猪肉中硝基呋喃代谢物液质检测法的优化及衍生条件探究

黄立

摘 要：目的：对国标法（GB/T 21311—2007）猪肉中硝基呋喃代谢物残留量检测方法进行提取净化步骤优化并对其衍生剂体积和衍生时间进行探究。方法：样品经衍生提取后，对比通过HyperSep Retain PEP小柱进行净化和国标法净化后图谱的基线噪音及峰面积响应情况；采用标准溶液衍生后峰面积的响应值对衍生剂用量、衍生时间进行探究。结果：衍生剂体积的量仅对呋喃妥因代谢物和呋喃西林代谢物影响大，随着衍生剂体积的增加，衍生效率增强；衍生时间4 h及以上即可满足检测要求；采用HyperSep Retain PEP小柱净化基线相对较低平、噪音较低，方法检出限为0.5 ?g·kg-1，加标回收率为89.8%～109.6%，RSD为0.7%～2.0%。结论：该方法处理过程简洁、省时，测定结果准确，数据可靠，可实现对猪肉中硝基呋喃代谢物的快速检测。

关键词：硝基呋喃代谢物；液质联用仪；衍生剂；净化

Abstract： Objective： To optimize the extraction and purification procedure of the national standard method （GB/T 21311—2007） for detecting residual nitrofuran metabolites in pork， and to explore the volume and derivation time of its derivatives. Method： After the samples were derived and extracted， the baseline noise and peak area responses of the atlas after purification by HyperSep Retain PEP column and national standard method were compared. The response value of peak area after derivative of standard solution was used to explore the amount of derivative and derivative time. Result： The derivatives volume only had a significant effect on furantoin metabolites and furacillin metabolites， and the derivatives efficiency increased with the increase of derivatives volume. The derivative time of 4 h and above can meet the detection requirements; HyperSep Retain PEP column was adopted with a relatively low purification baseline and low noise. The detection limit of the method was 0.5 ?g ·kg-1， the standard recoveries were 89.8%～109.6%， and RSDS were 0.7%～2.0%. Conclusion： The method is simple， time-saving， accurate and reliable， and can be used for the rapid detection of nitrofuran metabolites in pork.

Keywords： nitrofuran metabolites; liquid-mass spectrometer; derivatives; purification

硝基呋喃类抗生素包含呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮等，是一类对革兰阳性及阴性菌有一定抗菌作用的广谱抗菌素，呈黄色粉末状，无味或味微苦[1]。它们的作用机理为抑制微生物酶系统中乙酰辅酶A，干扰其糖类的代谢，从而起到抑菌作用。硝基呋喃类药物不稳定，容易生成代谢物，一般采取测定其代谢产物来测其残留量[2]。本文主要采用液相色谱串联质谱法测定猪肉中的4种硝基呋喃代谢物，用2-硝基苯甲醛与代谢产物发生衍生反应，形成衍生物，再对衍生物的量进行测定，从而间接测定待测物质的量。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

猪肉，超市购买。

乙腈；乙酸乙酯；乙酸铵；邻硝基苯甲醛；氢氧化钠；标准物质：乙腈中呋喃唑酮代谢物、甲醇中呋喃它酮代谢、甲醇中呋喃妥因代谢物、甲醇中呋喃西林代谢物，浓度均为100 ?g·mL-1，厂家均为坛墨质检有限公司。

AB SCIEX QTRAP4500型高效液相色谱串联质谱仪（ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱）；AL104电子天平，梅特勒上海沪粤科学仪器有限公司；Vortx-Genie 2T SI-0246振蕩器，上海净信实业发展有限公司；旋转蒸发仪，德国海道夫公司；赛默飞离心机；HyperSep Retain PEP固相萃取小柱（60 mg，3 mL），赛默飞。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

（1）4种硝基呋喃代谢物混合标准储备液。准确移取4种硝基呋喃代谢物标准物质各0.1 mL于10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为1 ?g·mL-1的4种硝基呋喃代谢物混合标准储备液，-18 ℃避光保存，有效期半年[3]。

