千粒重和单株产量较高，其中/台恢468的单株产量接近80 g。与粳型恢复系配组F1的每穗粒数和结实率较高，但是有效穗数少，故单株产量较籼型恢复系偏低。综合看，的广亲和性好，今后研究中可以扩大配组范围，寻找优良组合。

表3 水稻温敏核不育系TB52S农艺性状

表4 水稻温敏核不育系突变体TB52S与不同恢复系配组F1农艺性状

3 讨论

基因组定向编辑技术是近几年发展起来的对基因组进行定向精确修饰的一种技术。基因组编辑技术包括锌指核酸酶[22]、类转录激活因子效应物核酸酶[23]以及CRISPR/Cas9进行基因组编辑。相较于前两种技术，CRISPR/Cas9设计简单，由个性化的sgRNA来介导靶基因DNA的切割，与靶基因结合的特异性由20个核苷酸的导向RNA决定，DNA切割由Cas9蛋白完成[13]，作用效率高。

目前国内单子叶植物的基因编辑研究中，使用的主要是pYLCRISPR/Cas9Pubi载体体系[24]以及pHUE411载体体系[21]，可以进行双靶点或者多基因靶点同时编辑，针对单靶点编辑效率低下的缺点[25]进行了有效的改进。利用CRISPR/Cas9对靶序列的编辑时，通常会得到多种类型的T0代株系，如无突变型、突变纯合型、突变杂合型[26-27]。本研究构建的双元表达载体pHUE411--Cas9经农杆菌侵染后，得到的116个T0代单株经PCR验证均为突变杂合型。尽管株系类型单一，但均为突变株，说明pHUE411载体体系编辑效率较高。25个T1的纯合突变单株仅包含3种突变类型，原因可能是T0转基因植株很多由同一个愈伤组织分化而来，故具有相同的基因型。本研究中获得的3种突变体、、在靶点1分别缺失1个、7个、10个碱基，导致蛋白翻译提前终止，因此靶点2的单碱基插入可以不用分析。

育性转换温度阈值是水稻核不育系的研究重点。是生产上应用最为广泛的温敏核不育基因[28]。粳稻背景的突变体的转育温度一般超过28℃[12, 16]，而籼稻品种如粤晶丝苗、泰丰B、五山丝苗的突变体分别在 24℃、26℃、26℃下花粉表现为完全不育[29]。本研究中的育性转换温度经鉴定为26℃，与前人研究结果类似。针对不同类型水稻材料获得的突变体转育温度差异明显，有研究者提出只是育性的一个开关，不育起点温度受其他基因的调控[17]。因此想要获得具有生产应用价值的籼型两系不育系有待进一步探索。

程式华等[30]在对全国101份光、温敏不育系的光温反应分类研究后，提出实用的籼型不育系的育性转换光温条件，应当是高温条件下无论长短日照均为不育，短日适温条件下育性基本恢复。另外，长日照下如遇短期低温亦保持不育或基本不育。本研究中，在30℃处理下，尽管12 h日照能产生极少数的可育花粉，从自交结实率来看仍然彻底不育，与日照长度15 h结果一致。海南陵水4月的平均温度为25.3℃，平均日照长度12.5 h左右[31]。结合每年4月份在海南陵水结实率接近野生型台恢31的表型，推断在短日照适温的条件下育性可以恢复。

水稻广亲和基因的发掘以及广亲和恢复系成功选育，使得水稻籼粳亚种间杂种优势利用逐步转为现实[32, 33]。同样的，选育具有广亲和性的两系不育系亦可扩大配组范围，增加选育超级稻的几率。本研究中，分别与籼型、粳型恢复系配组，F1的结实率接近或超过90%，说明的适配范围广，具有较好的应用前景。综合来看，具备高温不育、短日适温可育的优点，且适配范围广，实用性较好。然而其长日照下26℃的转育温度仍是推广应用的一个短板，需进一步优化。

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Creation of Thermo-sensitive Genic Male Sterile Rice Lines with Wide Compatibility Based on CRISPR/Cas9 Technology

DUAN Min1, XIE Liujie1, GAO Xiuying2, TANG Haijuan2, HUANG Shanjun1, PAN Xiaobiao1,*

(Crop Research Institute, Taizhou Academy of Agricultural Sciences, Linhai 317000, China; State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; Corresponding author, email: xbpan@163.com)

【Objective】In order to break the fetters in traditional hybridization in the breeding of genic male sterile rice lines, the thermo-sensitive genic male sterility genewas edited by CRISPR/Cas9 technology to create new genic male sterile lines usingrestorer line Taihui 31 as material. 【Method】Two sequences in the first exon ofwere chosen as target sites for the construction of vector pHUE411--gRNA and 116 T0generation transgenic plants were obtained byinfection method.【Result】Three homozygous mutants,,andwith amino aciddeletion in TMS5 were verified by PCR and sequencing. The split sowing experiment showed that the self-fertilization rate ofandwere 0.56% and 0.03% at 27℃, respectively. Meanwhile, at the same temperature, the pollen ofturned to be completely sterile. Compared with Taihui 31 (WT),() had more panicles, shorter panicle length. Its plant height and grain numbers per panicle reduced to nearly three quarters of WT. Furthermore, except for smaller anther with no pollens, the stigma, palea and lemma ofdidn’t change significantly as compared with WT. The fertility transfer temperature ofwas confirmed as 26℃according to the temperature test during the IV phase of young panicle differentiation. Last but not least, the seed setting rate of hybrid F1derived from the cross between TB52S andorrestorer lines was beyond 90%. 【Conclusion】Using CRISPR/Cas9 technology, we obtained thermo-sensitive genic male sterile linewhich was genetically stable. It provides new technical support for the breeding of genic male sterile lines.

CRISPR/Cas9; rice; young panicle differentiation sensitive period; self-fertilization; critical temperature of fertility alternation

10.16819/j.1001-7216.2023.221006

2022-10-24;

2022-11-07。

浙江省重大科研攻关计划资助项目(2016C02050-5); 台州市科技计划资助项目(21nya07)。