EMS诱变创制水稻抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂种质

江群　凌溪铁　唐兆成　周珍珍　张保龙

摘要： 创制非转基因抗除草剂水稻种质资源对于稻田杂草防控具有重要价值。本研究以甲基磺酸乙酯（EMS）水溶液诱变镇糯19水稻种子，获得1株能稳定遗传的可耐受乙酰辅酶A羧化酶（ACCase）抑制剂类除草剂高效盖草能的M₃代水稻幼苗（突变体）。分别扩增镇糯19野生型和突变体的基因组DNA并进行测序和序列比对，发现突变体ACCase基因的开放阅读框（ORF）的第5 374位碱基发生了点突变，导致编码的第1 792位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸。镇糯19野生型和突变体分蘖盛期大田喷施3种田间推荐剂量的ACCase抑制剂类除草剂后农艺性状调查结果表明突变体对高效盖草能、精喹禾灵和唑啉草酯抗性明显高于野生型。本研究获得了能稳定遗传的非转基因抗ACCase抑制剂类水稻新种质，具有一定的应用价值，为抗除草剂水稻育种提供了种质资源。

关键词： 水稻；抗除草剂种质；甲基磺酸乙酯（EMS）；乙酰辅酶A羧化酶

中图分类号： S335.3 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2023）02-0305-08

EMS mutagenesis to create rice anti-acetyl-CoA carboxylase inhibitor-herbicide germplasm

JIANG Qun¹， LING Xi-tie²， TANG Zhao-cheng²， ZHOU Zhen-zhen²， ZHANG Bao-long^1，2

（1.College of Tropical Crops/Sanya Nanfan Research Institute， Hainan University， Haikou 570228， China;2.Institute of Germplasm Resources and Biotechnology/Provincial Key Laboratory of Agrobiology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract： Cultivating non-transgenic herbicide-resistant rice germplasm resources is of great value for weed control in rice fields. In this study， Zhennuo 19 rice seeds were mutagenized by ethyl methyl sulfonate （EMS） solution， and a M₃generation of rice seedlings with stable inheritance and tolerance to acetyl-CoA carboxylase （ACCase） inhibitor herbicides were obtained. The genomic DNAs of wild-type and the mutant were amplified and sequenced respectively. It was found that there was a point mutation at the 5 374^thbase of the open reading frame of the resistant rice ACCase gene， resulting in a mutation of the encoded 1 792^thamino acid from isoleucine to leucine. Three kinds of ACCase inhibitor herbicides were sprayed in the field and the agronomic traits were analyzed. The results showed that the resistance of the mutant to haloxyfop-R-methyl， quizalofop-P-ethyl and pinoxaden was significantly higher than that of wild type. In this study， a new non-transgenic rice germplasm with ACCase inhibitor resistance was obtained， which had certain application value and could provide germplasm resources for herbicide-resistant rice breeding.

Key words： rice;herbicide-resistant germplasm;ethyl methyl sulfonate （EMS）;acetyl CoA carboxylase

水稻是中國三大粮食作物之一，培育高产稳产的优质水稻是解决粮食问题的关键。稻田杂草严重影响水稻的产量和品质，杂草导致中国稻谷每年亏损率超过15%，部分地区甚至超过50%^[1]。化学除草是当今世界使用最多的稻田除草方法。然而，过度使用除草剂不仅会导致杂草对除草剂产生抗性，还会对作物产生药害、降低水稻产量和品质，严重时甚至造成水稻颗粒无收^[2]。因此，培育抗除草剂的水稻品种可以经济有效地解决稻田的杂草防除问题。

乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）是植物初级代谢中脂肪酸合成的关键酶之一，其主要功能是将乙酰辅酶A羧化为丙二酰辅酶A。该反应是脂肪酸合成的第一步，也是限速的关键步骤^[3]。脂肪酸不仅是功能物质甘油三脂的组成成分，还能转化为作为细胞膜组成成分的磷脂^[4]。自1958年发现乙酰辅酶A羧化酶可作为除草剂的作用靶标后，针对该靶标已开发了三大类除草剂并商品化应用，分别是芳氧苯氧基丙酸酯类（APP）^[5]、环己烯酮类（CHD）^[6]和新苯基吡唑啉类（DEN）^[7-8]。其中，APP类除草剂包括高效氟吡甲禾灵（Haloxyfop-R-methyl，又称高效盖草能）、精喹禾灵（Quizalofop-P-ethyl）、精恶唑禾草灵（Fenoxaprop-P-ethyl，又称骠马）、恶唑酰草胺（Metamifop）和氰氟草酯（Cyhalofop-butyl）等。CHD类除草剂包括烯禾啶（Sethoxydim）、噻草酮（Cycloxydim）和环苯草酮（Profoxydim）等；DEN类除草剂有唑啉草酯（Pinoxaden）。乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂主要被用于控制禾本科杂草，具有高效、低毒、对后茬作物安全等特点^[9]。目前，水稻生产中登记并许可使用的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂仅有氰氟草酯、恶唑酰草胺和环苯草酮，这极大限制了水稻生产中杂草的防治。因此培育抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂水稻，不仅可以拓宽稻田除草剂的选择和使用范围，还可有效控制稻田杂草的发生与危害。

化学诱变是培育和筛选抗性除草剂作物种质资源的重要方法。EMS是非常有效且负面影响小的化学诱变剂，被广泛应用于构建优良性状的水稻突变体^[10-12]。顾佳清等利用EMS处理粳稻品种中花11，从诱变的水稻群体中筛选出高产的突变体，经过后代的纯化，得到了一个可以直接推广应用的水稻突变新品系申化一号^[13]。陈忠明等通过EMS处理籼稻9311，筛选出了大粒的突变体M316和长穗突变体9311eR^[14-15]。本课题组用EMS诱变处理包括9311在内的多个水稻品种，成功筛选到多个抗咪唑啉酮类除草剂的突变体，进一步鉴定结果表明突变均发生在编码乙酰乳酸合成酶（ALS）靶标基因上^[16]。

本研究通过EMS诱变糯稻品种镇糯19构建突变群体，用APP类除草剂高效盖草能去筛选诱变处理后的M₂代幼苗，获得能稳定遗传的抗性植株，并对抗性植株的ACCase基因位点突变、氨基酸序列变异进行鉴定，最后就3种不同ACCase抑制剂类除草剂对获得的抗除草剂材料农艺性状影响进行分析，旨在为水稻抗除草剂育种提供依据和材料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试水稻材料镇糯19由江苏丘陵地区镇江农业科学研究所提供。试验所用除草剂的种类及相关信息见表1。

生物试剂甲基磺酸乙酯（EMS）购自美国Sigma-Aldrich公司，2×Rapid Taq Master Mix、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司，CTAB购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 镇糯19水稻种子的EMS诱变及抗ACCase抑制剂类除草剂突变体的筛选

镇糯19种子（M₁代）清水浸泡2 h后，用质量浓度5.0 mg/ml的EMS水溶液浸种处理14 h，硫代硫酸钠中和30 min后，将种子捞出并用清水冲洗5～6遍。将诱变处理后的种子播种于大田，M₁代植株成熟后，种子混收（M₂代）作为突变群体库。从突变群体库中取M₂代种子播种于大棚苗床，待水稻幼苗长至3～4叶期时喷施64.8 g/hm²，a.i.高效盖草能，施药后21 d观察记录水稻表型并将正常生长的水稻苗移栽至盆钵内，单株收获种子得到突变体种子（M₃代），M₃代种子播种后得到M₃代幼苗。

