基于证效相关研究清利湿热方中医功效及降血尿酸作用机制

刘金莲　吕美豫　梁唯灿　邸松蕊　南海鹏　王林元　张建军　赵晋燕　曹春然　王淳

摘要 目的：建立濕热内蕴证候大鼠模型，研究具有降血尿酸作用的清利湿热方的中医功效，以证测效揭示清利湿热降血尿酸作用机制。方法：将48只SD大鼠随机分为空白组、模型组、四妙丸组以及清利湿热方低、中、高剂量组，每组8只。采用饲喂高脂高糖饲料，自由饮用蜂蜜水，并隔天灌胃猪油脂或酒，建立湿热内蕴证候大鼠模型，观察清利湿热方对大鼠一般状态的影响。采用酶联免疫吸附试验检测血清热激蛋白70（HSP70）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β），促胃液素（GAS）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）含量以及血浆胃动素（MTL）、肝脏组织Na+-K+-ATP酶含量，免疫组织化学法检测胃肠组织水孔蛋白3（AQP3）、水孔蛋白4（AQP4）含量，采用蛋白质印迹法检测结肠组织中TOLL样受体4（TLR4）、核因子κBp65表达量。结果：模型组体质量下降（P<0.05，P<0.01），HSP70、TNF-α、IL-1β升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001），胃肠组织中AQP3表达量下降（P<0.05），AQP4表达量上升（P<0.01，P<0.001），GAS含量下降（P<0.01），IgM含量升高（P<0.01），结肠组织TLR4表达量增加（P<0.01）。清利湿热方能增加大鼠体质量，降低HSP70、TNF-α、IL-1β含量（P<0.05，P<0.01，P<0.001），升高胃肠组织AQP3表达量（P<0.05，P<0.01，P<0.001），降低AQP4表达量（P<0.05），升高GAS、Na+-K+-ATP酶含量（P<0.05，P<0.001），降低IgM含量（P<0.05，P<0.01）。结论：饲喂高脂高糖饲料，自由饮用蜂蜜水，并隔天灌胃油脂/酒，可以成功建立高尿酸血症湿热内蕴证候模型，清利湿热方可以从大鼠一般状态、体质量、热激蛋白以及炎症介质、水孔蛋白、胃肠激素、免疫等多方面改善大鼠湿热状态，发挥清利湿热功效。清利湿热方具有降血尿酸作用，其作用机制可能与下调TLR4，核因子κBp65有关。

关键词 清利湿热方；湿热内蕴；证候模型；高尿酸血症

Traditional Chinese Medicine Efficacy of Qingli Shire Prescription and Its Mechanism of Lowering Blood Uric Acid Based on Syndrome-efficacy Study

LIU Jinlian1，LYU Meiyu1，LIANG Weican1，DI Songrui1，NAN Haipeng1，WANG Linyuan1，ZHANG Jianjun1，ZHAO Jinyan2，CAO Chunran2，WANG Chun1

（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Key Laboratory for Safety Research and Evaluation of Innovative Drugs of National Medical Products Administration，Beijing Institute for Drug Control，Beijing 102206，China）

