多靶点蛋白酪氨酸激酶抑制剂Ponatinib对人肝癌细胞SK-Hep-1增殖、黏附和迁移能力的影响

刘畅，裴晋红，穆秀丽，于保锋

1.长治医学院基础部生物化学与分子生物学教研室，山西 长治 046000；2.山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，山西 太原 030001

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发病率居全球癌症发病率第6 位，每年约100 万人罹患HCC，约60 万人死亡，致死率居全球癌症致死率第3 位［1-3］。HCC 的复发率和转移率均较高，患者术后5 年生存率仅为25%～50%［3］。研究表明，早期HCC患者术后平均生存期为5年，5年生存率为40%～70%，晚期患者术后平均生存期仅为10.7个月，5年生存率为10%～20%［3-4］。约90%的肿瘤患者死于复发和转移，因此，寻求可有效抑制HCC发生发展的药物是目前分子治疗领域的研究热点之一。

Ponatinib（AP24534）是一种用于口服的多靶点蛋白酪氨酸激酶抑制剂，能够抑制包括血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）、Src、血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）、肝配蛋白受体（ephrin receptor，EphR）和成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）在内约50 种蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTKs）的活性［5-6］，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）已批准Ponatinib 用于治疗伊马替尼抗性的慢性粒细胞白血病［7-8］。Ponatinib能够抑制人脐静脉内皮细胞、结直肠癌细胞和肿瘤嗜酸性粒细胞的迁移［9-11］，并能有效抑制人U87 恶性胶质母细胞瘤细胞、神经母细胞瘤细胞和子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移［12-14］。另有研究表明，Ponatinib能够抑制乳腺癌肺转移（breast cancer lung metastasis，BCLM）［15］。目前，尚未见Ponatinib 对HCC 细胞间黏附和迁移影响的相关报道。因此，本研究通过MTT法、细胞缓慢聚集试验、细胞分离试验、划痕试验和Western blot法检测Ponatinib 对人肝癌细胞SK-Hep-1 增殖、黏附和迁移能力的影响，以期为Ponatinib 作为临床抗癌药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 人肝癌细胞系SK-Hep-1购自中科院上海细胞库，且经短串联重复序列（short tandem repeat，STR）鉴定正确。

1.2 药物 Ponatinib 等24 种酪氨酸激酶抑制剂购自美国Selleck Chemicals公司。

1.3 主要试剂 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司；DMEM高糖培养基购自美国HyClone公司；琼脂粉购自美国Sigma公司；MTT、DMSO、SDSPAGE凝胶制备试剂盒、RIPA裂解液及彩虹180广谱蛋白marker 均购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗E-cadherin 单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology 公司；鼠抗GAPDH 单克隆抗体、HRP 标记的羊抗兔IgG 和HRP 标记的羊抗鼠IgG 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL 发光试剂盒购自北京康为世纪生物技术有限公司。

1.4 细胞培养 将SK-Hep-1 细胞用含10% FBS 的DMEM 高糖培养基，于37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养，每隔2 d 换液1 次，培养3～5 d 进行传代，取第3代细胞进行后续试验。

1.5 酪氨酸激酶抑制剂对SK-Hep-1 细胞存活及增殖影响的检测 采用MTT法。将SK-Hep-1细胞接种至96孔板，（3～5）×103个／孔，37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养24 h；弃培养基，加入Ponatinib等24种酪氨酸激酶抑制剂（均1∶4稀释），200 μL／孔，继续培养72 h；加入5 mg／mL的MTT溶液，50 μL／孔，37 ℃避光孵育4 h；弃MTT，加入DMSO，200 μL／孔，37 ℃振荡培养10 min，用酶标仪检测A490和A570，并按下式计算细胞相对存活率。以药物浓度的对数值为横坐标，细胞相对存活率为纵坐标，绘制剂量效应曲线。应用Graphpad Prism 8软件计算IC50。

1.6 Ponatinib对SK-Hep-1细胞黏附影响的检测

1.6.1 细胞缓慢聚集试验 将SK-Hep-1 细胞加入6孔板，1×105个／孔，37 ℃培养至融合度达50%时，分别加入0.1、0.5 和1.0 μmol／L 的Ponatinib，2 mL／孔，室温处理24 h；用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞后，接种至96孔板，2×104个／孔，同时设对照组（不加Ponatinib），每组设6 个复孔，37 ℃培养12 h，显微镜下观察细胞聚集情况，计算各组细胞团数［16］。

1.6.2 细胞分离试验 按1.6.1项方法用Ponatinib处理SK-Hep-1细胞；经不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞后，接种至48孔板，1×104个／孔，每组设6个复孔，于37 ℃培养至0融合度达90%时，分别加入含1 mmol／L EDTA（TE）和1 mmol／L CaCl2（TC）的0.1%胰酶溶液，同时设对照组（不加Ponatinib），37 ℃消化10 min，显微镜下观察细胞分离情况，计算各组细胞团数和单个细胞数（N），以NTC／NTE表示细胞分散程度［17］。