1.3 抗除草剂突变体 ACCase基因的PCR鉴定和碱基序列分析

从国家水稻数据中心数据库（https：//www.ricedata.cn/）获得水稻ACCase基因（OsACC， 序列号为LOC_Os05g22940）的碱基序列。根据OsACC基因的保守序列使用SnapGene 6.0.2软件进行特异性引物设计，共设计了8对引物，分别是OsACC-F1～OsACC-F8和OsACC-R1～OsACC-R8 （表2）。

采用CTAB法^[14]提取水稻的基因组DNA，取M₃代三叶一心期的叶片0.5 g放在带有1颗小钢珠的2 ml离心管中，放到液氮中冷冻至叶片组织变脆，再将离心管放到频率为60 Hz的组织研磨机研磨2 min，然后加入400 μl CTAB提取液，离心管65 ℃水浴30 min后，在通风橱中加入400 μl氯仿，充分混匀至提取液呈乳绿色，12 000 r/min离心10 min，在离心期间标记好管号，将600 μl无水乙醇加入到已经标记好的1.5 ml离心管中，移液枪吸取上清液300 μl加到已经准备好的离心管中，上下颠倒混匀再沉淀1 h以上，12 000 r/min离心10 min，倒掉上清液，开盖，室温下风干12 h 至离心管底部有明显的白色DNA沉淀，风干后加入灭菌蒸馏水200 μl，于-20 ℃保存。

以M₃代的基因组DNA为模板，采用2×Rapid Taq Master Mix或 Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase聚合酶扩增OsACC基因的8个片段。用1% 琼脂糖凝胶进行电泳检测。将条带大小正确的PCR产物送南京擎科生物科技有限公司进行测序；使用SnapGene 6.0.2软件分析测序结果，明确野生型和突变体的OsACC基因碱基序列差异性。

1.4 喷施除草剂后水稻农艺性状调查

2022年在江苏省农业科学院试验基地进行镇糯19野生型和突变株系对3种乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂耐受性试验。5月中旬播种，6月中旬插秧。试验设分别喷施高效盖草能、精喹禾灵、唑啉草酯及清水对照4个处理，每处理2.5 m×4.0 m。移栽行距为0.25 m，株距为0.15 m。按照常规大田生产进行浇水和施肥等田间管理。

镇糯19野生型和突变体幼苗移栽大田27 d后，进行高效盖草能、精喹禾灵、唑啉草酯及清水（CK）的喷施处理。除草剂的用量见表1。各处理选择连续的20株，在水稻喷施除草剂前以及喷施除草剂后30 d、90 d进行茎蘖数、株高、主茎旗叶长度等农艺性状调查  。其中，喷药后90 d，水稻已进入成熟期，统计的茎蘖数为成穗数。

1.5 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2019进行数据处理，用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 抗除草剂突变体筛选

高效盖草能是一种内吸传导型除草剂，EMS诱变的镇糯19 M₂代水稻幼苗在3～4叶期喷施高效盖草能7 d后，绝大部分水稻幼苗叶片颜色变成浅绿；喷施高效盖草能21 d后，敏感植株叶片几乎完全失去绿色、部分已经枯死；具有抗性的植株能继续正常生长。经大量筛选后，最终获得1株具有高效盖草能抗性的M₂单株（图1），成熟后收获单株种子，得到M₃代抗性突变体。

2.2 OsACC突变位点

已知高效盖草能的作用靶标是ACCase，植物对高效盖草能的抗性主要源于ACCase基因的突变^[17-19]。为了确定突变体中靶标基因是否发生突变，我们用了8对引物对野生型（镇糯19-WT）和抗性M₃单株（镇糯19-1792）的基因進行扩增，全部都获得了与预期大小相符合的条带（图2）。