Abstract Objective：To study the traditional Chinese medicine（TCM） efficacy of Qingli Shire Prescription（QLSR） by establishing a rat model of internal retention of dampness-heat，to reveal its mechanism of lowing blood uric acid based on testing efficacy by syndrome.Methods：A total of 48 SD rats were randomized into blank group，model group，Simiao Pills group and QLSR low-，medium-and high-dose groups，with 8 in each group.A rat model of internal retention of dampness-heat was established by high-fat and high-sugar diet+free honey water+lard/alcohol every other day（ig）.The general state of rats was observed.The serum heat shock protein 70（HSP70），tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β），gastrin（GAS），immunoglobulin G（IgG），immunoglobulin M（IgM），plasma motilin（MTL） and Na+-K+-ATP in liver tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.The contents of aquaporin 3（AQP3） and aquaporin 4（AQP4） in gastrointestinal tissues were determined by immunohistochemistry.Western blot was used to detect the expressions of Toll-like receptor 4（TLR4） and nuclear factor-kappa B（NF-κB） p65 in colon tissues.Results：In the model group，body weight loss was observed（P<0.05，P<0.01）; the levels of HSP70，TNF-α and IL-1β were increased（P<0.05，P<0.01，P<0.001）; the expression of AQP3 was down-regulated（P<0.05），while the expression of AQP4 was up-regulated（P<0.01，P<0.001）; the content of GAS was lowered（P<0.01），while the content of IgM was elevated（P<0.01）; an increase was found in the expression of TLR4（P<0.01）.QLSR increased the body weight of rats，down-regulated the levels of HSP70，TNF-α and IL-1β（P<0.05，P<0.01，P<0.001），the expression of AQP4（P<0.05） and the content of IgM（P<0.05，P<0.01） and up-regulated the expression of AQP3（P<0.05，P<0.01，P<0.001） and the contents of GAS and Na+-K+-ATP（P<0.05，P<0.001）.Conclusion：The syndrome model suitable for evaluating the internal retention of dampness-heat of hyperuricemia can be successfully established by high-fat and high-sugar diet+free honey water+lard/alcohol every other day（ig）.QLSR improves the dampness-heat state of rats from the general state，body weight，heat shock protein，inflammatory factors，aquaporins，gastrointestinal hormones，immunity and other aspects，and exerts the effect of clearing dampness-heat.The prescription lowers blood uric acid，and its mechanism may be related to the down-regulation of TLR4 and NF-κB p65.

Keywords Qingli Shire Prescription; Internal retention of dampness-heat; Syndrome model; Hyperuricemia

中图分类号：R259文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.007

高尿酸血症发病率逐年增高且呈低龄化趋势［1］，是痛风的病理生理基础。中医认为高尿酸血症是由于长期嗜食肥甘厚味导致脾胃运化失司，进而生湿成痰，郁久化热，流注于经脉形成高尿酸血症。依据中医辨证可涉及多种证型，其中湿热内蕴型占比最大［2］。中药治疗高尿酸血症多以健脾化痰、清热利湿为主要原则［3］。

前期动物实验表明清利湿热方具有降血尿酸作用［4］。本研究通过建立湿热内蕴证候模型，以具有清利湿热降血尿酸作用的四妙丸为阳性对照药，基于中医证候探讨清利湿热方降血尿酸清利湿热功效机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 48只6周龄健康雄性SD大鼠，体质量（180±20）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（北京）2019-0010。饲养于北京中医药大学无特定病原体（Specific Pathogen-Free，SPF）级动物房。实验期间大鼠自由饮水，动物房室温为20～22 ℃，相对湿度60%～70%，12 h灯照、黑暗模拟昼夜交替。实验符合相关伦理要求（伦理审批号：BUCM-4-2020100907-4030）。

1.1.2 藥物 清利湿热方由土茯苓、车前子、茯苓、菊苣、葛根、川牛膝组成，质量比为3∶2∶3∶3∶2∶2，土茯苓（安国市一方药业有限公司，批号：Y20121015），车前子（安国市一方药业有限公司，批号：21011404），茯苓（安国市一方药业有限公司，批号：20112013），菊苣（江山市万里中药材有限公司，批号：WLJJ191201），葛根（安国市一方药业有限公司，批号：Y20121011），川牛膝（安国市一方药业有限公司，批号：Y20120102）；四妙丸（吉林紫鑫药业股份有限公司，批号：批号：210107）；蜂蜜（上海冠生园蜂制品有限公司，许可证号：SC12731012000317）；红星二锅头酒（北京红星股份有限公司，许可证号：QS110015010349）；猪油脂（斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（北京）2019-0010）。

1.1.3 试剂与仪器 热激蛋白70（Heat Shock Protein，HSP70）试剂盒（北京康佳宏原生物科技有限公司，批号：20210305），肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）试剂盒（北京康佳宏原生物科技有限公司，批号：20210305），白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）试剂盒（北京康佳宏原生物科技有限公司，批号：20210305），促胃液素（Gastrin，GAS）试剂盒（中尚博奥生物科技有限公司，批号：20210309），胃动素（Motilin，MTL）试剂盒（北京康佳宏原生物科技有限公司，批号：20210301），Na+-K+-ATP酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20210121）；免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）试剂盒（批号：20210301）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）试剂盒（批号：20210301），均购自安徽巧依生物技术研究所；台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TGL-16c）；全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技，型号：Chemray 240）；酶标分析仪（无锡华卫德朗仪器有限公司，型号：DR-200BS）；电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，型号：PL-203］。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将48只SD大鼠适应性喂养1周后随机分为6组，空白组、模型组、四妙丸组、清利湿热方低、中、高剂量组，每组8只。造模方法：空白组普通饲料喂养，自由饮用蒸馏水。其余组均以高脂高糖饲料喂养，给予100 g/Ｌ蜂蜜水自由饮用，分别以油脂（5 g/kg）和52%红星二锅头（5 mL/kg）交替联合灌胃，连续30 d［5］。

