背外侧被盖核GABA能神经元在七氟醚致意识改变中的作用机制

郑丹旭,汪 莹,徐 茂,蔡 霜,王 袁,喻 田,罗天元,余守洋

(1.遵义医科大学 贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室,贵州 遵义 563099;2.贵州省普通高等学校脑科学特色重点实验室,贵州 遵义 563009;3.遵义医科大学附属医院 麻醉科,贵州 遵义 563000)

全身麻醉药因能产生可逆性意识消失、痛觉消失、反射抑制和肌肉松弛等作用而被广泛运用于临床手术,乙醚等全身麻醉药物成功地应用于临床手术是近代麻醉学的开端。然而一百多年来,全身麻醉药物诱导可逆性意识消失的机制仍然是未解之谜。全身麻醉与睡眠具有相似性且相互影响,麻醉与睡眠均表现为觉醒水平降低以及对外界环境刺激反应的抑制。近年来有研究表明,全身麻醉状态与自然睡眠具有相似的脑电图以及局部的脑功能变化[1]。脑血流影像学实验也表明麻醉药物诱导意识消失和非快动眼睡眠状态相似,脑血流量都呈下降趋势,丘脑、前脑基底、额叶、顶叶皮质等区域呈现活动抑制,并且高级信息整合区域的抑制更加明显[2-4]。

背外侧被盖核(laterodorsal tegmentum,LDT)是位于中脑导水管周围灰质的一个核团,其不仅是上行中脑胆碱能系统(ascending mesolimbic cholinergic system ,AMCS)的起源,同时也是上行网状激活系统(ascending reticular activating system,ARAS)与皮层之间相互联系的重要中继站[5]。LDT已被发现在各种行为中发挥关键作用,包括唤醒、奖励和先天防御[6-9]。LDT中的神经元排列成高度异质性的结构,包括胆碱能、谷氨酸能和γ-氨基丁酸能神经元[10]。LDT接收的神经输入大部分来自中脑、后脑、皮层和下丘脑,也有相当一部分来自边缘系统,包括下丘脑外侧(lateral hypothalamus,LH)、中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)和中央杏仁核(central amygdaloid nucleus ,CeA)。LDT的输出大部分到达中脑、丘脑和皮层,包括伏隔核(nucleus accumben,NAc)、下丘脑前区(anterior hypothalamus,AH)、小脑、mPFC、海马(hippocampus,HI)、嗅球(olfactory bulb,OB)、视前区(preoptic region,PO)、VTA[9]。其中NAc[11]、内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC )[12]、VTA等[13]多个核团均有报道与麻醉-觉醒相关,表明LDT可能是作为调节麻醉的节点之一。

本实验拟采用光纤钙信号记录七氟烷麻醉过程中LDT脑区GABAergic神经元的活性变化,并通过化学遗传方法特异性调控小鼠LDT脑区GABA能神经元,从而研究LDT脑区GABA能神经元在七氟醚麻醉致意识改变中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 实验小鼠为健康雄性Vgat-IRES-Cre(在GABA神经元中表达Cre酶的转基因小鼠,简称Vgat小鼠)和tdTomato转基因小鼠(与Cre小鼠交配后,再由Cre的细胞中表达红色荧光蛋白,简称Ai14小鼠)分别来自北京生命科学研究所罗敏敏实验室和上海科技大学沈伟实验室。饲养于遵义医科大学实验动物中心SPF级动物房,小鼠被单独饲养在能自由获取食物和水的通风隔离室中,并伴随12 h/12 h的明暗循环(8∶00关灯,20∶00开灯),环境温度维持在23～26 ℃,相对湿度维持在50%～60%。

1.1.2 实验仪器 脑立体定位仪(小鼠)、微量注射泵(WZS-50F6)、微量注射针、小鼠麻醉诱导箱、七氟醚麻醉气体挥发罐购自于RWD科技有限公司;冰冻切片机CM1950购自Leica;BX51W1-IR7显微镜(手术)、荧光显微镜购自于日本Olympus公司;脑电记录系统购自于Bio-Signal公司;P-97微量电极拉制仪购自美国Sutter公司。多通道光纤记录系统购自于杭州荧科生物技术有限公司。

1.1.3 实验试剂 利多卡因注射液购自西南药业股份有限公司;多聚甲醛(粉剂)购自美国Sigma公司;rAAV2/9-EF1α-DIO-hM3D(Gq)-EGFP、rAAV2/9-EF1α-DIO-hM4D(Gi)-EGFP、rAAV2/9-EF1α-DIO-EGFP、AAV-hSyn-DIO-GCaMP6s购自于布林凯斯生物技术有限公司;异氟烷购自RWD 生命科技有限公司;过氧化氢消毒液购自贵州鑫源生物科技有限公司;磷酸盐缓冲溶液(PBS)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;0.9%氯化钠注射液购自于贵州科伦药业有限公司;包埋剂购自于美国Sakura Finerek公司;碘伏消毒液购自于江西百医卫仕医疗科技有限公司;封闭用正常驴血清购自于索莱宝科技有限公司;牛血清白蛋白购自于Servicebio公司;75%乙醇消毒液购自于山东安捷高科消毒科技有限公司;蔗糖(粉剂)购自于北京中杉金桥生物技术有限公司。义齿自凝型基托树脂购自于贵州爱瑞达生物科技有限公司;cozapine-N-oxide购自于美国Med Chem Express LLC。