上述PCR扩增的产物经测序和碱基序列比对，发现相对于野生型OsACC的ORF，突变体OsACC基因中存在一个点突变，其开放阅读框（ORF）的第5 374位碱基由A突变成T，从而引起编码的第1 792位氨基酸由异亮氨酸（Ile）突变为亮氨酸（Leu）（图3A）。OsACC蛋白的全长有2 327个氨基酸，将OsACC蛋白全长氨基酸序列在NCBI的Conserved Domain数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行保守结构域分析，发现其包含了4个结构域（Domain）：生物素羧化酶（BC）、生物素羧基载体蛋白（BCCP）、乙酰辅酶A羧化酶中心（ACC central）和羧基转移酶（CT）（图3B）。进一步的氨基酸序列分析结果表明，突变体中第1 792位氨基酸的突变位于CT结构域，该突变类型与已报道的大穗看麦娘（Alopecurus myosuroides）的抗性位点突变类型是一致的，对应于其ACCase氨基酸序列第1 781位点；突变类型也相同，均由Ile突变为Leu（图3B 和3C）^[17]。因此，突变体抗除草剂功能的获得是由OsACC氨基酸序列第1 792位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸引起的。

2.3 突变体的农艺性状

在分别喷施高效盖草能、精喹禾灵和唑啉草酯14 d后，野生型植株生长均受到了显著影响，大部分植株叶片出现枯黄症状。突变体植株在分别喷施以上3种除草剂后，叶片仍然是绿色且可以正常生长，表明突变体对这3种除草剂均具有抗性（图4）。

分蘖期分别喷施3种不同除草剂后，野生型和突变体株高、分蘖数及旗叶长度的变化如图5所示。结果显示，在喷施清水处理的情况下，野生型和突变体植株的株高在处理前（0 d，即幼苗移栽到大田27 d）基本没有差异，但在处理后30 d和90 d，突变体的株高显著低于野生型的株高（图5A）；两者在处理前、后的单株茎蘖数均无明显差异（图5E）。在分别喷施3种不同除草剂前（0 d），野生型和突变体植株的株高和单株分蘖数都没有明显差异，但是在喷施处理后，两者受除草剂的影响表现出明显差异（图5B～图5D、图5F～图5H）。其中，在喷施高效盖草能30 d和90 d后，突变体的株高均显著高于野生型（图5B），单株茎蘖数也显著多于野生型（图5F）。野生型对精喹禾灵和唑啉草酯都非常敏感，喷施田间推荐剂量后水稻植株均死亡，因此未统计喷药后的株高和分蘖数，而突变体对这两种除草剂表现出较强的抗性，所有植株存活且能正常生长，株高随时间逐渐增加（图5C和5D）。突变体的单株茎蘖数在精喹禾灵处理后随时间呈先增后减趋势，但经唑啉草酯处理后变化不明显，未出现明显增加现象（图5G和5H）。

喷施清水处理的突变体旗叶长度显著短于野生型；高效盖草能处理后，突变体的旗叶长度显著长于野生型（图5I）。由于野生型在喷施田间推荐剂量的精喹禾灵和唑啉草酯后植株已经枯死，因此未能进行旗叶长度统计。

综合以上结果，在田间推荐剂量下，突变体对高效盖草能、精喹禾灵和唑啉草酯的抗性水平均高于野生型。

3 讨论

植物对除草剂的抗性机制包括非靶标和靶标抗性两大类。其中，非靶标抗性是由靶标基因以外的突变引起的，使植物对除草剂的吸收或转运率降低、螯合或代谢作用增强；靶标抗性是由除草剂的靶标基因发生突变引起的^[20]。现在已发现的大部分植物抗ACCase抑制剂类除草剂的抗性机制是由于ACCase基因碱基突变引起氨基酸位点发生变异，这也是导致杂草抗药性产生的主要原因^[21-22]。截止目前，雜草中已报道了十几种ACCase氨基酸置换与其抗药性相关，分别对应于大穗看麦娘ACCase的7个氨基酸位点（均位于CT结构域内）：第1 781位、第1 999位、第2 027位、第2 041位、第2 078位、第2 088位和第2 096位^[22-25]。在以上这些突变中，以第1 781位氨基酸由Leu突变成Ile最为普遍，对三大类不同的ACCase抑制剂类除草剂都表现出高抗性，却没有适合度代价（Fitness cost）^[26-28]。本研究通过筛选EMS诱变的镇糯19水稻突变体，鉴定到了1个能稳定遗传的抗除草剂突变体。对突变体进行了基因鉴定，确定其编码靶标蛋白OsACC的第1 792位氨基酸由Leu突变成Ile。该突变类型与已报道的突变类型一致，对应于大穗看麦娘ACCase第1 781位氨基酸突变。这是该突变类型使水稻获得多种ACCase抑制剂类除草剂抗性的首次报道。

