猕猴桃‘脐红’与‘徐香’越冬期转录组的比较分析

毛可欣，王海荣，安 淼，吕 巍，李 健，李国田

（1.山东省果树研究所，山东泰安 271000；2.山东农业大学生命科学学院，山东泰安 271000）

猕猴桃原产于中国，在中国分布广泛，全球54个猕猴桃属种中52 个原产中国，其中44 个为中国特有。中国商业化栽培起步较晚，20 世纪70 年代才开始相关品种普查以及改良工作［1］。当前商业化栽培主要有中华猕猴桃（Actinidia chinensis）、美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）和少量的软枣猕猴桃（Actinidiaarguta）、毛花猕猴桃（Actinidia erianthaBenth.），其余仍处于野生或半野生状态。中国已公布选育的猕猴桃品种有百余个，目前有20 多个省份种植，猕猴桃采收面积和产量均位居世界第一［2］。

温度是影响猕猴桃生长发育的主要因素，低温胁迫会抑制其生长发育，影响产量，造成巨大损失。猕猴桃在花芽和嫩叶初生时期遭受冻害会出现萎缩、褐变、脱落［3］，在早春遭受低温胁迫后会落花、无果。冬末春初时枝条、根系易发生冻害，严重时导致全株死亡［4，5］。研究表明，不同品种猕猴桃对低温耐受有较大差异，其中，抗寒力较强的品种有‘魁绿’‘秦美’‘泰山1 号’等，‘徐香’的抗寒力较弱［6］。猕猴桃的低温胁迫响应机制主要聚焦在ICE-CBECOR依赖的低温信号通路［7-9］，低温诱导CBF基因表达，其编码的蛋白激活COR表达，导致渗透物、低温保护蛋白等积累，从而使植物提高低温耐受性。此外，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativaL.）中发现MYB 转录因子也可以通过调节CBF的表达来调节植物的低温耐受性［10］。在低温胁迫下植物激素也发挥重要作用，油菜素类固醇的信号通路能调节COR的表达［11］，外源施加油菜素类固醇可以增加COR表达以提高植物的耐寒性［12］。茉莉酸信号通路中的JAZ1（Jasmonate ZIM-domain protein）和JAZ4 可以削弱CBF表达［13］，乙烯信号通路中EIN3（Ethylene Insensitive 3）和EIL1（EIN3-Like 1）可以调节CBF的表达［14］。

目前关于猕猴桃不同品种的低温耐受性尚不明确，黄永红等［6］的研究中‘徐香’抗寒能力较弱，与山东省泰安市‘徐香’抗寒能力弱结果一致，中华猕猴桃‘脐红’在泰安市抗寒性表现较好。针对不同品种猕猴桃应对外界低温的生理变化、低温响应反应以及调节的相关基因尚不明确，本研究选取抗寒性强的中华猕猴桃‘脐红’以及抗寒性弱的美味猕猴桃‘徐香’作为研究对象，在秋末（11 月）以及越冬期（12 月、1 月、2 月）取样，通过转录组测序鉴定其差异表达基因，并聚类到相关的途径，明确其对低温胁迫的响应差异。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植株为4 年生‘脐红’‘徐香’猕猴桃品种，位于山东省果树研究所泰东科研基地；东经116°20′—117°59′、北纬35°38′—36°28′，年平均降水量697 mm，温带半湿润大陆性季风气候；中性偏酸沙壤土，有机质含量1%，碱解氮含量19~43 mg/kg，磷含量21~34 mg/kg，钾含量32~68 mg/kg。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 2020 年11 月15 日至2021 年2 月15日，取直径为0.5~0.8 cm 1年生的猕猴桃树新枝作为样品（‘徐香’‘脐红’2个品种），每月1次，共取4次，每次3 个重复，用作转录组与生理指标的测定材料。

