四川不同地区丹参的质量一致性分析

吴阮琦 谢艳 张亚琴 陈兴福 吴秀清 高宇明

【摘 要】 目的：旨在分析四川省不同地区丹参药材的质量一致性，进而探索四川省丹参产业布局。方法：采用法定方法对四川省巴中、德阳和资阳地区丹参样品的水分、浸出物、丹参酮类和丹酚酸B含量以及指纹图谱进行测定，运用分析软件对测定结果分别进行单因素方差分析、聚类分析和中药色谱指纹图谱相似度评价。结果：方差分析结果表明3个地区丹参样品不存在显著性差异，聚类分析结果显示22批次丹参样品不存在明显的产地区别，指纹图谱相似度评价结果得出3个地区丹参相似度高。结论：巴中、德阳和资阳地区的丹参质量一致性高且品质优良。

【关键词】 川产丹参；质量一致性；单因素方差分析；聚类分析；指纹图谱相似度评价

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2023）08-0027-07

Abstract：Objective  In order to study the quality consistency of Salvia miltiorrhiza from different districts and research the industrial layout of Salvia miltiorrhiza in Sichuan province， 22 batches of Salvia miltiorrhiza samples were collected from three districts （Bazhong， Deyang and Ziyang） in Sichuan province. Methods  The contents of water， extract， tanshinone， salvianolic acid B and fingerprint were determined by legal methods respectively. Then the one-way ANOVA， the cluster analysis and the similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of traditional chinese medicine （TCM） were used for statistical analysis.Results The results of one-way ANOVA show that 22 batches of Salvia miltiorrhiza samples from different districts are simliar. The result of cluster analysis show that the quality of Salvia miltiorrhiza samples from three districts has no essential differences. And the result of the similarity evaluation for chromatographic fingerprint of TCM indicates the quality of Salvia miltiorrhiza samples from Bazhong， Deyang and Ziyang districts have almost the same.Conclusion The Salvia miltiorrhiza samples from three districts in Sichuan province have high quality consistency， while Bazhong， Deyang and Ziyang are considered to be the suitable districts for Salvia miltiorrhiza cultivation.

Key words：Salvia miltiorrhiza from Sichuan Province; Quality Consistency; One-way ANOVA; Cluster Analysis; Fingerprint Similarity Evaluation

丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根和根茎［1］，药用历史悠久［2］，具有活血祛瘀、通经止痛等功效。四川省德阳市中江县是丹参公认的道地产区［3-4］。随着中江丹参种植带来的可观的经济效应，四川省多个地区亦纷纷开始引种栽培丹参，但对于四川省内不同地区栽培的丹参品种的质量分析却未见国内（外）文献报道。

本研究收集了四川省巴中市、德阳市和资阳市共22批次丹参样品，对水分、浸出物、丹参酮类和丹酚酸B含量以及液相指纹图谱测定结果分别进行单因素方差分析、聚类分析和指纹图谱相似度评价，以期从不同角度评价川内不同地区丹参的品质，为探索四川省丹参产业布局提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-20AT液相色谱仪（配SPD-20A检测器）；MS205DU电子天平（梅特勒托利多）；HY-8型摇床（苏州威尔实验用品公司）；DZKW-4型电热恒温水浴锅（北京中兴伟业世纪仪器有限公司）；TGL-16M型离心机（长沙维尔康湘鹰离心机有限公司）；KQ-700DE型超声波清洗器（昆山市超聲仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；SPSS软件24.0版（IBM公司）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版本（国家药典委员会）。

1.2 试剂 丹参酮IIA对照品（中国食品药品检定研究院110766-201721）纯度为99.5%，丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院111562-201716）纯度为96.6%，甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher公司），水为注射用水，其他为分析纯。

1.3 药材 共收集到川内不同地区的栽培丹参样品22批次，采集时间为2018年12月。经资阳市食品药品检验检测中心吴秀清主任中药师鉴定为丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）。详见表1。

2 方法

2.1 水分和浸出物 分别参照《中国药典》（2015年版）四部的通则0832项下第二法测定各样品的水分，结果不得过13%；通则2201项下冷浸法测定各样品的水溶性浸出物，结果不得少于35.0%；通则2201项下热浸法测定各样品的醇溶性浸出物，用乙醇作溶剂，结果不得少于15.0%。

2.2 丹参酮类含量测定 参照《中国药典》（2015年版）一部中丹参品种项下的方法，所得丹参酮类含量以干燥品中丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I的总量计，结果不得少于0.25%。

