贮藏和液体培养条件对文冠果花粉萌发的影响

黄晓梅 李春雨 邢加浩 刘洪慧 张锦 李佳宸

摘要 ［目的］優化改善文冠果花粉离体萌发培养基。［方法］以新鲜文冠果花粉为试验材料，采用液体培养法，测定蔗糖、硼酸和钙对文冠果花粉离体萌发特性及花粉管长度的影响，筛选适合文冠果花粉离体培养液体培养基成分的最佳浓度。测定不同贮藏温度（-70、-20、4、25 ℃）及不同贮藏时间（2、5、10 d）下，文冠果花粉萌发率的变化。［结果］通过控制单一因素变量试验，文冠果花粉离体萌发的液体培养基最佳组分为15%蔗糖+0.02%硼酸+0.01%钙离子（硝酸钙），萌发率达92.5%，花粉管长达1.61 mm；而在花粉管生长过程中需要的钙离子浓度为0.04%。-70 ℃超低温贮藏花粉有利于保持花粉生活力，-20 ℃冷冻贮藏次之，4 ℃低温贮藏不利于保持花粉生活力，25 ℃恒温贮藏会大大降低花粉生活力。［结论］该研究可为文冠果花粉离体培养的液体培养基最佳组分配方提供参考依据，也为文冠果花粉贮藏研究奠定基础。

关键词 文冠果；花粉萌发；贮藏；生活力

中图分类号 S 565.9  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）07-0131-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.031

Effects of Storage and Liquid Culture Conditions on Xanthoceras sorbifolium Pollen Germination

HUANG Xiao-mei， LI Chun-yu， XING Jia-hao et al

（Weifang University， Weifang， Shandong 261061）

Abstract ［Objective］In order to optimize and improve the culture medium of Xanthoceras sorbifolium pollen germination in vitro. ［Method］The effects of sucrose， boric acid and calcium ion on the germination rate of Xanthoceras sorbifolium pollen and pollen tube length were measured by liquid culture method， which fresh pollen was used as experimental material. So as to screen out the best concentration of liquid medium components suitable for Xanthoceras sorbifolium pollen germination in vitro. At the same time， the changes of pollen germination rate of Xanthoceras sorbifolium were measured under different storage temperatures （－70， －20， 4， 25 ℃） and different storage times （2， 5， 10 d）. ［Result］The results showed that through controlling the single factor variable test， the optimal medium group that promoted in vitro germination rate of pollen of Xanthoceras sorbifolium was 15% sucrose +0.02% boric acid +0.01% calcium ion （calcium nitrate）， the germination rate was 92.5%， and the pollen tube length was 1.61 mm. While the concentration of calcium ion needed in the process of pollen tube growth was 0.04%. The statistics indicates that -70 ℃ cryogenic storage of pollen was beneficial to keep the vitality of pollen， and 20 ℃ refrigerated storage times， 4 ℃ low temperature storage was not conducive to maintain vitality of pollen， 25 ℃ constant temperature storage will greatly reduce the vitality of pollen. ［Conclusion］This study can provide reference basis for the optimal formula of liquid medium for Xanthoceras sorbifolium pollen germination in vitro， and lay a foundation for the study of Xanthoceras sorbifolium pollen storage.

Key words Xanthoceras sorbifolia;Pollen germination;Storage;Pollen vitality

基金项目 国家自然科学基金项目（31301733）；潍坊学院博士基金资助项目（2012BS19）；山东省高等学校科技发展计划资助项目（J18KA157）;潍坊学院大学生研究计划项目（WFUSRTP-2020L24）。

