复合生物保鲜剂对冰鲜菊黄东方鲀微生物多样性变化的影响

邱楚雯，施永海，王韩信，袁新程，徐嘉波

复合生物保鲜剂对冰鲜菊黄东方鲀微生物多样性变化的影响

邱楚雯，施永海*，王韩信，袁新程，徐嘉波

(上海市水产研究所，上海市水产技术推广站，上海 200433)

为探究4种复合生物保鲜剂对冰鲜菊黄东方鲀的作用效果，测定了菌落总数并采用Illumina Miseq 高通量测序方法对复合生物保鲜剂处理的菊黄东方鲀肌肉细菌的16S rRNA基因的2个高变区（V3～V4）进行测序分析。结果显示，复合生物保鲜剂A（0.5%茶多酚+ 0.2%乳酸链球菌素+ 0.3%溶菌酶）可使菊黄东方鲀贮藏期间的菌落总数显著降低（< 0.05）。冰鲜18 d时的细菌群落多样性最高，表明复合生物保鲜剂A可将菊黄东方鲀冰鲜保存时间延长到18 d或以上。复合生物保鲜剂B（0.5%茶多酚+ 0.2%乳酸链球菌素）、C（0.2%乳酸链球菌素+ 0.3%溶菌酶）和D（0.5%茶多酚+ 0.3%溶菌酶）可将菊黄东方鲀冰鲜保存时间货架期延长至15 d左右。冰鲜条件下菊黄东方鲀肌肉5组15个样品细菌分布于21门187属，优势菌门分别为变形菌门、放线菌门和厚壁菌门，主要优势菌属包括假单胞菌属、无色杆菌属与红球菌属。复合生物保鲜剂改变了菊黄东方鲀肌肉的群落结构，菊黄东方鲀特定腐败菌可能为假单胞菌属。试验结果为后期开展菊黄东方鲀保鲜技术研究提供了理论参考。

菊黄东方鲀；冰鲜；复合生物保鲜剂；菌群结构；高通量测序

菊黄东方鲀()为鲀科东方鲀属水产鱼类，主要分布于东海、黄海和渤海湾沿岸水域[1]。因其经济价值高、口感鲜美被认为是我国最具经济效益的鱼类之一。菊黄东方鲀无毒的肌肉具有独特味道，其主要成分为甘氨酸、赖氨酸、丙氨酸和5-磷酸肌苷(5 -IMP)等氨基酸和核苷酸相关化合物[2-3]。然而，菊黄东方鲀高蛋白质和脂肪酸含量的特点，为微生物的生长繁殖提供了条件，使其极易腐败，导致营养质量损失，降低了经济价值[4-5]。同时，鱼类死后会发生脂质氧化、蛋白质功能性流失等生化变化，由于内源酶与微生物的代谢活动，使鱼类感官和营养特性发生变化，导致鱼体腐败，缩短了货架期[6]。因此，有必要采取相应保鲜处理手段延缓水产品的品质劣变，延长贮藏货架期。