1.2.2 生理指标测定 丙二醛测定使用10%的三氯乙酸（TCA）溶液研磨，取上清液后加入0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，沸水浴反应，冷却后离心取上清液，于450、532 和600 nm 波长下测定其吸光值。可溶性糖测定使用蒽酮试剂，测定620 nm 波长下的吸光值。脯氨酸含量测定采用茚三酮法。超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用WST 方法。此外，还测定了电导率的相关数据。

1.2.3 转录组测序 参考基因组来自http：//kiwifruitgenome.org/ftp/A_chinensis/Hongyang/v3.0/，使用Hisat2［15］进行比对。使用DEGseq 进行差异表达基因分析，多重检验校正方法选择BH，筛选条件为差异倍数大于2 或者小于0.5，P-adjust 为0.001。组内差异表达分析：分别将12、1、2 月的基因组序列与11月的基因组序列对比，得到组内差异表达基因。组间差异表达分析：将2 个品种各月份的基因组序列进行比对得到差异表达基因。

分别对差异表达基因进行GO 分类统计，选取GO 通路的前20 位（P-adjust＜0.5），绘制气泡图；分别对差异表达基因进行KEGG 分类统计，选取KEGG 通路的前20 位（P-adjust＜0.5），去除无关通路，绘制气泡图。

1.2.4 差异表达基因的荧光定量PCR 使用EASYspin 植物RNA 快速提取试剂盒提取RNA，使用SUMOnetubeRTMixture 试剂盒反转录合成cDNA，qRT-PCR 使用UltraSYBR Mixture（Low ROX）试剂，使用15 μL 体系：cDNA 模板1 μL，2×SYBRGreenMix 7.5 μL，上下游引物（表1）各0.3 μL，ddH2O 5.9 μL，仪器为ABI QuantStudio 6 Flex，结果使用相对定量的2（-ΔΔCT）法处理。

2 结果与分析

2.1 冬季降温过程中猕猴桃的生理变化

在气温较低的11月至次年1月，‘脐红’与‘徐香’的电导率升高，峰值都出现在气温最低的1月（图1），说明在温度降低过程中细胞膜有所损伤；二者的丙二醛含量、可溶性糖含量升高，脯氨酸含量先下降后上升。‘脐红’与‘徐香’的超氧化物歧化酶（SOD）活性差异较大，‘脐红’的SOD 活性变化幅度较小，‘徐香’的SOD 活性明显高于‘脐红’；‘徐香’电导率、丙二醛含量、可溶性糖含量高于‘脐红’。但在12 月和1 月，‘脐红’与‘徐香’的可溶性糖含量、脯氨酸含量较接近。结果表明，在气温逐渐降低的过程中‘脐红’的低温耐受调节高于‘徐香’，且存在除SOD、可溶性糖和脯氨酸外的有效调控途径。

2.2 猕猴桃种间差异表达分析

‘脐红’12、1、2 月与11 月相比，差异表达基因数量分别为4 866、5 501 和5 740 个（图2），数目随时间推移逐渐增多；上调基因数量分别为3 457、3 450 和2 518 个，下调基因数量分别为1 409、2051 和3 222个，下调基因数量逐渐上升，在12、1 月上调基因数量基本一致，但在2 月上调基因数量减少。‘徐香’12、1、2 月与11 月相比，差异表达基因分别为5 388、4 462 和4 630 个，在12 月差异表达基因数量最多；上调基因分别为2089、2 148 和3 014 个，上调基因数量逐渐增多，下调基因数量分别为3 299、2 314 和1 616 个，数量逐渐减少。

图2 猕猴桃差异表达基因统计

品种间差异表达基因在GO 分类中包括生殖过程、多细胞生物体过程、发育过程、对刺激的反应、生物调节、代谢过程等（图3）。在‘脐红’的GO 聚类中，12 月至次年2 月，细胞成分组织或生物生成、细胞过程、细胞器部分、代谢过程、膜部分等差异表达基因数量有不同程度增加；在2 月，代谢过程和催化活性差异表达聚类增多。而‘徐香’中细胞成分组织或生物生成、细胞器部分等差异表达基因数量没有明显增加。从KEGG 通路差异表达基因分布可以看出，‘脐红’和‘徐香’的基因表达模式具有一定差异，在温度低于0 ℃的时候‘徐香’出现大量上调表达的基因，而‘脐红’在整个过程中下调基因较多。12 月至次年1 月‘脐红’膜运输、翻译、转录、复制和修复等相关的差异表达基因减少，而在‘徐香’中并没有明显减少；2 个品种在其他氨基酸的代谢、辅助因子和维生素的代谢、脂质代谢、氨基酸代谢中差异表达基因均表现为增加，在糖类的生物合成和代谢中均表现为降低。