2.2.1 对照品溶液制备 取丹参酮IIA对照品11.56 mg置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1.15 mg/mL的对照品储备液；再精密量取储备液1.00 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得浓度为23.00 μg/mL的丹参酮IIA对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取D1号丹参样品粉末 （过三号筛）约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件 选用XselectR Hss T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-0.02%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱（0～6 min，61%乙腈；6～20 min，61%～90%乙腈；20～20.5 min，90%～61%乙腈；20.5～25 min，61%乙腈），柱温为20 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为270 nm，进样量10 μL。以丹参酮IIA对照品为参照，以其相应的峰为S峰，计算隐丹参酮和丹参酮I的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%以内，相对保留时间及校正因子见下表2。丹参酮IIA含量测定图谱如图1所示。

2.2.4 线性关系 精密量取浓度为1.15 mg/mL的丹参酮IIA对照品储备液0.25 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.00 mL分别置于100 mL、50 mL、50 mL、50 mL、25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得浓度为2.875 μg/mL、5.75μg/mL、11.50μg/mL、23.00μg/mL、46.00μg/mL的系列标准溶液，采用2.2.3项下液相色谱条件测定，以峰面积与对照品浓度进行线性回归，得相关系数r=0.9998，表明该方法有良好的线性关系。

2.2.5 精密度 精密吸取丹参酮IIA对照品溶液，采用2.2.3项下液相色谱条件重复进样 6 次，测定峰面积，计算丹参酮IIA峰面积的RSD为0.63%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性 取D1号丹参样品，按 2.2.2项下方法制备6 份供试品溶液，采用2.2.3项下液相色谱条件，分别进样测定，计算丹参酮类总含量，分别为：0.27%、0.26%、0.29%、0.28%、0.27%、0.26%，RSD为4.30%，表明该方法的重复性良好。

2.2.7 加标回收 精密称取 D1号丹参样品6 份，每份约0.3 g，分别精密加入浓度为1.15 mg/mL的丹参酮IIA对照品储备液0.20 mL，再精密加入甲醇49.8 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液（浓度约为9 μg/mL），按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，采用2.2.3项下液相色谱条件，分别进样测定，计算丹参酮IIA含量，结果见表3，平均回收率为98.2%，RSD 为 1.52%，表明该方法准确可靠。

2.2.8 稳定性 取D1号丹参样品按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，采用2.2.3项下液相色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 进样测定，计算丹参酮IIA的峰面积，得RSD为1.66%，表明样品溶液在8 h内稳定。

2.3 丹酚酸B含量测定 参照《中国药典》（2015年版）一部中丹参品种项下的规定，采用高效液相色谱法，所得丹酚酸B含量以干燥品计，结果不得少于3.0%。

2.3.1 对照品溶液制备 取丹酚酸B对照品116.2 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇∶水（8∶2）混合溶液溶解并稀释至刻度，得到浓度为11.22 mg/mL的对照品储备液；再精密量取储备液0.10 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇∶水（8∶2）混合溶液溶解并稀释至刻度，制成每1 mL含 0.1122 mg 的丹酚酸B对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液制备 取D1号丹参样品粉末 （过三号筛）约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇：水（8∶2）混合溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇∶水（8∶2）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，移至10 mL量瓶中，加甲醇∶水（8∶2）混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 色谱条件 选用 XselectR Hss T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，乙腈—0.1%磷酸溶液（22∶78）为流动相，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为286 nm，进样量10 μL。丹酚酸B含量测定图谱如图 2所示。

2.3.4 线性关系 精密量取浓度为11.22 mg/mL的丹酚酸B对照品储备液0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、0.20 mL、0.50 mL分別置于100 mL、100 mL、100 mL、10 mL、10mL 容量瓶中，加甲醇—水（8∶2）混合溶液稀释至刻度，配制成浓度为22.44 μg/mL、56.10 μg/mL、112.2 μg/mL、224.4 μg/mL、561.0 μg/mL的系列标准溶液，采用2.3.3项下液相色谱条件测定，以峰面积与对照品浓度进行线性回归，得相关系数r=0.9996，表明该方法有良好的线性关系。

2.3.5 精密度 精密吸取丹酚酸B对照品溶液，采用2.3.3项下液相色谱条件重复进样 6 次，测定峰面积积分值，计算丹酚酸B 峰面积的RSD为0.54%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性 取D1号丹参样品，按 2.3.2项下方法制备6 份供试品溶液，采用2.3.3项下液相色谱条件，分别进样测定，计算丹酚酸B含量，分别为：8.4%、8.3%、8.6%、8.2%、8.5%、8.2%，RSD为1.95%，表明该方法的重复性良好。