目前，延长鱼类货架期的方法有很多，如低温保鲜、化学处理、辐照保鲜、高压保鲜和气调贮藏等[7]。低温保鲜是最常用的鱼类保鲜技术之一，能有效保持鱼肉品质。然而，冷藏只能减缓微生物的生长速度，不能完全抑制细菌生长[8]。腐败菌能产生水解酶、脂肪酶和蛋白酶，对鱼肉产生不良影响。抑制微生物生长是延缓菊黄东方鲀腐烂的关键问题。化学防腐剂已被用于鱼类以抑制不良细菌的生长，但过度使用化学防腐剂已引起消费者的关注[9]。生物保鲜剂是指从生物（动物、植物、微生物等）中提取或利用生物技术获得的具有保鲜作用且对人体安全的物质。近年来，生物保鲜剂因其杀菌效果好且天然安全等特点，得到研究人员普遍重视[10]。目前，茶多酚（tea polyphenols, TP）、乳酸链球菌素（nisin，NIS）、溶菌酶（lysozyme, LYS）等符合GB2760—2014食品添加剂使用标准规定的天然保鲜剂，被广泛应用于水产品保鲜当中[11]。TP是一种从绿茶中提取的天然化合物，具有广谱抗菌活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等有较强的抑制作用[12]。TP可通过与金属离子螯合，抑制氧化酶活动，具有较强的抗氧化活性[13]。NIS是由乳酸乳球菌亚种产生的一种细菌素[14]，它的抗菌活性机制涉及细菌表面阴离子磷脂的相互作用和孔隙的形成，以及细菌膜上质子动力的耗散[15]。它可以抑制许多革兰氏阳性细菌，包括食源性病原体(如单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌)和腐败细菌(如乳酸菌、芽孢杆菌)的生长[16]，但单用NIS对革兰氏阴性菌的抗菌作用较弱[17]。LYS是一种从牛奶和鸡蛋等食物中提取碱性酶，对革兰氏阳性菌具有抗菌活性，但其作用机制与NIS有所不同。LYS能水解细菌细胞壁的主要成分肽聚糖中-乙酰胞壁酸和-乙酰氨基葡萄糖之间的β 1, 4-糖苷键。LYS水解破坏了细胞壁结构的完整性，最终破坏细菌细胞[18]。由于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的结构不同，LYS不能通过革兰氏阴性菌外膜的脂多糖(LPS)层直接接触其内部的肽聚糖[19-20]，因而LYS对革兰氏阴性菌没有明显的抑菌作用。

生物保鲜剂的特异性表明在食品保鲜中使用单一的保鲜剂很难获得预期的效果。将不同来源的天然保鲜剂进行组合具有降低抗菌剂量、降低成本和拓宽抗菌谱等优点[21]。0.4%大蒜素、0.32%茶多酚和0.34%葡萄籽提取物组成的复合生物保鲜剂可明显延缓鲈鱼脂质氧化，对大口黑鲈鱼肉有较好的保鲜效果[22]。NIS和荞麦胰蛋白酶抑制剂联合使用可有效抑制鲈鱼鱼糜4℃贮藏过程中微生物生长[23]。在原位合成纳米Si Ox/CS涂膜中加入LZM、TP两种保鲜剂，其保鲜性能最优，鱼片的货架期可延长8～10 d[24]。目前，尚未有探索茶多酚、溶菌酶以及乳酸链球菌素复合对菊黄东方鲀保鲜效果的研究。本研究利用高通量测序技术分析了复合保鲜剂对菊黄东方鲀微生物群落结构变化的影响。对菊黄东方鲀微生物群落结构动态变化的分析，可为复合保鲜剂的作用效果提供理论参考，将有助于开发有效、无毒的保鲜剂来延长菊黄东方鲀的货架期。由于菊黄东方鲀大多在冰鲜条件下进行运输，因而研究冰鲜条件下复合生物保鲜剂对菊黄东方鲀的作用效果更有意义。

1 材料与方法

1.1 材料

鲜活菊黄东方鲀（体重157.4 g ± 36.6 g，体长18.3 cm ± 1.3 cm），当日早晨捕捞于上海市水产研究所奉贤科研基地池塘，为基地人工繁养样品。原料经冰猝死后，保持冰鲜运至实验室进行试验。菊黄东方鲀运送至实验室后，切取鱼肌肉，用无菌冷水清洗干净，用吸水纸将肉表面的水分吸干，浸泡在不同种类复合生物保鲜剂溶液中5 min，捞出置于不锈钢网篮中自然沥干至肉块表面无水滴，装于自封袋内冰鲜保存（0 ℃），保存时间分别为0、3、6、9、12、15和18 d 。对照组（CK组）直接装袋冰鲜保存。课题组此前在不同浓度茶多酚、乳酸链球菌素和溶菌酶对菊黄东方鲀保鲜效果的试验中，确定了0.5% TP、0.2% NIS及0.3% LYS为最适浓度[25]。根据此前研究结果，设置复合生物保鲜剂处理组，共分为4组，分别是：A组为0.5% TP + 0.2% NIS + 0.3% LYS；B组为0.5% TP + 0.2% NIS；C组为0.2% NIS + 0.3% LYS；D组为0.5% TP + 0.3% LYS；CK组为空白对照组。其中冰鲜保存6、12和18 d的不同处理组与对照组用于进行高通量测序分析，分别表示为A1、A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，CK1、CK2、CK3。