1.2 实验方法

1.2.1 光纤钙信号小鼠模型的建立 选取健康成年雄性Vgat:Ai14小鼠8只,体重20～24 g,将实验小鼠放入浓度1.2%异氟醚麻醉诱导箱中,待小鼠翻正反射消失,用动物剃毛机,剃除小鼠头部手术部位毛发,将小鼠置于小鼠脑立体定位仪上,并持续吸入0.8%的异氟醚,手术部位用碘伏消毒,然后注射局部麻醉药利多卡因。剪开头皮,暴露手术部位,并用棉签蘸取浓度10%过氧化氢消毒液擦拭颅骨表面,以此辅助颅骨缝能清晰暴露于显微镜下。随后进行调平,首先确定Bregma点和Lambda点位置,以B点为原点,左右2.1 mm及B点和L点,前后高度差小于0.03 mm,即为调平。根据第3版小鼠脑图谱(watson and paxinos)定位LDT:以Bregma点为参照原点,前后:-4.96 mm,内外:±0.45 mm ,腹背:-3.2 mm,用墨水做标记,然后用颅骨钻钻出小洞。微玻璃电极100 nL/min抽取100 nL病毒AAV-hSyn-DIO-GCaMP6s并以速度10 nL/min单侧注射到小鼠LDT区,并将光纤陶瓷插芯(直径:200 μm)放置在高于病毒处0.02 mm处。用1454胶将颅骨与光纤陶瓷插芯固定,待胶水干燥后,用自凝型义齿基托树脂将光纤固定于颅骨表面,将小鼠取下放在恒温环境待到其苏醒。待病毒转染表达3周后,进行后续实验记录。

1.2.2 神经元钙信号记录 本实验利用多通道光纤记录系统记录小鼠特异性神经元钙信号(图1)。将小鼠放置于麻醉诱导盒中,在麻醉开始前5 min记录,随后给与浓度为2.3%七氟醚进行麻醉(打上标记),待小鼠翻正反射消失后持续麻醉20 min,麻醉结束后(打上标记),待翻正反射恢复以后,继续记录5 min。将记录的结果应用Inper分析软件 InperDataProcess进行数据预处理和数据再分析,计算ΔF/F,ΔF/F = (F - Fbaseline) / Fbaseline,Fbaseline为麻醉前或麻醉维持过程中的平均值。

图1 神经元钙信号记录流程

1.2.3 病毒注射位置验证及免疫荧光染色 小鼠吸入浓度1.4%异氟醚,待其无疼痛反应后,手术暴露胸腔并经心脏主动脉先后灌注4 ℃预冷的PBS缓冲液及甲醛。灌注完成后,取脑并浸泡于4 % 甲醛溶液4 ℃过夜进行后固定,然后入30%蔗糖溶液进行脱水。待脑组织沉糖后用包埋剂包埋进行冷冻切片,切片厚度为30 μm,将切片浸泡于PBS缓冲液中,将切下的脑片贴于载玻片上于荧光显微镜下观察。

1.2.4 化学遗传学小鼠模型建立 选取健康雄性Vgat:Ai14 小鼠24只,随机分为化学遗传激活组、抑制组和对照组。参照1.2.1的方法建立化学遗传学模型。在小鼠双侧LDT分别注入100 nL不同的病毒:化学遗传激活组(n=8),rAAV2/9-EF1α-DIO-hM3D(Gq)-EGFP;抑制组(n=8),AAV2/9-EF1α-DIO-hM4D-(Gi)-EGFP;对照组(n=8),rAAV2/9-EF1α-DIO-EGFP。随后,在小鼠颅骨表面(AP:+1,ML:±1.5;AP:-3.5,ML:±1)4个点钻入4颗颅骨钉,将脑电电极的4根银丝分别缠绕在对应的颅骨钉上,用1454胶水固定,待胶水干燥后,用自凝型义齿基托树脂将脑电电极及光纤固定于颅骨表面,将小鼠取下放在恒温环境待到其苏醒。病毒转染表达3周后,进行后续化学遗传学实验记录。