作者简介 黄晓梅（1997—），女，广西藤县人，从事植物花粉发育与萌发研究。

收稿日期 2022-06-03；修回日期 2023-01-04

文冠果（Xanthoceras sorbifolia）是我国北方常见落叶灌木，属无患子科。其根系发达且分布面积广，有利于水分吸收和贮藏，在多种极端土壤环境条件下都能够生长，是防治风沙、治理荒漠的首选优良树种；文冠果花期由于满树繁花、鲜艳美丽而具有很高的观赏性；其果实集保健与药用价值一身［1］。因此，目前对文冠果的研究较为热点，对其花粉离体萌发的研究也有不少报道，但在花粉培养的最适培养基成分和培养方法方面存在较大差异。如刘武林等［2］采用悬滴法进行文冠果花粉培养；有学者采用半固体培养基，其培养基中均加入了琼脂，如吴月亮等［3］加入5%～6%琼脂，李强峰等［4］采用1%琼脂。李强峰等［4］研究表明，培养基中最佳蔗糖浓度为0.2%，而刘武林等［2-3］所测得的结果为10%～15%，二者蔗糖溶液浓度相差较大。硼酸是文冠果花粉萌发最重要的元素之一，0.01%～0.02%硼酸可较好地促进文冠果花粉萌发，但是过高浓度会导致花粉萌发数量下降。针对培养基中钙离子的研究，吴月亮等［5］研究表明，钙离子对文冠果花粉离体萌发促进作用不大，培养基中可不加入钙离子。在文冠果花粉贮藏温度和贮藏时间试验中，吴月亮等［3，5］控制贮藏时间和贮藏温度2个因素变量，测定了文冠果花粉最适贮藏温度。

笔者采用与前人不同的液体培养基对文冠果花粉进行培养，筛选培养基中蔗糖、硼酸、钙离子（硝酸钙）的最佳浓度，同时对文冠果花粉贮藏温度和贮藏时间进行探究，以期为研究文冠果杂交育种及花粉长期贮藏提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为潍坊市人民广场种植的文冠果树，于每天06：00采集当天开放的花朵，取下花粉进行不同处理。试验中采用的花粉均为当天采集的同一批次花粉，贮藏花粉为第一批次采集的花粉。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉离体萌发预试验。

文冠果花粉离体培养先进行预试验，目的是观察花粉离体培养过程是否需要光照。

将新鲜花粉接种到15%蔗糖+0.01%硼酸+0.01%钙离子液体培养基上，在光照和黑暗环境下25 ℃恒温培养，培养1、2、3、4、5 h分别取出观察。

文冠果花粉离体培养在光照条件下花粉萌发率要高于黑暗条件下（图1），同时文冠果花粉萌发在4 h时即可观察。

1.2.2 花粉培养最适培养基组分测定。

蔗糖浓度设为0（CK，空白对照组）、5%、10%、15%、20%、25%、30%，培养基中硼酸和钙离子浓度均为0.01%。硼酸浓度设置为0（CK）、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.10%；将第1步测定的最适蔗糖浓度加入培养基中，同时将钙离子浓度设置为0.01%最低水平。最后，钙离子（硝酸钙）浓度设置为0（CK）、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.10%。将以上2步测定蔗糖和硼酸浓度作为测定最适钙离子浓度培养基成分的浓度。

在涂有凡士林凹槽的载玻片上滴配置好的培养基，用镊子轻轻夹起开裂的花药将新鲜花粉抖落在培养基上，在培养皿中放置1张湿滤纸，保持湿度，然后将载玻片放在培养皿滤纸上，25 ℃恒温培养4 h后，显微镜下记录并观察，同时测量花粉管长度。

1.2.3 花粉最适贮藏温度测定。

将文冠果花粉用镊子取下用硫酸纸包好后贴上标签，分别装入4个药品袋中，然后将药品袋分别放入-70 ℃超低温冷冻箱，-20和4 ℃冰箱冷藏，25 ℃电热恒温培养箱中。分别在第2天、第5天、第10天取出，在培养基中放置适量花粉，采用上述方法培养4 h后，统计花粉萌发率。

