一种舒缓修护复合植物提取液的制备及功效评价

王一宇

（杭州三式化妆品有限公司，浙江 杭州 310011）

目前，越来越多的人受到敏感性肌肤的困扰。美国的一项调查表明，敏感性肌肤全球总体流行率约为44%[1]。皮肤敏感是指皮肤暴露于某些物理或化学刺激时会出现不愉快的感觉（如瘙痒、灼热、刺痛等），而健康皮肤不会被这些刺激所困扰[1-2]。导致皮肤敏感的因素有很多，包括遗传因素、内分泌失衡、环境和生活方式的改变、不恰当的皮肤护理等。研究者普遍认为皮肤敏感是一种涉及皮肤屏障-神经血管-免疫炎症的复杂过程[3]。因此，具有舒缓及修护皮肤屏障功效的护肤品是解决皮肤敏感问题的有效措施。

目前，市售化妆品活性原料往往只具有舒缓或修护功效，解决敏感性肌肤问题的效果不够理想。因此该文致力于开发同时具有舒缓、修护功效的植物提取物，以期高效解决敏感性肌肤问题。该研究分析了含辣木（Moringa oleifera）籽提取物的复合植物提取液（命名为新解忧精粹2.0）的制备方法及其舒缓、修护功效评价结果，为研发舒缓修护化妆品提供新思路。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

III 型ZTC 1+1 天然澄清剂，北京正天成澄清技术有限公司；中性蛋白酶，夏盛（北京）生物科技开发有限公司；甘油，化妆品级，宝洁化工；D101 大孔吸附树脂，西安瀚宇树脂科技有限公司；RPMI 培养基，HyClone；FBS，Gibco；地塞米松（Dex）、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）、脂多糖（LPS）、十二烷基硫酸钠（SLS），Sigma；白介素6（IL-6）ELISA Kit，欣博盛生物科技有限公司；前列腺素E2（PGE-2）ELISA Kit，Cayman。

Avanti J-E 离 心 机，Beckman；DMi1 倒 置 显 微 镜，Leica；Bio-II-A 生物安全柜，Telstar；371 二氧化碳培养箱，Thermo Fisher；SPARK 酶标仪，TECAN；MPA6 多功能皮肤测试仪、MX18 和色素和红色素测试仪，CK；VapoMeter，Delfin；移液枪，Brand；斑试器，北京百亿怡达科技开发有限公司。

1.2 试验方法

前期研究发现，由小白菊（Chrysanthemum parthenium）花提取物、两面针（Zanthoxylum nitidum）根提取物、蛇床（Cnidium monnieri）果提取物组成的复合提取液（命名为新解忧精粹1.0）具有明显的舒缓、修护功效。但新解忧精粹1.0 的稳定性欠佳，室温下长期放置会有少量沉淀析出。而添加一定比例辣木籽提取液后的复合提取液的稳定性得到改善且修护功效有进一步提升。

1.2.1 Ⅲ型ZTC 1+1天然澄清剂的配制

ZTC 1+1 澄清剂Ⅲ型A 组分溶液的配制：将A 组分粉末10g 置于烧杯中，沿烧杯内壁缓慢加入990g 水，搅拌均匀。置于55℃水浴中保温30min 后，在室温下过夜溶胀，备用。

ZTC 1+1 澄清剂Ⅲ型B 组分溶液的配制：将B 组分粉末10g 置于烧杯中，沿烧杯内壁缓慢加入980g 水、10g 冰醋酸，搅拌均匀。置于55℃水浴中保温30min 后，在室温下过夜溶胀，备用。

1.2.2 新解忧精粹2.0的制备

取75g 辣木籽，用物理压榨的方式脱去油脂。脱脂辣木籽与750g 水混合，在45℃~50℃下搅拌提取2h（该温度可提取出辣木籽蛋白，同时避免淀粉糊化，利于后续的分离纯化）后，用Avanti J-E 离心机以8000r/min离心15min，收集上清液。利用盐酸将上清液pH 调至辣木籽蛋白等电点附近（4.0~4.2）。室温下静置4h~5h 后，辣木籽蛋白沉淀析出，用Avanti J-E 离心机以8000r/min离心15min，收集固体（辣木籽蛋白）。辣木籽蛋白与500g水混合，调节pH 至6.3~6.5，边搅拌边升温至45℃~50℃，直至形成澄清透明的溶液。向溶液中加入0.03g 中性蛋白酶，在45℃~50℃下酶解6h 后加热至75℃~80℃，灭酶30min。在该温度下，中性蛋白酶及残留的辣木籽蛋白会变性为难溶于水的微小固体颗粒，而辣木籽蛋白的酶解产物（主要是肽类）溶解于水中。用0.1μm 聚丙烯膜过滤，滤液与500g 甘油混合，搅拌均匀，可得辣木籽提取液。

