双氢杨梅树皮素对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤及TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的影响

朱海滨，方 静，唐木兰，池鑫宇，曾春晖，杨 柯

（广西中医药大学药学院，南宁 530200）

急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）是由直接因素或间接因素（创伤、输血和感染）引起的，导致弥漫性肺间质及肺泡水肿和急性缺氧性呼吸功能不全［1，2］。ALI 以弥漫性急性肺部炎症为主要病理特征，伴有先天性和适应性免疫细胞的浸润、促炎和抗炎细胞因子平衡的转换［3，4］。TLR4/MyD88/NF-κB信号通路已被报道参与ALI，在配体刺激TLR4 后，TLR4 触发下游MyD88/NF-κB 信号，导致各种促炎细胞因子的产生，加重肺损伤［5，6］。双氢杨梅树皮素（Ampelopsin，APS）作为藤茶中主要黄酮类成分之一，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、保护心血管和增强免疫等作用［7，8］。另有研究发现，APS 在急性肺损伤和肺纤维化中发挥保护肺的作用［9-11］。然而，目前关于APS 在ALI 中发挥的作用及其具体机制尚不明确，因此本研究通过体内急性肺损伤小鼠模型，研究APS 通过调控TLR4/MyD88/NF-κB 经典炎症信号通路在LPS 诱导的急性肺损伤中的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 6—8 周龄SPF 级KM 小鼠，雌雄各半，体重18~22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，动物使用许可证号：SYXK（桂）2019-0001。

1.1.2 主要试剂与仪器 双氢杨梅树皮素（纯度≥98%，由广西中医药大学中药化学实验室提供）；脂多糖（北京索莱宝科技有限公司，货号：L8880）；醋酸地塞米松（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：170761）；髓过氧化物酶测试盒（南京建成生物工程研究所，批号：20190717）；苏木素染液（武汉赛维尔生物技术有限公司，货号：G1005-1）；伊红染液（武汉赛维尔生物技术有限公司，货号：G1001）；小鼠TNF-α（欣博盛生物科技有限公司，批号：M191231-102a）；小鼠IL-1β（欣博盛生物科技有限公司，批号：M191231-001a）；TLR4 抗体（Thermo Fisher Scientic，货号：MA5-16216）；MyD88 抗体（Thermo Fisher Scientic，货号：MA5-15762）；IκBα 抗体（Thermo Fisher Scientic，货号：MA5-15132）；p-IκBα 抗体（Thermo Fisher Scientic，货号：MA5-15087）；p65 抗体（Thermo Fisher Scientic，货号：33-9900）；p-p65 抗体（Thermo Fisher Scientic，货号：MA5-15160）。Ani-Res2005 动物肺功能分析系统购自北京贝兰博科技有限公司；Synergy H1 酶标仪购自美国BioTek Instruments 公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、给药及急性肺损伤小鼠模型的构建 取72 只健康KM 小鼠，按体重随机分为6 组：正常（CON）组、模型（LPS）组（8 mg/kg）、阳性（DEX）组、APS 高（APS-H）剂量组、APS 中（APS-M）剂量组、APS 低（APS-L）剂量组，每组12 只，雌雄各半。APS-H、APS-M、APS-L 剂量组小鼠分别以APS 溶液（50、25、12.5 mg/kg）灌胃，4 次/d，即200、100、50 mg/kg；DEX组予以地塞米松溶液（7.5 mg/kg）灌胃；CON 组与LPS 组给予等量生理盐水。第三天第一次给药后1 h，0.4%戊巴比妥钠溶液（0.15 mL/10 g）腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠仰卧位固定于木板上，调整到合适角度，照明灯照亮小鼠咽喉部位，随后打开小鼠口腔，用压舌板向下抵住小鼠舌头以便于暴露气道口，然后将LPS 溶液（40 μL/只）从气管向肺内注入，CON 组小鼠按照上述方法向气管内滴入40 μL无菌生理盐水，并于造模后2、4、8 h 进行后续给药。

1.2.2 肺功能的检测 小鼠腹腔注射0.4%戊巴比妥钠溶液（0.2 mL/10 g）麻醉后，取仰卧位固定于木板上，行气管插管后，将小鼠转移至体描箱内动态监测小鼠呼吸状态，设定呼吸机的呼吸频率为90次/min，呼吸比为20∶10，待系统显示小鼠自主呼吸消失，进入平稳阶段后，记录3 min 内吸气相气道阻力（RL）和呼气相气道阻力（Re）的最小值、肺动态顺应性（Cdyn）的平均值、每分钟最大通气量（MVV）的平均值，试验完成后停止采集数据并进行保存。