2 结果与分析

2.1 文冠果花粉培养最适培养基筛选

2.1.1 蔗糖对文冠果花粉萌发的影响。

由表1可知，不同浓度蔗糖对文冠果花粉萌发率影响较大，与CK对比可知，蔗糖能明显提升文冠果花粉离体萌发率，其中蔗糖浓度为15%时，最有利于花粉萌发（图2A），花粉萌发率达92.9%。蔗糖浓度为5%～20%时，文冠果花粉萌发率在82.1%～92.9%，相差不大。当培养基中蔗糖浓度为25%时，文冠果花粉萌发率为48.6%，萌发率大幅下降，花粉萌发严重受到抑制。当蔗糖浓度达到30%时，萌發率很低，仅2.1%（图2B）。

低浓度蔗糖有利于文冠果花粉管的生长，花粉管生长的最佳蔗糖浓度为10%，长度达1.86 mm。当蔗糖浓度在5%～15%时，花粉管的生长快速，长度较长，为1.24～1.86 mm。当蔗糖浓度达到25%及以上时，由于文冠果花粉萌发受到抑制，因此花粉管的伸长也受到影响，仅0.08～0.56 mm（表1）。

2.1.2 钙对文冠果花粉萌发的影响。

由表2可知，钙（硝酸钙）可促进文冠果花粉萌发，钙浓度为0.01%时最有利于文冠果花粉萌发。对比CK可以看出，当培养基中加入钙后文冠果花粉萌发率均有一定程度的提高，0.01%～0.10%钙浓度对文冠果花粉萌发均表现出提升效果，无抑制作用产生。因此，若研究文冠果花粉萌发试验，可添加0.01%最低水平钙离子溶液，从而使花粉萌发率有一定提高。从花粉管长度数据可见，钙离子对文冠果花粉管生长有一定影响。与CK相比，添加0.04%钙离子后，花粉管长度达1.10 mm（图3A），远长于CK的0.45 mm（图3B）；在钙离子达0.10%时，花粉管长0.47 mm，与CK相差不大，说明高钙会抑制花粉管的生长。因此，研究花粉管生长的最适培养基中需添加0.04%钙离子。

2.1.3 硼酸对文冠果花粉萌发的影响。

由表3可知，硼酸可促进文冠果花粉萌发，相比CK，低浓度硼酸能刺激花粉萌发，提高花粉萌发率。硼酸浓度为0.01%～0.05%时，花粉萌发率为89.7%～92.5%，低浓度硼酸对文冠果花粉萌发均具有一定促进作用。当硼酸浓度为0.10%时，文冠果花粉萌发率大幅度降至56.3%，远低于CK（82.5%），说明硼酸浓度过高会产生抑制效果。因此，文冠果花粉萌发的最适培养基为15%蔗糖+0.02%硼酸+0.01%硝酸钙。

硼酸可加速文冠果花粉管的生长速度，利于花粉管伸长的硼酸浓度为0.02%，该浓度下花粉管粗细均匀，长度达1.61 mm（图4A）；0.10%高硼酸环境会导致花粉管弯曲且尖端膨大，长度较短，仅有0.87 mm（图4B）。与CK相比可以看出，硼酸浓度0.01%～0.10%对花粉管的伸长均具有促进效果，但高浓度硼酸反而会导致花粉管生长畸形。