将75g 小白菊花、70g 两面针根、60g 蛇床果混合，用3kg 水在90℃~95℃下搅拌提取2h 后用5μm 聚丙烯膜过滤。向滤液中加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清剂B 组分溶液，搅拌20min，再加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清剂A 组分溶液，搅拌20min。静置1h~2h 后，蛋白、鞣质被沉淀出来。用Avanti J-E 离心机以8000r/min 离心15min，收集上清液。上清液用250gD101 大孔吸附树脂搅拌吸附1.5h，弃去液体。树脂先用500g 水搅拌洗脱30min，弃去水洗液。再用上文制备的辣木籽提取液搅拌洗脱2h。收集辣木籽提取液洗脱部位，用0.1μm 聚丙烯膜过滤，即得新解忧精粹2.0。

1.2.3 新解忧精粹1.0的制备

将75g 小白菊花、70g 两面针根、60g 蛇床果混合，用3kg 水90℃~95℃搅拌提取2h 后用5μm 聚丙烯膜过滤。向滤液中加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清剂B 组分溶液，搅拌20min，再加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清剂A 组分溶液，搅拌20min。静置1h~2h 后，蛋白、鞣质被沉淀出来。用Avanti J-E 离心机以8000r/min 离心15min，收集上清液。上清液用250g 的D101 大孔吸附树脂搅拌吸附1.5h，弃去液体。树脂先用500g 水搅拌洗脱30min，弃去水洗液。再用1kg50%甘油-水溶液洗脱，收集50%甘油洗脱部位，用0.1μm 聚丙烯膜过滤，即得新解忧精粹1.0。

1.2.4 稳定性考察

将新解忧精粹1.0、新解忧精粹2.0 分装于容积为60mL的玻璃瓶内（每瓶装样55mL）。然后分别置于-18℃、4℃、45℃、室温避光和室温光照环境下考察样品的稳定性。考察指标包括颜色、外观和pH 值，考察周期3 个月。考察周期内，每隔一周记录一次样品的颜色、外观和pH 值。

1.2.5 舒缓功效评价

取对数生长期的人单核白血病细胞（THP-1 细胞）以适当的密度接种到96 孔板中。然后每孔加入100μL 的PMA（终浓度为50ng/mL），孵育48h 后弃去细胞培养上清，每孔再加入100μL 浓度为1μg/mL 的LPS（只含PMA 和LPS，不含待测样品的孔为模型组）。然后向测试孔中加入100μL不同浓度的新解忧精粹2.0（终浓度为0.03%~3.0%）或10μm 的Dex，继续培养24h。加入新解忧精粹2.0 的测试孔为受试物组，添加10μm Dex 的测试孔为阳性对照组。培养结束后收集细胞培养上清至新的96 孔板中，将细胞培养上清稀释至合适的浓度，根据细胞因子ELISA 检测试剂盒操作说明进行细胞因子的含量测定。对测试结果进行统计学分析，采用单因素方差分析，ANOVA 计算统计学差异，并按照公式“抑制率（%）=100×（表达量模型组-表达量受试物组）/表达量模型组”计算新解忧精粹2.0 对细胞因子表达的抑制率。

1.2.6 修护功效评价

细胞模型的预试验结果表明，新解忧精粹2.0 修护UVB 导致细胞损伤的能力强于新解忧精粹1.0。该研究参考国标及团标的方法[4-5]在人体上（30 例有效数据）评测新解忧精粹2.0 的修护功效，测试指标包括经表皮水分散失率（TEWL）和皮肤血红素含量。

人体功效评测于恒温恒湿实验室进行。受试者在测试环境中适应30min 后再进行功效评测。将受试者手臂分为3 个区域，分别记作空白区、1%受试物区和5%受试物区。手臂用清水洗净后吸取25μL 浓度为1.5%的SLS 溶液滴加于斑试器所附的滤纸片上，将斑试器贴敷于受试者手臂的3 个区域。24h 后去除斑试器，于室内平衡30min。待压痕消失后，使用VapoMeter 探头检测初始TEWL，使用MX18探头检测初始血红素含量。每个区域重复测试3 次，取平均值作为最终测试结果。然后向1%受试物区涂抹15μL 浓度为1%的新解忧精粹2.0 溶液，向5%受试物区涂抹15μL浓度为5%的新解忧精粹2.0 溶液，空白区涂抹15μL 空白溶剂。每日涂抹2 次，连续涂抹3 天。3 天后测试各区域TEWL 和血红素含量。测试数据采用双尾检验进行统计学分析，检验水准α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 新解忧精粹2.0的制备