1.2.3 肺组织匀浆的制备和匀浆中髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）活性的检测 摘取除左下肺以外50 mg 左右的肺组织在预冷的生理盐水中漂洗，洗去血液后，滤纸吸干，称重后迅速用眼科剪将肺组织剪碎，加入10 mL EP 管中。随后加入预冷的匀浆介质，匀浆介质重量为肺组织的9 倍。EP 管置于冰上，将电动匀浆器伸入管内进行匀浆制备，机器每次工作10 s、休息30 s，如此反复3~5 次。制备好的匀浆液以10 000 r/min 离心10 min，所得上清液按MPO 测试盒说明书进行MPO 活力测定。

1.2.4 ELISA 法检测BALF 中炎症因子（TNF-α、IL-1β）的含量 从-80 ℃中取出冻存的BALF 上清液，置于室温下自然解冻，4 ℃下1 000 r/min离心15 min，取上清液，按ELISA 试剂盒说明书进行相关指标的检测。

1.2.5 肺组织病理学观察 将小鼠左肺下叶组织固定于4%多聚甲醛溶液中，48 h 后进行脱水、透明和石蜡包埋。用切片机作4 μm 厚切片，并进行HE 染色，光学显微镜下观察并拍照。根据评分标准［12］进行肺组织病理学评分（表1）。

表1 评分标准

1.2.6 Western blotting 检测肺组织中TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65 蛋白表达 从-80 ℃中取出肺组织，解冻后剪碎，加入提取试剂（m∶V=1∶9），在冰上混合静置30 min 后低温快速匀浆，将匀好的肺组织匀浆液倒入1.5 mL EP 管，4 ℃下12 000 r/min离心20 min。取上清液，用BCA 试剂盒进行蛋白定量，Loading buffer 试剂变性后保存于-80 ℃。利用Western blotting 检测TLR4、MyD88、IκBα、p-IκBα、p65 和p-p65 表达情况，应用Gel Doc 2000 Gel Documentation System 成像，通过Image Lab 对膜上蛋白条带进行扫描和定量分析。蛋白表达量以条带的调整体积值表示，β-actin 作为内参，以目的条带调整体积值与β-actin 调整体积值的比值对肺组织中目的蛋白表达情况进行半定量分析。

1.2.7 统计分析 应用SPSS11.5 软件进行统计学分析，数据以平均值±标准差（x+s）表示，两组间比较采用独立t检验，P＜0.05（0.01）为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 APS 对LPS 诱导的急性肺损伤小鼠肺功能的影响

如表2 所示，LPS 气管内滴注后8 h，小鼠的吸气阻力与呼气阻力极显著高于CON 组（P＜0.01），而APS-H、APS-M 和DEX 给药后显著降低吸气阻力（P＜0.05），而对呼气阻力无明显影响（P＞0.05）；另外，LPS 滴注极显著降低小鼠的肺动态顺应性与每分钟最大通气量（P＜0.01），而APS-H、APS-M 给药后显著提高小鼠肺动态顺应性和每分钟最大通气量（P＜0.05）。APS 可明显改善LPS 诱导的急性肺损伤小鼠的肺功能。

表2 小鼠肺功能指标检测情况表

2.2 APS 对LPS 诱导的急性肺损伤小鼠中MPO活力的影响

由图1 可知，LPS 气管内滴注后，小鼠肺组织匀浆液中MPO 活力显著升高（P＜0.05），而APS-H 和DEX 给药可显著降低MPO 活力（P＜0.05），APS 可明显降低LPS 诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中中性粒细胞的浸润程度。

图1 小鼠肺组织中MPO 活力

2.3 APS 对LPS 诱导的急性肺损伤小鼠肺组织病理学的影响

由图2 及表3 可知，LPS 滴注后，小鼠肺脏各级支气管分支结构不完整；肺泡上皮细胞空泡变性或坏死，胞质染色不均或空泡化，胞核固缩或碎裂，少量细胞脱落于肺泡腔内；肺泡间质可见少量或多量核呈杆状的中性粒细胞及圆形深染的淋巴细胞浸润；肺组织病理评分极显著升高（P＜0.01）；而APS 及DEX 给药后，小鼠肺脏各级支气管分支结构较为正常；少量肺泡上皮细胞空泡变性或坏死，肺泡间质可见少量中性粒细胞及淋巴细胞浸润；与LPS 组相比，DEX 组和APS 各剂量组肺脏病理评分，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 小鼠肺泡炎病理情况（HE 染色）（400×）

表3 肺脏损伤病理学分级评分统计结果

2.4 APS 对LPS 诱导的小鼠急性肺损伤中炎症因子释放的影响

如图3、图4 所示，LPS 滴注后，小鼠BALF 中的TNF-α 和IL-1β 含量极显著或显著升高（P＜0.01、P＜0.05），而APS-H、APS-L 和DEX 给药可极显著降低BALF 中TNF-α 和IL-1β 的含量（P＜0.01），提示APS可明显减轻LPS 诱导引起的炎症反应。