2.3.7 加标回收 精密称取 D1号丹参样品6 份，每份约0.15 g，分别精密加入浓度为11.22 mg/mL的丹酚酸B对照品储备液1.00 mL，再精密加入甲醇∶[KG-*3/5]水（8∶2）混合溶液49.0 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇∶[KG-*3/5]水（8∶2）混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，移至10 mL量瓶中，加甲醇∶[KG-*3/5]水（8∶2）混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液（浓度约为231 μg/mL），采用2.3.3项下液相色谱条件，分别进样测定，计算丹酚酸B含量，结果见表4。丹酚酸B平均回收率为98.5%，RSD 为 1.76%，表明该方法准确可靠。

2.3.8 稳定性 取D1号丹参样品按照2.3.2项下方法制备供试品溶液，采用2.3.3项下液相色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 进样测定，计算丹酚酸B的峰面积， 得RSD为1.86%，表明样品溶液在8 h内稳定。

2.4 指纹图谱 供试品溶液、对照品溶液制备与色谱条件参考香港中药材标准中丹参项下高效液相指纹图谱鉴别方法［5］，选用XselectR Hss T3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-（水∶乙腈∶甲酸=90∶1∶0.4）为流动相，梯度洗脱（0～40 min，0%～30%；40～50 min，30%～80%；50～70 min，80%～85%），流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为30 ℃，进样量10 μL。

3 结果

3.1 单因素方差分析 22批次丹参样品水分、浸出物、丹参酮类和丹酚酸B的含量测定结果见表5。从表5可得，22批次样品中除Z1、Z2和B6的醇溶性浸出物含量略低于2015年版中国药典的要求（不得少于15.0%）外，其余样品均符合相应的标准要求。

采用SPSS 24.0软件对分别巴中、德阳和资阳3个地区丹参样品的水分、浸出物、丹参酮类和丹酚酸B含量进行单因素方差分析［6-8］，结果见表6。通过比较平均值可看出，巴中地区丹参样品的水溶性浸出物含量高于资阳和德阳；德阳地区丹参样品的丹参酮类含量低于巴中和资阳；资阳地区的水分含量高于巴中和德阳，但醇溶性浸出物含量低于巴中和德阳。方差齐性检验结果显示3个地区样品的水分、浸出物、丹参酮类和丹酚酸B的P1值均大于0.05，表明3个地区样品方差齐性适合进行单因素方差分析；当显著性水平为0.05时，进行单因素方差分析计算得到的P2值均大于0.05，即巴中、德阳和资阳3个地区丹参样品的水分、浸出物、丹参酮类和丹酚酸B含量均不存在统计学上的显著性差异。

3.2 聚类分析 對于3个地区丹参样品的整体质量差异分析，本研究采用SPSS 24.0软件对22批次丹参样品进行系统聚类分析［8-10］。参与系统聚类分析的变量为水分含量、浸出物含量、丹参酮类含量和丹酚酸B含量，聚类方法的样品间距离的计算采用欧式距离法。聚类结果如图3所示。当阈值为10时，22批次丹参样品聚为2类，阈值小表明样品性相似高。Z2、D5、B3、D7单聚为一类，其余18个样品聚为一类，是因为这4个样品的水溶性浸出物含量均低于50%，较其他样品低。系统聚类的结果不呈现地区性，每个类别中均有3个产地的样品存在，表明3个产地的丹参可能具有同源性。

3.3 指纹图谱相似度评价［10-11］

3.3.1 对照指纹图谱R的生成 将22张丹参样品的HPLC谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本），以D1为参照图谱，采用“中位数”法，设置时间窗宽度为0.1，通过多点校正法对色谱峰进行全谱峰匹配，从而得到对照指纹图谱R。如图4所示，共得到15个共有峰。

3.3.2 不同地区指纹图谱比较 将生成的对照指纹图谱R分别与巴中、资阳和德阳地区丹参样品的HPLC谱图进行相似度比较。22个丹参样品的HPLC谱图中均匹配到了15个共有峰，相似度评价结果见表7。从表7中可以看出，来自巴中、资阳和德阳的22个丹参样品的指纹图谱与对照指纹图谱R的相似度均在0.997以上，表明巴中、资阳和德阳3个地区丹参的质量相似度高，不存在明显差别。

4 讨论

随着中药在国际市场的广泛应用，对中药的质量可控性要求日益增高。然而中药源植物存在天然变异性，同种植物常常由于环境的不同可能导致遗传基因的变化而产生质量差异［12］，因此对不同产地的丹参药材进行质量一致性分析是十分必要的。