该研究制备的新解忧精粹2.0 为黄色透明液体，具有轻微特征性气味。根据文献报道和定性分析的结果，新解忧精粹2.0 含有黄酮、生物碱、香豆素、肽类等成分[6]。这些成分是常见的舒缓、修护类活性物质。其中的辣木籽蛋白酶解产物（肽类）既能增强复合提取液的修护功效，又能提高提取液的稳定性，是较为关键的一类成分。因此，利用《中国药典》2020 版4 部通则0731 中的第二法（福林酚法）测定新解忧精粹2.0 肽类的含量。制备的3 批样品中，肽类的含量为0.3%~0.5%。

2.2 稳定性考察

在考察周期内，新解忧精粹2.0 在各条件下的颜色、外观和pH 值均稳定。新解忧精粹1.0 在第三周时，在45℃条件下有微量固体析出。稳定性考察的结果表明，辣木籽提取物可以提升舒缓、修护复合植物提取液的稳定性。原因可能是辣木籽蛋白经酶解后，与超声改性的结果类似，分子间聚集程度加强，结构更加致密，乳化能力增强[7]，增强了与其他成分之间的作用力，同时也增加了其他成分的溶解度，可避免复合植物提取液析出固体。

2.3 舒缓功效评价

样品的舒缓功效测试结果如图1 所示。10μm Dex 对IL-6、PGE-2 表达的抑制率分别为93.97%和89.17%。0.3%~3.0%的新解忧精粹2.0 对IL-6、PGE-2 表达的抑制率均大于77%。1%以上浓度的新解忧精粹2.0 对IL-6、PGE-2 表达的抑制率接近100%，具有明显的剂量依赖性和显著性差异，说明新解忧精粹2.0 具有舒缓功效。

图1 新解忧精粹2.0 的舒缓测试结果

2.4 修护功效评价

TEWL 测试结果表明，涂抹新解忧精粹2.0 的3 天后，经表皮水分流失率有所下降，1%及5%的新解忧精粹2.0使TEWL 分别降低了6.0%和9.3%，而空白组的TEWL 几乎没有变化。

新解忧精粹2.0 也可减缓血红素含量的增加。各区域血红素含量测试结果见表1，血红素含量增加量如图2 所示。结果表明，3 天后，手臂各测试区域血红素的含量均有增加（表1）。但涂抹1%和5%新解忧精粹2.0 的区域的血红素含量增加较少（图2）。TEWL 和血红素含量测试结果说明，新解忧精粹2.0 具有一定的修护功效。在测试过程中，所有受试者均未出现不良反应。

图2 3 天后血红素含量增加值

表1 各测试区域的血红素含量（30 位有效受试者平均值）

3 结论

根据前期研究结果，该文采用特定工艺制备了一种植物复合提取液，全成分INCI 名为甘油、水、辣木（Moringaoleifera）籽提取物、小白菊（Chrysanthemum parthenium）提取物、两面针（Zanthoxylum nitidum）提取物、蛇床（Cnidium monnieri）果提取物，命名为新解忧精粹2.0。

稳定性考察结果表明，在4℃、45℃、室温避光和室温光照条件下，新解忧精粹2.0 的颜色、外观和pH 值在3 个月考察期内均稳定。辣木籽蛋白经酶解后有提升植物复合提取液稳定性的作用。原因可能是辣木籽蛋白经酶解后，与超声改性的结果类似，分子间聚集程度加强，结构更加致密，乳化能力增强，可增加其他成分的溶解度，进而避免复合植物提取液析出固体。

体外舒缓功效评测结果表明，新解忧精粹2.0 可抑制THP-1 细胞分泌IL-6 和PEG-2。人体修护功效评测结果表明，涂抹1%和5%的新解忧精粹2.0 可降低经表皮水分流失率，减缓血红素的合成。在测试过程中，所有受试者均未出现不良反应。该文的研究结果表明，新解忧精粹2.0具有舒缓、修护功效，可作为舒缓、修护原料添加到化妆品中，以解决敏感性肌肤问题。