图3 小鼠支气管肺泡灌洗液中TNF-α 的含量

图4 小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-1β 的含量

2.5 APS 对LPS 诱导的急性肺损伤小鼠中TLR4/MyD88/ NF-κB 信号通路的影响

由图5 可知，LPS 滴注后，小鼠肺组织中TLR4、MyD88、p-IκB、p65 及p-p65 蛋白表达极显著上调（P＜0.01），IκB 蛋白表达极显著下调（P＜0.01），提示LPS 诱导激活了急性肺损伤小鼠体内的TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路。而APS 及DEX 给药后可显著下调TLR4、MyD88、p-IκB、p65 及p-p65 蛋白表达（P＜0.05），上调IκB 蛋白表达（P＜0.05），提示APS给药可明显抑制LPS 诱导的急性肺损伤小鼠体内TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的激活。

图5 小鼠TLR4/MyD88/NF-κB 通路中关键蛋白质表达情况

3 小结与讨论

ALI 是一种严重的炎症和损伤性疾病，可引起呼吸衰竭和肺功能受损，死亡率高达30%［12，13］。LPS被广泛应用于构建ALI 动物模型，能够引起炎症反应而导致肺损伤。LPS 刺激引起炎症介质的释放，诱导ALI 的发生［14］。本研究采用无创式气管内滴注LPS（8 mg/kg）复制急性肺损伤小鼠模型。通过检测小鼠肺功能发现，LPS 气管内滴注提高了吸气阻力和呼气阻力，提示小鼠肺泡变窄肺容积降低，呼吸受阻；另外，LPS 滴注降低了肺动态顺应性和每分钟通气量，提示肺容积降低、肺脏弹性降低、肺功能通气障碍。而APS 干预后可通过增大肺容积、增加肺部通气量以及改善肺脏弹性等，缓解肺通气功能能障碍，对呼吸功能有较大改善，对ALI小鼠肺功能具有保护作用。

中性粒细胞是感染、炎症和组织损伤的主要效应细胞［15］。急性肺损伤的发生也常常伴随着中性粒细胞浸润［16］。本研究中检测了MPO 活力来间接观察中性粒细胞在LPS 诱导ALI 小鼠肺组织中的浸润情况。MPO 主要存在于中性粒细胞中，与中性粒细胞的活化有很强的相关性，通常选择MPO 作为中性粒细胞的活化标志物［17］。本研究发现LPS 滴注后提高了小鼠肺组织中MPO 活力，而APS 干预后降低了MPO 活力，提示APS 干预可有效减轻LPS 诱导的中性粒细胞的聚集和活化。研究表明，BALF 中促炎因子TNF-α、IL-1β 含量是评价肺部炎症反应严重程度的关键指标［18］。通过进一步的ELISA 试验发现，APS 给药明显降低BALF 中的TNF-α 以及IL-1β含量，提示APS 干预能够有效地缓解LPS 刺激引起的肺部炎症。

Toll 样受体（TLRs）是一类模式识别受体家族，是先天免疫系统的关键元件［19］。其中TLR4 属于Ⅰ型跨膜受体蛋白，位于胞膜外的结构域可识别多种病原体，位于细胞内的结构则参与信号转导。MyD88 是TLR 信号通路上重要的接头蛋白，可通过C 端的TIR 结构域和膜受体的TIR 结构域相互作用，向下游传递信号；MyD88 蛋白分子被激活后，依赖其N 端的“死亡结构域”与白介素-1 受体相关激酶家族成员IRAK-1、IRAK-4 形成复合物；活化的IRAK-1 与TRAF-6 进一步磷酸化，接着被激活的TRAF-6 与转化生长因子激酶1（TGF-β-activated kinase 1，TAK1）结合后，使得IKK 复合物磷酸化，从而导致IκB 发生磷酸化、泛素化，使静息状态下与IκB 结合的NF-κB 解离出来，导致NF-κB 活化入核，在核转录调控中发挥其强大的调节作用，从而启动炎症基因的表达，导致TNF-α、IL-1β 等促炎因子的合成与释放，引起肺部炎症级联反应［20］。本研究中LPS 滴注引起小鼠肺组织中TLR4 蛋白活化，导致下游接头蛋白MyD88 的大量募集，IκB 蛋白发生磷酸化进而降解，使得在静息状态下的NF-κB 解离出来，其亚基p65 蛋白及其磷酸化蛋白p-p65 表达升高，表明LPS 刺激激活了ALI 小鼠中TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路；而在APS 干预后，肺组织中TLR4、MyD88、p-IκBα、p65、p-p65 蛋白表达均明显下调，并且IκBα 蛋白的降解受到抑制，表明APS 可通过抑制LPS 激活的TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路，从而减少TNF-α 和IL-1β 等促炎因子的释放，降低肺部炎症，改善急性肺损伤。然而，本研究还需要进一步的体内外试验来验证并完善APS 是通过TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路在ALI中发挥保护作用。

本研究明确APS 在LPS 诱导的ALI 小鼠中的保护作用，并且初步确定了APS 通过调控TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路，提高肺功能，减轻肺部炎症，改善肺组织损伤。