（2）4种硝基呋喃代谢物混合中间标准液。准确移取2.5 mL 4种硝基呋喃代谢物混合标准储备液于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为100 ng·mL-1的4种硝基呋喃代谢物混合中间标准液，-18 ℃避光保存，有效期3个月。

1.2.2 仪器条件

（1）液相色譜条件。色谱柱：ACQUITY UPLC? BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 ?m），或性能相当者；流动相：A为含0.2%甲酸水溶液，B为乙腈；洗脱程序见表1；流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

（2）质谱条件。电离方式：电喷雾电离（ESI）；扫描方式：正离子扫描；多反应监测（MRM）；气帘气：35 psi；电喷雾电压：5 000 V；雾化气压力GAS1：50 psi；辅助气GAS2：50 psi；碰撞器CAD：9 psi；离子源温度：500 ℃；监测离子对、碰撞气能量和去簇电压等信息见表2。

1.2.3 样品处理

（1）制备及保存。在超市购买1 kg猪里脊肉，取具有代表性的样品500 g，用绞肉机充分绞碎并混合均匀，装于样品自封袋内，冷冻避光保存，备用。

（2）样品称取及预洗。称取2 g猪肉试样（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入10 mL 50%甲醇水溶液，涡旋振荡10 min后，以6 000 r·min-1离心10 min，弃去清洗液[4]。

（3）水解及衍生。沉淀物中加入10 mL 0.2 mol·L-1盐酸溶液，以1 000 r·min-1均质1 min，然后按最终定容浓度加入适量混合中间标准溶液，再加入100 ?L 0.1 mol·L-1的2-硝基苯甲醛溶液，涡动混合1 min，再振荡30 min，置于37 ℃恒温水浴锅中避光衍生16 h。

（4）提取及净化。冷却衍生后样品至室温，加入2 mL 0.3 mol·L-1的磷酸钾溶液，用2.0 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH值至（7.4±0.2）。

①国标法：调好pH值后，加入10 mL乙酸乙酯，振荡提取10 min，以10 000 r·min-1离心10 min，收集乙酸乙酯层。残留物用0.1%甲酸水溶液溶解，再用3 mL乙腈饱和正己烷分两次液液分配，去除脂肪。下层水相过0.2 ?m微孔滤膜后，装于进样小瓶上机检测（同时做空白样品和空白）。②净化柱净化法：10 000 r·min-1、4 ℃冷冻离心5 min。依次用2×2.5 mL甲醇、2×2.5 mL超纯水活化HyperSep Retain PEP小柱，将上清以1 mL·min-1的流速通过HyperSep Retain PEP小柱，10 mL超纯水淋洗小柱，负压抽干15 min，2.5 mL×2乙酸乙酯1 mL·min-1洗脱，收集，40 ℃氮气吹干，加1 mL 0.1%甲酸水复溶，过0.22 ?m亲水PTEE微孔滤膜，装于进样小瓶上机检测（同时做空白样品和空白）。

2 结果与分析

2.1 国标法+SPE法优化提取净化结果

本法将提取净化步骤进行优化，样品按1.2.3方法处理后上机分析。国标法提取净化与优化后的SPE法提取净化结果比较见图1。

由图1可知，经HyperSep Retain PEP固相萃取柱提取净化处理的样品，基线相对较低平，噪音较弱，净化效果比国标法稍好，同时提取净化过程简便，净化时间有所缩短。

2.2 衍生剂体积的探究

分别以5 ng·mL-1、10 ng·mL-1两个浓度的混合标准溶液为衍生对象，分别加入50 ?L、100 ?L、200 ?L、400 ?L、600 ?L、800 ?L、1 000 ?L不同体积的0.1 mol·L-1 2-硝基苯甲醛衍生剂，在37 ℃下避光水浴衍生16 h，然后按照方法进行测定，峰面积的变化观测结果见表3。