2.3 猕猴桃在越冬期不同月份差异表达分析

在越冬期GO 注释统计中（图4），差异基因富集靠前的GO 通路包括尿酸代谢过程、跨膜运输、氧化还原酶活性、单氧酶活性、类黄酮代谢等。在气温高于0 ℃的11 月，跨膜运输、磷化作用、单羧酸代谢过程、葡萄糖基转移酶活性高度富集，随着越冬期温度的下降，富集程度降低。温度下降初期的12 月出现了铁离子结合相关通路的富集，最冷月1 月出现了转移酶活性、转移糖基团和单糖代谢过程的富集，2月出现了运输、磷的代谢过程、含磷化合物的代谢过程、浆膜的固有成分、血红素结合相关通路的富集。在温度下降初期（12 月），尿酸代谢、UDP-葡萄糖基转移酶活性、次生代谢物的生物合成、氧化还原酶活性、葡萄糖醛酸代谢、类黄酮代谢等过程基因高度富集，其中，氧化还原反应相关的差异表达基因数量激增，11 月的差异表达基因数量为282 个，12 月为323个，但1 月降至34 个。

在越冬期KEGG 通路富集中（图5），11 月高富集的差异表达基因包含芪类、二芳基庚烷类和姜醇的生物合成、氮素代谢、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢过程等。越冬初期的12 月，出现了玉米素的生物合成、磷脂酰肌醇信号系统、苯丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、叶酸的生物合成、精氨酸的生物合成、氨基酸糖和核苷酸糖的代谢、ABC 运输工具等相关过程的富集。在气温最低的1 月，出现了酪氨酸代谢、蛋白质输出、其他糖类降解、芸苔素类化合物生物合成相关的富集。在2 月，出现了色氨酸代谢、柠檬烯和蒎烯的降解、半乳糖代谢、果糖和甘露醇的代谢相关的富集。在整个越冬期都出现了淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导、苯丙类化合物生物合成、黄酮类化合物生物合成等过程的富集。

图5 越冬期KEGG 富集

2.4 猕猴桃基因表达谱及验证分析

差异表达基因富集分析发现，淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导、苯丙类化合物的生物合成和黄酮类化合物的生物合成通路始终存在差异表达。由图6 可知，在基因表达图谱中2 个品种差异较大，‘徐香’油菜素内酯相关基因表达显著高于‘脐红’，推测其在‘徐香’抵御低温胁迫中发挥作用。其次，在酪氨酸代谢和蛋白质输出的相关基因中，‘徐香’的表达量高于‘脐红’。但是在糖类降解中，‘脐红’在低温的1 月表达显著高于‘徐香’，猜测其通过降解其他糖类累积可溶性糖以抵御低温。差异表达基因富集通路显示，‘脐红’与‘徐香’的低温基因表达模式有所区别，在植物激素信号转导中最明显，大部分基因在2 个品种中具有不同的表达模式。

图6 差异通路基因表达图谱

从差异表达基因中筛选出蛋白分泌基因（Anch273941）、蜡质合成基因（Achn098691）和植物激素相关基因（Achn253311、Achn180501、Achn054121）5 个基因，qRT-PCR 测定其表达水平，并与转录组数据进行比较。5 个候选基因的qRTPCR 与转录组测序结果一致（图7），说明转录组的数据相对准确。