高瑜等［13］和邱晓萍等［14］分别通过物种分布模型和最大熵模型分析得出我国中部、东部的大部份地区都是丹参的环境适宜区，气候类变量对丹参分布的影响较大，而土壤类和地形类变量的影响较小。

巴中市位于东经 106°21′～107°45′和北纬 31°15′～ 32°45′之间，海拔159～2503 m，年平均气温16.2～17.1 ℃，年平均降雨量约为 1200 mm；德阳市中江县位于东经104°41′～105°15′和北纬30°55′～31°29′之间，海拔306～1046 m，年平均气温约16.7 ℃，年平均降水量约882.5 mm；资阳市位于东经104°21′～105°27′和北纬29°15′～30°17′之间，海拔300～550 m，年平均气温约17.0 ℃，年平均降水量约1100.0 mm。

巴中、德阳和资阳虽各位于四川盆地东北部、西北部和东部，但均属于亚热带湿润季风气候，年平均气温和降水量等气候变量相似。与本实验结果巴中、德阳和资阳地区的丹参质量一致性高相符。

此外，就丹参的品质而言，丹参药材的主要活性物质是脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类物质，丹参酮类和丹酚酸类具有心脑血管保护、抗菌、调节血脂等作用［15］。丹参酮类物质随纬度降低而升高，与经度和海拔间的相关性不强；在温暖湿润、昼夜温差相对小的地区，丹参酮类成分的含量较高［16］。本实验收集的巴中、德阳和资阳样品中丹参酮类含量平均值分别为0.90%、0.62%和0.96%，是标准规定值的2～4倍；丹酚酸B含量平均值分别为7.9%、8.3%和7.5%，是标准规定值的2～3倍；表明巴中、德阳和资阳丹参的品质优良，此结果与文献报道的“就丹参中丹参酮类、酚酸类含量而言，四川产地的丹参综合来看质量较为上乘［17］”相一致。这亦与巴中、德阳和资阳三地处于相近的经纬度、均具有温暖湿润、四季分明的亚热带温润气候密不可分。

5 结论

本研究表明，巴中、德阳和资阳地区所产丹参质量一致性高且品质优良，故可认为此3个地区均适宜丹参栽培。

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2015：76-77.

［2］赵宝林，钱枫.丹参的本草考证［J］.中药材，2009，32（6）：991-994.

［3］梁飞.道地药材考——以20种中药为例［D］.北京：北京医药大学，2013：86-87.

［4］陈晓玉，贺超，闫滨滨，等.丹参主产区栽培技术差异性调查分析［J］.中国中药杂志，2019，44（7）：1314-1320.

［5］香港卫生署.香港中药材标准（第一册）［S］.香港：香港卫生署，2005：82-83．

［6］牛凯.数据分析之单因素方差分析［J］.产业与科技论坛，2019，18（2）：57-58.

［7］邹祎.SPSS软件单因素方差分析的应用［J］.价值工程，2016（34）：219-222.

［8］武松.SPSS實战与统计思维［M］.北京：清华大学出版社，2019：309-312.

［9］赵姗姗.基于SPSS中系统聚类的CPI分析［D］.新乡：河南师范大学，2013：27-36.

［10］刘江，陈兴福，杨文钰，等.川麦冬野生种质资源色谱特征图谱的建立及其系统聚类分析［J］.中国中药杂志，2010，35（20）：2726-2730.

［11］邹纯才，鄢海燕.我国中药色谱指纹图谱相似度评价方法30年（1988～2017年）研究进展与展望［J］.中国中药杂志，2018，43（10）：1969-1977.

［12］何毅，肖传学，朱永宏，等.从源头探讨中药国际化之路［J］.中草药，2012，43（4）：630-635.

［13］高瑜，李佳颖，刘宇哲，等.基于组合模型的丹参潜在地理分布研究［J］.植物科学学报，2021，39（6）：571-579.

［14］邱晓萍，张懿，张咏梅.全球气候变化对丹参潜在适宜区分布影响［J］.中国中医药信息杂志，2022，29（9）：1-10.

［15］王维婷，单成钢，倪大鹏，等.丹参有效成分代谢生理生化及分子生物学研究进展［J］.中药材，2009，32（9）：1472-1476.

［16］张辰露，梁宗锁，郭宏波，等.不同气候区丹参生物量、有效成分变化与气象因子的相关性研究［J］.中国中药杂志，2015，40（4）：607-613.

［17］王娟，邵远洋，晋小雁，等.不同产地丹参ITS序列及有效成分差异分析［J］.中国实验方剂学杂志2017，23（11）：40-44.

（收稿日期：2022-08-05 编辑：陶希睿）