由表3可知，当衍生剂浓度为0.1 mol·L-1，分别加5 ng·mL-1、10 ng·mL-1两个浓度的混合标准溶液，不同体积衍生剂衍生下的呋喃唑酮代谢物和呋喃它酮代谢物峰面积无明显变化规律，而呋喃妥因代谢物和呋喃西林代谢物的峰面积随着衍生剂体积的增大而增大。由此可知，衍生剂体积的量对呋喃唑酮代谢物和呋喃它酮代谢物的衍生效率影响不大；对于呋喃妥因代谢物和呋喃西林代谢物来说，随着衍生剂体积的增加，峰面积逐渐增大，衍生效率增强。因此，若想提升呋喃妥因代谢物和呋喃西林代谢物检测的灵敏度，可通过提高衍生剂2-硝基苯甲醛的量来实现。

2.3 不同衍生时间的探究

以10 ng·mL-1的混合标准溶液为衍生对象，加入100 ?L 0.1 mol·L-1的2-硝基苯甲醛溶液，在37 ℃下避光水浴衍生4 h、8 h和16 h，每个时间点做两次平行，然后按方法进行测定，峰面积的变化来观测结果见表4。

由表4可知，当衍生剂浓度为0.1 mol·L-1时，加入100 ?L衍生剂，衍生时间由4 h增到8 h，再到16 h时，随时间的增加，4种硝基呋喃代谢物的峰面积未有显著变化。表明无论4 h还是16 h都能达到检测灵敏度要求，为节省检测时间，实验中可选择4 h作为衍生时间[5]。

2.4 标准曲线线性范围与方法检出限

分别准确移取混合中间标准液10 ?L、50 ?L、100 ?L、200 ?L、400 ?L、600 ?L、800 ?L、1 000 ?L于预洗好的空白样品中，分别按照两种净化方法处理，配制成浓度分别为1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、40 ng·mL-1、60 ng·mL-1、80 ng·mL-1、100 ng·mL-1的基质工作液，进液质联用仪检测后绘制标准曲线。国标GB/T 21311—2007中4种硝基呋喃代谢物检出限均为0.5 μg·kg-1，本实验的检出限及标准工作曲线见表5。

由表5可知，4种硝基呋喃代谢物的仪器检出限均为0.5 ?g·kg-1。当浓度在1～100 ng·mL-1，4种硝基呋喃代谢物响应相关性良好，相關系数均大于0.996。

2.5 方法回收率及精密度

向已称取并预洗好的空白样品中添加0.5 ?g·kg-1、2.5 ?g·kg-1、5.0 ?g·kg-1 3个浓度点，每个浓度做6个平行，与试样相同处理过程[6]，得加标样液，吸取5 μL进样，测得其加标样液中待测组分的含量，回收率及精密度结果见表6。由表6可知，样品的平均回收率在89.8%～109.6%，相对标准偏差均≤2.0%。

3 结论

国标法检测动物源食品中硝基呋喃代谢物在37 ℃下衍生16 h，乙酸乙酯、乙腈饱和正己烷反复提取净化，检测时间约为2 d，该法检测时间相对较长；检测过程较为繁杂。所以在标准方法上把提取净化一步进行了优化，采用了HyperSep Retain PEP固相萃取柱提取净化处理，基线相对较低平，噪声较弱，且比国标法GB/T 21311—2007的提取净化过程简便，大大节省了检测时间。对衍生剂体积和衍生时间的探究表明衍生剂的用量对呋喃唑酮代谢物和呋喃它酮代谢物的衍生效率影响不大，对于呋喃妥因代谢物和呋喃西林代谢物来说，随着衍生剂体积的增加，峰面积增大，衍生效率增强。若要提升呋喃妥因代谢物和呋喃西林代谢物检测的灵敏度，可通过提高2-硝基苯甲醛的量来实现；衍生时间无论4 h还是16 h都能达到检测灵敏度要求，实验可选择4 h作为衍生时间。经优化后的方法检出限与国标法一致为0.5 μg·kg-1，加标回收率在89.8%～109.6%，RSD为0.7%～2.0%，检测结果准确，可应用于猪肉中硝基呋喃代谢物的快速检测，同时本方法也为硝基呋喃代谢物检测中衍生时间及添加衍生剂的量提供了有效的指导。

参考文献

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