水产品中硝基呋喃类代谢物两种检测方法的比较

马瑞欣 张鹏燕, 李雪萍 王晓静 周凡 宋子瑾

摘 要：通过加标回收实验比较了水产品中硝基呋喃类代谢物检测方法GB 31656.13-2021和农业部783号公告-1-2006公告的差异。实验发现：GB 31656.13-2021中衍生时用0.5 mol/L盐酸，虾蟹样品的AHD有干扰，造成AHD回收率偏高；农业部783号公告-1-2006方法衍生时用0.2 mol/L盐酸，检测结果无干扰，四种硝基呋喃类代谢产物回收率均在正常范围，但对于虾蟹类产品需在加入0.2 mol/L盐酸的基础上再加入盐酸调节溶液pH 值1～2才能保证好的衍生效果。

关键词：水产品；硝基呋喃类代谢物；检测方法

硝基呋喃类药物是水产养殖中的禁用药物，主要包括呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃唑酮。硝基呋喃类药物在水产动物体内代谢速度快，呋喃唑酮主要代谢物为3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、呋喃它酮主要代谢物为5-吗啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）、呋喃西林主要代谢物为氨基脲（SEM）、呋喃妥因主要代谢物为1-氨基-2-内酰脲（AHD）。由于硝基呋喃类代谢产物在水产动物体内残留时间长，成为检测硝基呋喃类药物残留的标志物，检测方法主要为液相色谱-串联质谱法。AOZ、AMOZ、SEM和AHD四种代谢产物的分子量小，LC-MS/MS产生的二级离子太少，因此液相色谱-串联质谱法检测时需用2-硝基苯甲醛衍生。

2006年12月19日，农业部783号公告-1-2006 《水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》实施［1］，但在使用过程中发现其存在不足之处：1.试剂0.2 mol/L 盐酸溶液的配制方法错误；2.对于甲壳类水产品衍生时0.2 mol/L 盐酸酸度不够，需再加入盐酸调节pH值到1～2之间才能保证好的衍生效果；3.最后定容溶液浑浊，不易通过滤膜。4.由于内源性物质干扰，青虾SEM易检出、虾和蟹等苗种带壳处理时SEM也易检出。2022年2月1日，GB 31656.13-2021《食品安全国家标准 水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法》实施［2］。GB 31656.13-2021表述更规范合理，操作步骤简化，可操作性更强。目前两种方法均现行有效。

为了更好地应用上述两种检测方法，本文对这两种检测方法进行了内容比较和实验比对。

1 主要区别

两种检测方法在适用范围、实验细节和方法学指标上有不同，详见表1。

2 实验比对

采用草鱼、南美白对虾、梭子蟹和海参四个样品进行加标回收试验，这四个样品按照农业部783号公告-1-2006进行检测，检测结果均为阴性。本次实验加标水平为1.0、2.0 μg/kg及10 μg/kg三个梯度，所有样品和加标梯度均进行三个平行样品实验，上机分析的仪器条件完全相同。

根据使用农业部783号公告-1-2006的经验，本次使用农业部783号公告-1-2006时做了两点改变：一是由于南美白对虾和梭子蟹加入0.2 mol/L盐酸衍生后衍生产物信号低，故需要在加入0.2 mol/L盐酸基础上再滴加浓盐酸调节pH 值到1～2后，加入2-硝基苯甲醛进行衍生；二是定容溶液由5%甲醇溶液改为超纯水。其他操作完全按照783号公告-1-2006进行。

使用GB 31656.13-2021时完全按照标准进行实验。

3 实验结果分析及改进建议

3.1 标准工作曲线的线性

标准工作曲线均配制了0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 μg/L 共6个点，分别按照两个方法进行衍生和提取净化，线性拟合的结果见表2。标准溶液定量离子质量色谱图见图1。

从线性看，虽然衍生时酸的强度以及提取净化发生了变化，但线性并无明显变化，r均大于0.995，满足检测需求。

从谱图中峰的强度分析，四种代谢产物衍生时受酸度的影响变化为：AMOZ＞AOZ＞AHD＞SEM；对应内标变化与其一致。GB 31656.13 -2021酸度增强，有利于AMOZ和AOZ及其对应内标的衍生， AHD及其对应内标影响不太明显，SEM及其对应内标基本不受影响。

3.2 回收率及精密度

两种方法的回收率和精密度见表2。

由表2可以看出，采用GB 31656.13 -2021方法，除南美白对虾和梭子蟹的AHD回收率均偏高，其它均满足要求；而农业部783号公告-1-2006方法的所有回收率均在正常范围内。

为进一步查找原因，对三个南美白对虾样品和一个梭子蟹样品分别按两种方法进行检测，发现按照GB 31656.13 -2021方法检测时，这四个样品均可出现AHD干扰，见图2第一行谱图中保留时间为3.21 min的峰；而按照农业部783号公告-1-2006方法检测时AHD均无干扰，见图2第二行谱图。分析原因为：GB 31656.13 -2021衍生时加入0.5 mol/L 盐酸，溶液pH＜1；农业部783号公告-1-2006衍生时加入0.2 mol/L盐酸溶液并调节pH 值到1～2。说明衍生酸度增大至0.5 mol/L时对AHD产生了干扰。

由于四种衍生产物极易溶于水，实验最后定容溶液用水，经证实对离子的质量色谱图强度和实验结果均无影响。

3.3 实验改进建议

鉴于两种检测方法的比对结果，对两种检测方法的衍生和提取净化步骤取长补短，优化如下：

取试料2 g（精确至±0.01 g）于50 mL聚丙烯离心管中，准确加入混合内标工作液100 μL（内标的量可根据仪器灵敏度进行改变），涡旋混合1 min，加入0.2 mol/L盐酸溶液5 mL（甲壳类需要再滴入浓盐酸调节pH值到1～2）、0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液，涡旋混合1 min，置于恒温振荡器中，37 ℃避光振荡16 h。

取出离心管冷却至室温，加入磷酸氢二钾溶液3～5 mL调pH值到7.0～7.5，加入乙酸乙酯8 mL，涡旋振荡30 s，6 000 r/min离心5 min，取上清液至10 mL离心管中，40 ℃氮气吹干，准确加入1.0 mL水溶解残留物，再将溶液转移至1.5 mL离心管中，以14 000 r/min的轉速离心10 min，过0.22 μm滤膜供LC-MS/MS分析。优化后的方法回收率和精密度均满足检测要求，见表3。

4 结论

硝基呋喃类代谢物用2-硝基苯甲醛衍生时用0.5 mol/L盐酸对虾蟹等甲壳类样品AHD有干扰。建议仍采用农业部783号公告-1-2006方法的0.2 mol/L盐酸进行衍生，但对虾蟹等甲壳类注意调节其衍生前溶液pH值在1～2之间，这样既保证了衍生产物的信号强度，也消除了AHD的干扰。

参考文献：

[1]中华人民共和国农业部.水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法：农业部783号公告-1-2006[S].北京，中国农业出版社，2006：1-8.

[2] 中华人民共和国农业农村部，中华人民共和国国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定 液相色谱-串联质谱法：GB 31656.13-2021[S].北京，中国农业出版社，2022：1-6.

（收稿日期：2022-05-07）