1.2.2 给药方法 将6味药物加水微沸提取，第1次加12倍量的水，提取时间1.5 h，第2次加10倍量的水，提取时间为1 h；将2次提取的溶液合并，通过浓缩、干燥、粉碎、过筛，得到干膏粉，将干膏粉再溶于水，配置成相应浓度的低、中、高剂量灌胃液。空白组、模型组、四妙丸组（1.2 g/kg，相当于人用量12 g/d），以及清利湿热方低、中、高剂量组，以生药量换算分别为1.25 g/kg、2.5 g/kg、5 g/kg（分别相当于成人每日临床用量的5倍、10倍、20倍）；四妙丸组下午（15：00）灌胃给予四妙丸，清利湿热方低、中、高剂量组下午（15：00）灌胃给予稀释至同体积的不同剂量的受试样品，灌胃剂量为1 mL/100 g，根据体质量变化调整灌胃量，连续给药30 d。取材前1 d禁食不禁水，戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血，静置2～3 h，以3 500 r/min，离心半径20 cm，离心15 min后，取血清和血浆，-80 ℃冰箱保存待测。取大鼠结肠组织（回盲部下1 cm处）、胃组织胃窦部以及肝脏组织，用生理盐水冲洗干净，迅速放入液氮罐中，并转入-80 ℃冰箱保存待测。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 一般观察 记录各组小鼠饮食、毛发、精神活动状态以及体质量的变化。

1.2.3.2 热激蛋白70以及相关炎症介质 取血清，采用酶联免疫吸附试验按试剂盒说明书检测HSP70、TNF-α、IL-1β含量。

1.2.3.3 水孔蛋白和胃肠激素 免疫组织化学法检测大鼠胃组织AQP3、AQP4，肠组织AQP3、AQP4含量。取血清，采用酶联免疫吸附试验按试剂盒说明书检测GAS含量。取血浆，采用酶联免疫吸附试验按试剂盒说明书检测MTL含量。

1.2.3.4 免疫因子以及Na+-K+-ATP酶 取血清，采用酶联免疫吸附试验按试剂盒说明书检测IgG、IgM含量。将肝脏组织解冻后，以3 500 r/min，离心半径20 cm，离心15 min后，取上清液，采用酶联免疫吸附试验按照试剂盒说明书检测Na+-K+-ATP酶含量。

1.2.3.5 检测结肠组织中Toll样受体（Toll-like Receptor，TLR）4、核因子κBp65表达量 采用蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）测定结肠组织中TLR4，核因子κBp65表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，若符合正态分布，则使用单因素方差分析，各组间比较方差齐性采用最小显著性差异法（LSD）进行分析；若各组间方差不齐则采用Dunnett′s T3进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 适应性喂养期间，大鼠的饮食、二便以及精神状况都良好。造模后，随着油脂、蜂蜜以及乙醇摄入的增加，模型组大鼠出现大便稀溏，肛周污秽，阴囊脱垂，毛发干枯发黄，倦怠无力、精神状态差等症状。与模型组比较，给药组大鼠大便正常，精神状态佳。与空白组比较，模型组体质量第7天、第14天、第21、第28天降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，清利湿热方低、中、高剂量组差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 清利湿热方对湿热内蕴证大鼠血清HSP70、TNF-α、IL-1β含量的影响 与空白组比较，模型组HSP70含量升高（P<0.01）、TNF-α含量升高（P<0.001）、IL-1β含量升高（P<0.05）。与模型组比较，清利湿热方中、高剂量组HSP70含量下降（P<0.01，P<0.001）。清利湿热方高剂量组TNF-α含量下降（P<0.05）。清利湿热方低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-1β下降（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。见表2。