1.2 方法

1.2.1 菌落总数的测定 按照GB4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》的方法进行测定[26]。

1.2.2 DNA提取、PCR扩增和Miseq测序 每个样品(12.5 g)放入无菌均质袋中，加入25 mL无菌生理盐水(0.85 g·100 mL-1)，均质10 min。经200目无菌纱布过滤后，滤液1 000 r·min-1离心10 min后，将上清液于10 000 r·min-1离心10 min后弃上清液，沉淀重悬浮于1 mL TE buffer中，﹣70℃冻存备用。

根据DNA提取试剂盒(FastDNA®SPIN Kit) (MP Biomedicals, 美国)说明书进行菊黄东方鲀肌肉样品DNA抽提，DNA纯度和浓度利用NanoDrop 2000进行检测，并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；对细菌16S rRNA基因V3～V4可变区进行PCR扩增，引物为338F (5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3＇)和806R (5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇)。根据Illumina MiSeq 平台标准操作规程将扩增片段构建测序文库后，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行高通量测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

1.3 数据分析

使用UPARSE version 7.1软件对数据进行处理，根据97%相似度水平对序列进行操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)聚类，对物种进行注释与评估。使用RDP Classifier version 2.2对Silva数据库进行分类，置信阈值为0.7。利用Mothur v.1.30.1程序计算Alpha多样性。使用QIIME软件进行Beta多样性分析(主成分分析、群落Heatmap图)。利用SPSS16.0 进行方差分析，显著性水平设< 0.05为显著。

2 结果与分析

2.1 复合保鲜剂对菊黄东方鲀菌落总数的影响

由表1可知，A组、B组、C组和D组样品在贮藏18 d的菌落总数分别为4.25、5.73、6.25和6.47l lg (CFU·g-1)显著低于对照组（< 0.05）。C组样品在贮藏12 d的菌落总数分别为3.37 lg(CFU·g-1)显著低于对照组（< 0.05），B组、C组和D组样品在贮藏18 d的菌落总数差异不显著（> 0.05）。根据本课题组此前研究结果，当菊黄东方鲀菌落总数为5 lg（CFU·g-1）左右则接近食用上限，据此可推测保存时间[10]。表明复合生物保鲜剂具有一定保鲜作用，A组可延长至18 d或以上，B组、C组和D组可延长至15 d左右，而CK组的保鲜时间为12 d左右。

2.2 复合保鲜剂对菊黄东方鲀微生物多样性影响

2.2.1 16S rRNA基因测序的特点 高通量测序结果显示，5组15个样本的平均序列数为46 020条。97%相似度水平下OTUs数为510个，涵盖了21个门，39纲，91目，135科，187属。不同样本的OTUs数为25～204个；有关群落丰富度的Ace指数为43.53～273.15，Chao指数在38.20～222.00；有关群落多样性的香农Shannon指数从0.26到0.95，Simpson指数为0.52～0.90，样本中物种覆盖度大于99.87%（从99.87%～99.97%）（表2），表明本次测序基本代表了样本中微生物的真实情况。

表1 复合生物保鲜剂对菊黄东方鲀菌落总数的影响

注：A组为0.5 T+ 0.2 N+ 0.3 L；B组为0.5 T + 0.2 N；C组为0.2 N + 0.3 L；D组为0.5 T + 0.3 L；CK组为对照组。A1-CK1: 6 d;A2-CK2:12 d; A3-CK3:18 d。同列数据中标有不同字母表示差异显著（< 0.05）。