图7 差异表达基因验证

3 讨论

目前对作物低温生理效应研究较多［16］，但是对植物越冬期间的低温响应与调节研究较少。本研究发现猕猴桃的耐寒与不耐寒品种的基因表达具有较大差异，主要区别为低温后的相关调节。从电导率和丙二醛含量的测定也能验证‘脐红’的低温耐受性高于‘徐香’。‘脐红’在整个降温过程中上调基因数量减少，下调基因数量增加，与‘徐香’的区别较大，尤其在气温最低的1 月，二者在2 月的差异表达基因数量均升高，原因是2 月猕猴桃开始脱休眠进入生长发育状态。‘脐红’在12 月的特异差异表达基因比1 月少，但‘徐香’在温度降低初期具有较多的差异表达基因，证实2 个品种在温度降低的过程中具有不同的基因表达模式。

在GO 分类统计中，2 个品种在生物调节、细胞过程、代谢过程、细胞器、细胞部分、催化活性相关部分差异表达基因均较高，以上途径均参与了植物应对低温胁迫的响应。在‘脐红’越冬过程中，细胞成分组织或生物生成、细胞器部分等差异表达基因数量增加，而‘徐香’与‘脐红’差异表达基因数量没有明显增加。在KEGG 的分类统计中，尤其是在12 月至次年1 月，‘脐红’的膜运输、翻译、转录、复制和修复等相关的差异表达基因减少，而在‘徐香’中并没有明显减少，说明2 个品种在低温胁迫下自身的基因表达模式不同。在KEGG 富集中，二者均出现了MAPK 信号传导途径，低温信号传导涉及蛋白激酶通路［17］。‘脐红’中有明显的角质素、亚叶酸和蜡质途径的差异表达，表明其在温度降低的过程中发挥了重要作用，在‘徐香’中最特殊的是氨基酸的生物合成与代谢，包括精氨酸的生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢。综上，‘脐红’与‘徐香’在低温胁迫下的反应与调节机制有所区别。

在越冬期不同月份对比中发现，在气温最低的1 月出现了较多的糖类合成与代谢相关基因，低温胁迫会触发淀粉降解［18］，并将葡萄糖等转运至液泡，通过在液泡中积累糖分增强植物的低温耐受性［19］。在差异表达基因中，‘徐香’的糖类降解相关基因表达量较高，可溶性糖含量也相对较高，说明在低温胁迫下通过调节糖类的降解以应对低温环境。植物可以改变自身的角质素、蜡质的成分和数量来抵御外界胁迫［20-22］，植物表面蜡质可以增强植物对干旱、盐、低温胁迫的耐受性［23］，植物角质素、蜡质合成过程复杂，部分基因在低温胁迫下被诱导高水平表达，形成抗寒屏障应对低温环境。‘脐红’中角质素、亚叶酸和蜡的生物合成相关基因表达显著高于‘徐香’，同时，脂肪酸是合成角质素、亚叶酸和蜡的重要前体物质，C16 和C18 脂肪酸含量也会增多［24］。此外，植物激素在低温响应中同样具有重要作用，‘脐红’与‘徐香’均在植物激素响应中具有较多的差异表达基因，包括色氨酸代谢、玉米素生物合成、二萜类化合物的生物合成、类胡萝卜素的生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、芸苔素的生物合成、α-亚麻酸的代谢和苯丙氨酸的代谢。分析表明，植物激素、MAPK、糖类降解和氨基酸代谢等途径在猕猴桃的低温响应中发挥重要作用，其中，部分途径如糖类代谢、角质素蜡质等途径的差异性是‘脐红’与‘徐香’在低温胁迫下耐受性不同的主要原因。

4 结论

比较转录组分析显示，越冬低温期间，‘脐红’与‘徐香’2 个品种的差异表达基因具有一定的相似性。但部分途径基因存在表达差异，以上的分析结果为研究猕猴桃的越冬转录水平变化提供了新的见解，有助于进一步研究猕猴桃的低温胁迫响应的潜在分子调节机制，为猕猴桃的低温耐受性新品种培育提供理论基础。