2.3 清利湿热方对湿热内蕴证大鼠胃肠组织AQP3平均光密度值的影响 与空白组比较，模型组大鼠胃肠组织中AQP3表达量下降（P<0.05）；与模型组比较，四妙丸组、清利湿热方低、中、高剂量组大鼠胃、肠组织AQP3表达量上升（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。见表3。见图1～2。

2.4 清利湿热方对湿热内蕴证大鼠胃肠组织AQP4平均光密度值的影响与空白组比较 湿热模型组大鼠胃肠AQP4表达量上升（P<0.01，P<0.001）；与模型组比较，四妙丸组、清利湿热方低、中、高剂量组大鼠胃肠AQP4表达量下降（P<0.05）。见表4。见图3～4。

2.5 清利湿热方对湿热内蕴证大鼠血清GAS、血漿MTL、肝脏Na+-K+-ATP酶含量的影响 与空白组比较，模型组GAS降低（P<0.001），MTL、Na+-K+-ATP酶有降低的趋势，但差异无统计学意义。与模型组比较，清利湿热方中、高剂量组GAS含量提高（P<0.001）。与模型组比较，四妙丸组、清利湿热方低、中、高剂量组大鼠MTL差异无统计学意义。清利湿热方高剂量组Na+-K+-ATP酶含量上升（P<0.05）。见表5。

2.6 清利湿热方对湿热内蕴证大鼠IgG、IgM含量的影响 与空白组比较，模型组IgG有升高趋势，差异无统计学意义。IgM含量上升（P<0.01）。与模型组比较，四妙丸组、清利湿热方低、中、高剂量组大鼠IgG含量差异无统计学意义。清利湿热方中、高剂量组IgM含量下降（P<0.05，P<0.01）。见表6。

2.7 清利湿热方对湿热内蕴证大鼠结肠组织TLR4、核因子κBp65表达量的影响 与空白组比较，模型组结肠组织中TLR4表达量升高（P<0.01），核因子κBp65表达量升高，但是差异无统计学意义。与模型组比较，清利湿热方中剂量组和清利湿热方高剂量组TLR4表达量下降（P<0.05，P<0.01）。见表7，图5。

3 讨论

目前湿热内蕴证候总体的建模原则为“外湿＋内湿＋疫戾邪气”［6］，即“人工气候箱＋高脂高糖饲料＋生物致病因子”，在湿热内蕴证发病机制上，从水代谢、免疫功能、胃肠激素等多角度进行研究探讨［7］。高尿酸血症的发生大多由于饮食结构发生显著改变，饮食不节或饮酒，损伤脾胃，水湿内停，日久湿热内蕴，而非外来湿邪和客邪所致［8］。因此，本实验选择以高脂高糖饮食加蜂蜜水饮用喂养实验动物，并交替灌胃油脂和酒，以达到“太阴内伤、湿饮停聚”的目的，符合临床高尿酸血症的发病机制。

清利湿热方由土茯苓、车前子、茯苓、菊苣、葛根、川牛膝组成，方中土茯苓、车前子共为君药，土茯苓甘、淡、平，解毒、除湿、通利关节［9］，《本草正义》记载土茯苓具有“利湿去热，能入络，搜剔湿热之蕴毒”功效［10］，数据挖掘表明，土茯苓为治疗高尿酸血症使用频率最高的药物［3］；车前子甘、寒，清热利湿［9］，土茯苓、车前子是治疗高尿酸血症常用药对。茯苓健脾利湿，合以菊苣健胃消食，二者相合，助君药健脾利湿除痹，共为臣药。佐药葛根升发清阳，助茯苓、菊苣运化。川牛膝补益肝肾，利尿通淋，与茯苓配伍，既可助君祛湿除痹又可补肾健脾，是为使药，诸药同用，共奏清利湿热、运脾泄浊之功［11］。