Ace指数和Chao指数反映了菌群丰度；而Shannon指数和Simpson指数则反映的是菌群的多样性。样本中细菌的丰富度总体上排序为：B组>D组>A组>C组>CK组（表2）。随着贮藏时间的增加，A组和D组菌群丰度呈现先增长后降低的趋势，C组和CK组总体上呈现下降趋势；A组、C组及CK组细菌多样性呈现增加的趋势；B组和D组样本中细菌的多样性则呈现先增加后降低的变化趋势。复合生物保鲜剂处理的菊黄东方鲀肌肉样品中，A组在冰鲜18 d时Shannon指数最高，Simpson值最低，表明此时细菌多样性最高。推测可能是由于复合生物保鲜剂（0.5%TP + 0.2%NIS + 0.3%LYS）处理后菊黄东方鲀冰鲜12 d前致腐菌生长受到一定抑制，而在12～18 d，此时菊黄东方鲀的营养物质仍较为丰富，细菌生长迅速。

表2 在97%相似度水平上样品中细菌的丰富度和多样性指数

注：A组为0.5 T + 0.2 N + 0.3 L；B组为0.5 T + 0.2 N；C组为0.2 N + 0.3L；D组为0.5 T + 0.3 L；CK组为对照组。A1-CK1: 6 d;A2-CK2: 12 d;A3-CK3: 18 d。

图1 基于门水平上的细菌群落结构

Figure 1 The bacterial community structure at the phylum levels

图2 除了变形菌门外基于门水平的细菌群落结构

Figure 2 The bacterial community structure except Proteobacteria at the phylum levels

图3 基于属水平上的细菌群落结构

Figure 3 The bacterial community structure at the genus classification levels

2.2.2 细菌群落组成的差异 菊黄东方鲀的15个样品细菌分布于21个门，其中3个门的丰度大于1%（至少有一组丰度大于1%）。如图1所示，优势菌门分别为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteriota和厚壁菌门Firmicutes。按占10%以上为优势菌门统计，不同复合保鲜剂处理后的菊黄东方鲀肌肉样品中变形菌门始终占据优势，相对丰度为96.99%～99.72%。菊黄东方鲀在冰鲜条件下贮藏6、12和18 d后，A组细菌群落中变形菌门占比呈现先减少后增长的趋势，占比分别为98.89%、98.41%和99.08%；B组、C组及CK组细菌群落中变形菌门占比的变化趋势与A组相同。D组有所不同，细菌群落中变形菌门占比分别为98.12%、99.99%和99.06%。如图2所示，A组、B组、D组及CK组细菌群落中放线菌门的变化趋势呈现先增长后较少的特点。放线菌门和厚壁菌门在C组和D组的占比相对较大。C组、D组中贮藏12 d样品细菌群落中厚壁菌门的占比分别为1.57%和1.92%。unclassified k norank d Bacteria菌门在贮藏12 d的B组样品中占比较高（1.11%），而在其他组样品中的占比较低。

图4 除了假单胞菌属外基于属水平上的细菌群落结构

Figure 4 The bacterial community structure exceptat the genus classification levels

5组15个样品的细菌分布于187个属，其中5个属的丰度>1%。如图3所示，假单胞菌属、无色杆菌属r和红球菌属为主要优势菌属，还包括unclassified_k_norank_d_Bacteria和芽孢杆菌。不同样品组的优势细菌（丰度大于5%的细菌）有假单胞菌属和无色杆菌属。贮藏6和12 d样品中C组的无色杆菌属占比相对较低（图4）。随着贮藏时间的延长无色杆菌属和红球菌属占比减少，假单胞菌属占比增加。表明菊黄东方鲀冰鲜条件下肌肉的主要腐败菌为假单胞菌属。

主坐标分析结果如图5所示：PCA获得主成分PC1的方差贡献率为98.17%，主成分PC2的方差贡献率为1.55%。菊黄东方鲀冰鲜6、12和18 d的样品之间距离较近，表明不同保存时间的菊黄东方鲀肌肉微生物群落组成较为相似。不同复合生物保鲜剂处理组的样品各自分开，表明微生物群落分布不同。

图5 基于OTU水平上的主成分分析

Figure 5 The principal component analysis (PCA) of the bacterial community at OTU level

Heatmap图用于分析和比较所有样品的细菌群落的组成及动态变化。 如图6所示，A组、B组、C组和D组冰鲜保存18 d的样本与CK组不同保存时间的样本群落结构相似性较高，表明复合生物保鲜剂对菊黄东方鲀肌肉群落结构的改变起到一定的作用。