EMS是最常见的化学诱变剂，在植物的诱变育种中被广泛应用^[29]。本试验通过EMS诱变镇糯19种子，筛选到了抗ACCase抑制剂类除草剂的水稻植株，突变体能耐受田间推荐剂量的高效盖草能、精喹禾灵和唑啉草酯。其中，喷施了田间推荐剂量的唑啉草酯后，镇糯19野生型植株在处理30 d后几乎全部死亡；喷施了田间推荐剂量的精喹禾灵后，野生型的植株在喷施30 d后全部死亡；而突变体在分别喷施3种除草剂后，均未出现死亡现象，基本可以正常生长。所获得的抗性突变体对高效盖草能、精喹禾灵、唑啉草酯的抗性水平均明显强于野生型。突变体和野生型的最小致死剂量或50%抑制浓度（GR₅₀）、OsACC酶活性的差异尚有待进一步明确。

大豆、棉花和玉米等转基因作物已在全球范围内进行了商品化生产，产生了巨大的社会效益和经济效益。目前为止，中国虽然有多种转基因作物已经被正式批准商品化生产，但进行大面积种植的仅有番木瓜和棉花。2009年，农业部颁发了中国拥有自主知识产权的转Bt基因抗虫水稻生产应用安全证书，但目前中国尚未批准转基因水稻的商业化生产。因此，培育非转基因的抗除草剂水稻品种具有重要价值。上世纪90年代晚期，美国路易斯安那州州立大学稻米研究中心通过EMS诱变技术育成了一系列耐咪唑啉酮类除草剂（ALS抑制剂类除草剂）的非转基因水稻品种。2002年，巴斯夫公司开发了非转基因抗咪唑啉酮类除草剂的水稻品种Clearfield在美国进行了商业化推广，解决了水稻种植的杂草稻危害问题^[30]。2018年，巴斯夫又在美国上市了非转基因水稻品种Provisia，可以抗精喹禾灵，拟与抗咪唑啉酮类除草剂水稻品种Clearfield进行轮作并交替使用两种不同作用机理的除草剂，实现对杂草稻和其他一年生杂草的可持续性防控^[31]。本研究通过EMS诱变筛选到的抗ACCase抑制剂类除草剂突变体，具有与抗除草剂精喹禾灵水稻品种Provisia类似的抗除草剂性状，可为中国非转基因抗除草剂水稻育种提供重要材料。

4 结论

本研究通过EMS诱变筛选获得了可稳定遗传的抗ACCase抑制剂类除草剂的水稻突变体材料，可耐受3种不同田间推荐剂量的除草剂，具有一定的生产应用价值。野生型在喷施田间推荐剂量的高效盖草能、精喹禾灵、唑啉草酯后，株高和分蘖均受到严重抑制甚至死亡，但突变体基本能正常生长。突变体中OsACC突变基因编码蛋白质的第1 792位氨基酸由Ile变成Leu，使其对ACCase抑制剂类除草剂的耐受性显著提高。在当前中国转基因水稻尚未放开、公众对转基因作物品种存在疑虑的大背景下，本研究获得的非转基因抗除草剂材料具有良好的应用前景。

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（責任编辑：石春林）