1.7 Ponatinib对SK-Hep-1细胞迁移影响的检测 采用划痕试验［18］。按1.6.1项方法用Ponatinib处理SKHep-1细胞；经不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞后，接种至6 孔板，1 × 105个／孔，同时设对照组（不加Ponatinib），37 ℃培养；待细胞融合度达90%时，用灭菌移液枪枪头（10 μL）在单层细胞上呈“十”字垂直划痕，PBS 洗涤1 次，加入无血清DMEM 高糖培养基2 mL，于37 ℃分别培养0、24、48 h，显微镜下观察并拍照，应用Image J软件测量不同时间的划痕面积，并按下式计算迁移率。

1.8 Ponatinib对SK-Hep-1细胞中E-cadherin蛋白表达水平影响的检测 采用Western blot法。按1.6.1项方法用Ponatinib 处理SK-Hep-1 细胞，同时设对照组（不加Ponatinib）。用RIPA裂解液提取总蛋白，经10%SDSPAGE 分离后，转移至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入兔抗E-cadherin 单克隆抗体（1∶500稀释）和鼠抗GAPDH 单克隆抗体（1∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜；TBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗兔IgG和HRP标记的羊抗鼠IgG（均1∶1 000稀释），室温作用1 h；ECL法显色，应用Image J软件计算蛋白表达水平。

1.9 统计学分析 应用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，检测结果以3 次独立重复试验均值± 标准差（）表示，两组均值间的比较采用独立样本t检验，多个样本均值间比较采用方差分析，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酪氨酸激酶抑制剂对SK-Hep-1 细胞存活和增殖的影响 24 种酪氨酸激酶抑制剂均能够抑制SKHep-1 细胞存活率，药物浓度越高抑制作用越强，呈浓度依赖性，见图1。大多数激酶抑制剂抑制SKHep-1 细胞的IC50＞1 μmol／L，对Ponatinib 最敏感，IC50达（0.288±0.044）μmol／L，见图2。

图1 不同酪氨酸激酶抑制剂对SK-Hep-1细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different tyrosine kinase inhibitors on proliferation of SK-Hep-1 cells

图2 SK-Hep-1细胞经不同酪氨酸激酶抑制剂处理后的IC50Fig.2 IC50 of SK-Hep-1 cells treated with different tyrosine kinase inhibitors

2.2 Ponatinib对SK-Hep-1细胞黏附的影响

2.2.1 细胞缓慢聚集试验 对照组SK-Hep-1细胞形成大量不规则的分散聚集体；随着Ponatinib 浓度的升高，SK-Hep-1细胞团块数减少，形成体积大且致密的聚集体，见图3。对照组、0.1、0.5 和1.0 μmol／L Ponatinib组细胞团块数分别为（162.3±6.1）、（87.0±5.3）、（2.3±1.5）和（2.0±1.0）个。与对照组比较，0.1、0.5 和1.0 μmol／L Ponatinib 组细胞团块数明显减少（t分别为16.143、44.002、44.853，P均＜0.001）。表明Ponatinib可促进SK-Hep-1细胞聚集，且聚集能力随Ponatinib浓度升高而增强，呈浓度依赖性。

图3 各组SK-Hep-1细胞的聚集情况（×40）Fig.3 Aggregation of SK-Hep-1 cells in various groups（×40）

2.2.2 细胞分离试验 TC 组SK-Hep-1 细胞随着Ponatinib 浓度升高聚集形成明显团块，TE 组细胞均呈均匀分散，不形成团块，见图4。对照组、0.1、0.5和1.0 μmol／L Ponatinib 组 细 胞NTC／NTE分 别 为0.88±0.04、0.78±0.03、0.60±0.03和0.24± 0.02。与对照组比较，0.1、0.5和1.0 μmol／L Ponatinib组细胞NTC／NTE明显降低（t分别为4.276、10.625、27.571，P均＜0.05）。表明Ponatinib可抑制SK-Hep-1细胞分散，促进细胞黏附，且黏附能力随Ponatinib 浓度升高而增强，呈浓度依赖性。

图4 各组SK-Hep-1细胞的分离情况（×100）Fig.4 Dissociation of SK-Hep-1 cells in various groups（×100）

2.3 Ponatinib 对SK-Hep-1 细胞迁移的影响 划痕24 及48 h 后，与对照组比较，0.1 μmol／L Ponatinib组细胞划痕迁移率差异无统计学意义（t分别为0.473和0.872，P均＞0.05），但0.5及1.0 μmol／L Ponatinib组明显降低（t=6.272 ～16.733，P均＜0.01）。见图5 和表1。表明Ponatinib 能够抑制SK-Hep-1 细胞迁移，且迁移能力随着Ponatinib 浓度升高而降低，呈浓度依赖性。