图6 基于属水平的菊黄东方鲀肌肉群落Heatmap图分析

Figure 6 Community heatmap analysis at the genus-level of different microbiota inmuscle

3 讨论与结论

微生物的作用是导致水产品变质的重要原因之一[27]。由于微生物可以在低温下存活和增殖[28]，抑制或延缓微生物的生长可防止水产品变质。新鲜水产品的细菌总数为2～4lg (CFU·g-1)，初期腐败TVC为6 lg (CFU·g-1)左右，当增加到7～8 lg (CFU·g-1)时，便会感到强烈的腐败臭味。但不同水产品腐败时细菌总数不完全相同。此前本课题组研究认为菊黄东方鲀当菌落总数为5 lg (CFU·g-1)左右则接近食品上限[25]。本研究中复合生物保鲜剂（TP、NIS和LYS）能够显著抑制细菌生长，菊黄东方鲀贮藏18 d菌落总数仅为4.25 lg (CFU·g-1)，表明菊黄东方鲀贮藏18 d 仍未达到食用上限。Wang等研究发现曲酸和TP可将花鲈的保鲜期延长5～6 d[29]。Li等利用TP和迷迭香浸出物有效抑制鲫鱼的微生物生长，延长其冷藏货架期6～8 d[30]。Ju等研究发现真空包装与茶多酚相结合分别在0 ℃和4 ℃条件下的延长货架期4～6 d和3～4 d[31]。Zhang等研究认为虽然使用牛至和/或NIS并没有改变草鱼样品的优势菌群，但它们显著降低了总活菌数，延长了草鱼的货架期[32]。本研究与此前研究结果类似，复合保鲜剂可延长水产品的货架期，但延长天数略有不同。与对照组相比，复合生物保鲜剂A（TP+NIS+LYS）可将冰鲜（0 ℃）条件下菊黄东方鲀的保存时间延长3 d以上。保鲜剂对水产品货架期的影响不同，这可能是由于不同保鲜剂对不同水产品的作用效果不同。复合保鲜剂对菊黄东方鲀的货架期的影响有待结合其他指标进一步研究确定。

本研究中A、C组12 d样品的菌落总数分别为3.14和3.37 lg（CFU·g-1）；而A、C组18 d样品的菌落总数分别为3.63和4.84 lg（CFU·g-1）。C组为NIS和LYS的组合，主要对革兰氏阳性菌有抑制作用，表明贮藏前期菊黄东方鲀的主要腐败菌为革兰氏阳性菌，贮藏后期由于A组中添加了具有广谱抗菌性TP，TP是对NIS、LYS的补充，提高了整体的保鲜效果。表明冰鲜贮藏后期菊黄东方鲀的腐败菌以革兰氏阴性菌为主。B、D组15 d的菌落总数分别为4.59、4.49 lg（CFU·g-1），显著低于C组，抑菌效果优于C组但不及A组，推测可能是B、D组加入了具有广谱抗菌作用的TP，提高了复合保鲜剂的作用效果，弥补了NIS、LYS的不足。此外，高通量测序结果表明，CK组在6、12 d时细菌的丰度和多样性较高，而在18 d其丰度和多样性大幅降低。表明随着贮藏时间的延长，腐败菌生长加快，但由于营养物质分解后降低了营养价值导致细菌的丰度下降。A组丰富度和多样性始终维持在较高水平，表明菊黄东方鲀中相关的特定腐败菌并未形成优势菌群。高通量测序分析结果与菌落总数测定结果互相补充，测定菌落总数可反映样本中可培养细菌的总体数量；高通量测序分析是对可培养和不可培养细菌进行整体分析，可为复合保鲜剂对菊黄东方鲀保鲜效果提供理论参考。