热激反应是最常见的细胞应激反应之一，其作用机制与中医学“热证”的发病机制相似［12］。HSP在遭受到热以及其他刺激时，其表达量明显增加。HSP70是研究的最为深入的蛋白之一，诸多实验证实，HSP70可作为湿热证辨证论治“热”的量化指标［13-14］。清利湿热方可以通过降低HSP70水平发挥“清热”功效。水孔蛋白的正常表达是运化水湿、津液输布的分子生物学基础，水孔蛋白表达失常可能是湿邪形成的重要原因。有研究证实AQP3低表达可能引起结肠黏膜对水的吸收减少而导致腹泻或便溏［15］，与湿热病理状态下会出现便溏这一症状符合。AQP4广泛分布于脑、眼、骨骼肌等，主要影响胃肠道的水代谢以及营养物质的消化和吸收。AQP4的升高，说明体内水湿停聚，水代谢发生紊乱［16］。实验结果表明，清利湿热方能提高AQP3蛋白表达量，下调AQP4蛋白表达量，缓解湿热内蕴证候大鼠便溏的症状，发挥利湿功效。GAS和MTL是2种调节胃肠主要的激素。有研究证实，GAS和MTL与脾虚密切相关［17］。GAS可以促进胃酸分泌，对胃黏膜细胞有营养作用，可以促进胃肠运动［18］。脾虚湿盛患者促胃液素含量减少，并伴有消化功能低下［19］。MTL是一种多肽，能够促进胃强力收缩和小肠分节运动，当血浆MTL含量升高，肠蠕动加速，会出现腹痛腹泻症状。湿邪致病一般起病缓慢，病程较长，临床上高脂血症、糖尿病等都可表现为中医湿滞脾胃证，这些病的共同点是都有胃肠动力减弱。清利湿热方能提高血清GAS含量，其作用途径可能是刺激胃肠黏膜G细胞分泌，这说明清利湿热方健脾利湿的作用之一体现在增加GAS分泌，以恢复胃肠功能，达到利湿功效。

Na+-K+-ATP酶是一种膜结合蛋白质，当Na+-K+-ATP酶活性下降时，会造成组织细胞内Na+积聚，而K+减少，引起细胞、组织水肿，从而导致水电解质代谢异常，是中医“湿证”的本质之一［20］。清利湿热方可以改善上述湿邪指标，发挥利湿功效。研究表明，湿热证患者出现免疫功能异常［21］，陈江华等［22］研究发现，与正常人比较，男性湿热证患者血清中IgA、IgG、IgM以及C3水平显著上升。这与本研究结果一致，说明免疫球蛋白可作為湿热内蕴证候的参考指标之一，清利湿热方可以缓解湿热证候引起的免疫亢进，从而调节免疫功能。TLR是免疫反应中重要的组成部分［23］，能够识别病原体、介导跨膜信号转导并诱导活化免疫细胞而触发一系列的炎症反应。TLR4可通过识别外源性病原体相关分子模式或者内源性损伤相关分子模式形成二聚体，使得Toll/IL-1与MyD88相结合，然后激活体内下游炎症介质核因子κBp65，激活免疫反应和炎症反应，诱导并释放出TNF-α、IL-1β等炎症介质，从而发生炎症反应，当IL-1β被激活后，又会进一步扩大炎症反应，参与高尿酸血症微炎症反应的进展，进一步引诱高尿酸血症疾病的发生。实验结果表明，模型组TLR4/核因子κBp65以及TNF-α、IL-1β升高说明体内有炎症反应，清利湿热方可以下调结肠组织TLR4/核因子κBp65表达量，说明其清热利湿机制可能是通过下调TLR4/核因子κBp65通路实现的，从而起到降尿酸效果。

高尿酸血症患者逐年增加还会导致各种代谢性疾病，危害广泛而严重，应该提前预防，降低病痛风险，提高生命质量［24］。中医药以“整体观念”和“未病先防”为理论指导具有多途径、多靶点的优势［25］，因此基于证效相关理论建立适合中医功效的证候动物模型十分必要，未来将以此为基础开展高尿酸血症最为常见的湿热内蕴证患者的证候研究，以期从基础和临床全面揭示湿热内蕴型高尿酸血症的本质以及清利湿热法科学内涵。

利益冲突声明：无。

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（2022-11-15收稿 本文编辑：吴珊）

基金项目：国家重点研发计划（2018YFC1706803）作者简介：刘金莲（1994.08—），女，博士研究生在读，研究方向：中药药性与药效作用机制及物质基础研究，E-mail：947936093@qq.com通信作者：王淳（1970.02—），博士，教授，硕士研究生导师，研究方向：中药基本理论与临床应用，E-mail：chunwang_2008@163.com；曹春然（1972.08—），女，在职硕士研究生，主任药师，研究方向：药理和毒理学评价，E-mail：chunrancao@bidc.org.cn