表1 各组SK-Hep-1细胞的迁移率（%，±s，n=3）Tab.1 Migration rate of SK-Hep-1 cells in various groups（%，±s，n=3）

表1 各组SK-Hep-1细胞的迁移率（%，±s，n=3）Tab.1 Migration rate of SK-Hep-1 cells in various groups（%，±s，n=3）

注：与对照组比较，aa表示P ＜0.01，aaa表示P ＜0.001。

组别对照组Ponatinib组（μmol／L）0.1 0.5 1.0 0 h 0 0 0 0 24 h 32.43±1.25 48 h 52.53±2.11 31.67±2.52 26.37±1.12aa 14.30±1.40aaa 50.40±3.68 40.80±2.26aa 24.83±2.28aaa

图5 各组SK-Hep-1细胞的迁移能力（×100）Fig.5 Migration ability of SK-Hep-1 cells in various groups（×100）

2.4 Ponatinib 对SK-Hep-1细胞中E-cadherin 蛋白表达水平的影响 对照组、0.1、0.5和1.0 μmol／L Ponatinib组SK-Hep-1细胞中E-cadherin蛋白表达水平分别为0.07±0.01、0.11±0.01、0.16±0.03、0.17±0.02。与对照组比较，0.1、0.5 和1.0 μmol／L Ponatinib 组均显著升高（t分别为-3.757、-4.561、-6.922，P均＜0.05），见图6。

图6 各组SK-Hep-1细胞中E-cadherin蛋白的表达情况Fig.6 Expression of E-cadherin protein in SK-Hep-1 cells of various groups

3 讨论

有研究表明，Ponatinib 能够抑制神经母细胞瘤细胞、携带FGFR2 突变的子宫内膜癌细胞和胆管癌细胞的侵袭和迁移［13-14，19］，尚无Ponatinib对SK-Hep-1细胞影响的相关报道，因此，本研究通过多种方法评价了Ponatinib 对肝癌细胞SK-Hep-1 增殖、黏附和迁移能力的影响。

恶性肿瘤的发生与肿瘤细胞克服细胞间黏附作用，开始侵袭周围组织有关［20］。钙黏蛋白（cadherin）是一类介导Ca2+依赖性细胞黏附作用的整合膜蛋白［21］，其中，E-cadherin 是上皮细胞中的主要黏附分子，其在人上皮细胞癌中表达水平较低［22-23］。大量研究表明，E-cadherin 表达水平降低会减弱细胞间黏附力，促进肿瘤细胞侵袭和迁移［20，24］。本研究通过细胞缓慢聚集试验和细胞分离试验检测Ponatinib 对SK-Hep-1 细胞黏附的影响，为实现体外检测细胞在悬浮状态下的聚集能力，本研究将热琼脂提前加入培养皿冷却凝固后再使用［25］，结果表明，对照组形成的SK-Hep-1 细胞团块体积较小，疏松分散，黏附力弱；Ponatinib 处理后细胞间形成的团块体积增大，集中于孔中央，黏附力增强。细胞分离试验中，分别用含有Ca2+（CaCl2）和不含Ca2+（EDTA）的胰酶消化细胞，显微镜下观察细胞团形成情况，并将形成的细胞团数计作NTC，单个细胞数计作NTE。E-cadherin 介导的细胞黏附行为依赖于Ca2+，因此，使用含有Ca2+的胰酶消化细胞后，E-cadherin 能够正常介导细胞黏附，使细胞团块数增多，NTC小于NTE；而含有EDTA 的胰酶可螯合Ca2+，抑制E-cadherin介导的细胞间黏附，使细胞间黏附力减弱，单个细胞数增多。因此，NTC／NTE可反映细胞间黏附能力和E-cadherin 表达水平，NTC／NTE越小，细胞间黏附力越强，E-cadherin表达水平越高。结果表明，Ponatinib可促进肝癌细胞SK-Hep-1聚集，抑制细胞分离，并呈浓度依赖性。Western blot检测结果也证实，SK-Hep-1 细胞中E-cadherin 的表达水平随Ponatinib浓度升高而增加。

E-cadherin被认为是一种抑癌基因，其表达水平升高会促进细胞间黏附，抑制癌细胞迁移和侵袭［26］。癌细胞的侵袭和迁移水平是临床病理诊断的重要依据之一。本研究采用划痕试验检测Ponatinib 对SKHep-1 细胞迁移水平的影响，使用10 μL 移液枪枪头在单层细胞上呈“十”字垂直划痕，48 h后镜下观察细胞迁移面积，结果显示，48 h后0.5和1.0 μmol／L Ponatinib组细胞的迁移面积显著低于对照组（P＜0.05）。

综上所述，Ponatinib 能够促进SK-Hep-1 细胞间黏附，抑制该细胞迁移。今后，将使用动物模型进一步探索Ponatinib 抑制HCC 细胞黏附和迁移的有效性及作用机制。