冷藏鱼特有的腐败菌主要是革兰氏阴性菌，如假单胞菌和希瓦氏菌。假单胞菌是需氧冷藏条件下水产品的主要破坏因素[33]。Sun等研究发现，植酸和植酸与LYS复合作用可显著降低假单胞菌的比例[34]。Li等[30]研究发现，冷冻与TP配合作用可抑制假交替单胞菌()、冷杆菌()和肉杆菌()的生长。本研究推测菊黄东方鲀冰鲜条件下肌肉的主要腐败菌为假单胞菌属，这与之前的研究结果类似。Nie等研究发现，与单独使用海藻酸钠相比，添加TP可有效提高日本鲈鱼的保鲜效果[35]。Hui等研究发现壳聚糖与NIS复合作用能减少大黄鱼腐败气味、抑制微生物生长和蛋白质分解等[36]。Wang等在冷藏 (4 ℃) 下利用胶原-LYS涂层可抑制新鲜三文鱼片的细菌生长[37]。同样，LYS和壳聚糖的包衣能有效地维持大黄鱼贮藏期间的品质[38]。Boyacı等使用含有LYS和LYS+绿茶提取物GTE的凝胶垫能防止冷熏鲑鱼上的病原菌李斯特菌Listeria的生长[39]。Zhang等利用TP与LYS的复合制剂协同抑制常见腐败菌希瓦氏菌和荧光假单胞菌的生长[40]。Sozbilen等研究发现LYS和NIS复合的抑菌活性优于LYS和NIS单独使用组[41]。本研究发现C组（NIS和LYS）的细菌多样性低于其他处理组，假单胞菌的占比高于A、B、D组，这可能是由于NIS和LYS主要是抑制革兰氏阳性菌，而对革兰氏阴性菌的作用较弱；但TP和NIS组也存在同样的问题，可见多种保鲜剂的复合使用有助于弥补单一保鲜剂的不足。

冰鲜条件下，菊黄东方鲀特定腐败菌是假单胞菌属。三者复合的生物保鲜剂（茶多酚、乳酸链球菌素和溶菌酶）使得菊黄东方鲀鱼肉保持了较高水平的微生物多样性，可将其冰鲜保存时间延长到18 d或以上。茶多酚与乳酸链球菌素、茶多酚与溶菌酶、乳酸链球菌素与溶菌酶两者复合的生物保鲜剂可将菊黄东方鲀鱼肉冰鲜保存时间延长至15 d左右。

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Effects of compound biological preservative on microbial community diversity ofduring chilled storage

QIU Chuwen, SHI Yonghai, WANG Hanxin, YUAN Xincheng, XU Jiabo

(Shanghai Fisheries Technical Extension Station, Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai 200433)

The effects of compound biological preservative on microbial community diversity ofduring chilled storage were investigated. The aerobic plate count was measured and Illumina MiSeq high-throughput sequencing method was used to analyze the two high-variation regions (V3-V4) of 16S rRNA gene of microbial structure of themuscle treated with the compound biological preservatives. The results showed that compound biopreservative A (0.5% tea polyphenol + 0.2% nisin + 0.3% lysozyme) significantly reduced the aerobic plate count (< 0.05). The diversity of the bacterial community was the highest at the18thday, which indicated that compound biological preservative A could prolong the preservation time of freshto 18 days or more. Compound biopreservatives B (0.5% tea polyphenol + 0.2% nisin), C (0.2% nisin + 0.3% lysozyme) and D (0.5% tea polyphenol + 0.3% lysozyme) could prolong the preservation time of freshto about 15 days. Fifteen samples from five groups ofmuscle under chilled storage were distributed in 187 genera, 21 phyla, with dominant phyla including Proteobacteria, Actinobacteriota and Firmicutes.,andwere the dominant genera. The compound biological preservatives could change the community structure ofmuscle, andmay be the specific spoil organisms of. This study provides theoretical references for the future research on preservation technology of.

; chilled; compound biological preservative; bacterial community structure; high-throughput sequencing

S983

A

1672-352X (2023)02-0267-08

2022-06-02

福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室开放课题(2019fjscq09)资助。

邱楚雯，工程师。E-mail：nanqiuchuwen.05@163.com

通信作者:施永海，研究员。E-mail：yonghais@163.com

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.009

2023-05-12 10:27:12

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20230511.1152.018.html