2.2 文冠果花粉贮藏条件

由图5可知，文冠果同一批次新鲜花粉初始时的花粉萌发率为89.12%，随着贮藏温度升高，贮藏时间延长，花粉萌发率均出现不同程度降低。

-70 ℃超低温貯藏条件下文冠果花粉萌发率变化不大，在2和5 d时花粉萌发率为88.75%和87.32%，在贮藏10 d时花粉萌发率仍可以达到86.51%。-20 ℃低温冷冻条件下，文冠果花粉的萌发率在短时间内仍能保持较高水平，在贮藏2和5 d花粉萌发率分别为87.82%和85.54%，10 d花粉萌发率为80.53%，可见在贮藏10 d文冠果萌发率出现较大下降。4 ℃低温冷藏条件下，文冠果花粉萌发率出现略微降低，在2、5和10 d时花粉萌发率分别为85.72%、78.65%和70.28%。25 ℃常温贮藏条件下，文冠果花粉萌发率明显下降，在贮藏2 d时文冠果花粉萌发率为71.36%，较初始情况下有明显下降，在贮藏5 d时花粉萌发率为56.75%，还有近50%的花粉具有生活力，在10 d后文冠果花粉萌发率仅4.87%，表示文冠果花粉大量失去活力，说明常温不利于文冠果花粉的贮藏。可见，文冠果花粉在-70 ℃条件下有利于长期保存，-20和4 ℃次之，适合短期文冠果花粉保存，25 ℃常温条件不利于文冠果花粉的保存，在贮藏10 d后花粉基本失去活力。

3 讨论

相关研究表明，多数植物［6-9］所需的蔗糖浓度为10%～25%，而在文冠果培养基中蔗糖浓度为0.2%［4］，文冠果所需蔗糖浓度为10%～15%［2-3，5］，对此差异较大的蔗糖浓度可能是不同地区、不同气候下植物生长差异所致。该试验发现，文冠果花粉离体萌发过程中，蔗糖浓度过低，会使文冠果花粉管在培养前期吸水膨胀，甚至出现破裂等情况。该试验中文冠果花粉萌发最适蔗糖溶液浓度为15%，花粉管生长蔗糖溶液最适浓度为10%，这与刘武林等［2-3，5］研究结果一致。

植物花粉离体萌发过程一般都需在培养基中添加适量硼酸［10-12］，而在文冠果花粉培养中，刘武林等［2］研究指出，培养液中不加入硼酸溶液时，文冠果花粉基本不会萌发，萌发率低于3%。但该试验中不加入硼酸时，花粉萌发率仍可以高达82.5%，这与刘武林等［2］的研究结果不同，可能是由于该试验中液体培养基组分中含有钙离子（硝酸钙），而刘武林等［2］的培养基中未加入钙离子，推测在文冠果花粉离体萌发过程中，钙离子可在某种程度上替代硼酸，从而促进硼酸离子空白对照组中的花粉萌发率仍可以达到较高水平。该试验0.02%硼酸最适合文冠果花粉萌发和花粉管生长。

吴月亮等［5］研究结果表明，文冠果花粉培养基中不需要加入钙；而芦娟等［13］研究认为，文冠果花粉培养需要较高浓度的钙参与。该试验结果表明，适量的钙会增加文冠果花粉离体萌发的数量，最适浓度为0.01%；而花粉管的生长需要更多钙的参与，低钙会导致花粉管顶端膨大破裂，这与对百合、海仙花的研究结果一致［14-15］。因此，若只探究文冠果花粉萌发率，可在培养基中添加少量的钙溶液，若需要探究文冠果花粉管生长情况，则需加入0.04%钙，从而使文冠果花粉管能够正常生长。

低温有利于花粉活力的保存已在多种植物中得到证实［16-18］。该试验结果表明，-70 ℃超低温最有利于文冠果贮藏，-20 ℃冷冻贮藏次之，4 ℃低温贮藏可在短时间内保持文冠果花粉萌发率，25 ℃恒温贮藏不利于文冠果花粉贮藏，该环境下文冠果花粉萌发率降低过快，10 d后基本不再萌发，这与吴月亮等［5，19］的试验结果基本一致。因此，若要长期保存需要的文冠果花粉，-70 ℃超低温贮藏保存效果较好，若短期保存文冠果花粉，-20 ℃低温贮藏可达到较好的效果，既可保持花粉活力，又简单经济有效。

综上，文冠果花粉体外萌发适宜培养基为15%蔗糖+0.02%硼酸+0.01%硝酸钙，培养时间为4 h；长期贮藏花粉使用-70 ℃超低温保存，活力保持最好。

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