1.2.5 化学遗传学激活/抑制LDTVgat神经元活性记录的行为学及脑电记录 化学遗传学行为及脑电记录均在9∶00～17∶00时间进行,室温控制在23 ℃左右,实验前1 h分别给实验组和对照组小鼠腹腔注射1 mg/kg的氯氮平氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)及生理盐水(normal saline,NS),待CNO起效后开始进行实验(图2)。首先记录5 min清醒状态下小鼠的脑电波形,之后将小鼠置于浓度为2.3%七氟醚的麻醉诱导盒中,记录小鼠翻正反射消失(loss of righting reflex,LORR)时间,并打上标记,在小鼠出现翻正反射恢复(recovery of righting reflex,RORR)后,持续麻醉20 min,然后关闭七氟醚挥发罐,并用气体回收器抽出残留七氟醚,并记录小鼠RORR,待RORR出现后,继续记录5 min。将实验记录的脑电数据录入Spike 2脑电分析软件得到相应数据,再用SPSS进行统计分析,然后利用Graphpad Prism 6做出相关统计图。行为学数据直接用SPSS进行统计分析,用Graphpad Prism 6做出统计图。

图2 化学遗传学实验流程

1.2.6 免疫荧光染色 化学遗传学实验完毕后,对小鼠进行灌注取脑。将切下来的脑片置于载玻片上,在室温下封闭液孵育2 h(封闭液:0.3% Triton X-100,1%牛血清白蛋白以及 10%山羊血清的 PBS缓冲液),之后将脑片置于一抗稀释液(稀释比例1∶200)4 ℃过夜,第二天复温30 min后,用PBS缓冲液洗涤3次(10 min/次),然后置于二抗稀释液(稀释比例:1∶1 000)中室温孵育2 h,再用PBS缓冲剂洗涤3次(10 min/次)。洗涤完毕后将玻片晾干,用DAPI封闭并盖上盖玻片。在荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 在七氟醚麻醉过程中LDTVgat的活性变化情况 七氟醚麻醉钙信号检测实验中(图3),选择分为6个时间段对LDTVgat钙信号活性变化进行分析,分别是清醒期(LORR前100～50 s)、麻醉诱导期(LORR前50 s)、麻醉早期(LORR后100 s)、麻醉末期(RORR前100～50 s)、麻醉恢复期(RORR前50 s)以及苏醒期(RORR后100 s)。结果显示,吸入浓度2.3%七氟醚后麻醉诱导期钙信号活性较清醒期明显下降(P<0.01),且在麻醉早期,钙信号活性进一步下降(P<0.01)。而在麻醉苏醒阶段,麻醉恢复期钙信号较麻醉末期明显增强(P<0.01),且在苏醒期钙信号活性也较麻醉恢复期进一步增强(P<0.01)。上述结果表明在七氟醚全身麻醉药发挥作用过程中LDTVgat活性受到抑制。提示LDTVgat参与了七氟醚致意识改变过程。

A:第3版小鼠脑图谱中,LDT层面冠状切面,黑色方框选中位置为LDT;B:小鼠插入陶瓷光纤示意;C:小鼠脑切片病毒位置验证图(200 μm);D:E相关热量图;E:小鼠给与七氟醚后发生LORR的前后100 s事件相关线图,深红色线代表均值粉色阴影区域代表标准差(s),绿色虚线代表给药时刻;F:D图均值的统计分析结果;G:H相关热量图;H:为小鼠给与七氟醚后发生RORR的前后100 s事件相关线图,深红色线代表均值粉色阴影区域代表标准差(s),绿色虚线代表RORR出现时刻; I:G图均值的统计分析结果;**:P<0.01;n=6。图3 在七氟醚麻醉过程中LDTVgat的变化情况

2.2 化学遗传学特异性调控LDTVgat对七氟醚麻醉的影响

2.2.1 化学遗传学激活LDTVgat在七氟醚麻醉下免疫荧光验证 将rAAV2/9-EF1α-DIO-hM3D(Gq)-EGFP注射到Vgat-IRES-Cre小鼠LDT脑区,免疫荧光染色结果显示,病毒特异的标记了Vagt神经元,结果如图4。

A:hM3D(Gq)病毒(100 μm);B:Vgat神经元(100 μm);C:神经元免疫荧光染色与病毒重合结果(100 μm);D:C图的局部放大图。图4 化学遗传学激活 LDTVgat神经元病毒注射位点验证

2.2.2 化学遗传学激活LDTVgat对七氟醚麻醉下小鼠行为学及皮层脑电的影响 利用化学遗传学手段激活LDTVgat后小鼠在七氟醚麻醉下行为学及皮层脑电分析结果(图5):在LORR过程中:hM3DqNS组LORR时间为(90.89±7.6)s,而hM3DqCNO组LORR时间为(69.7±4.3)s,皮层脑电结果为在麻醉诱导期hM3DqNS组δ波为0.37±0.1,γ波为0.17±0.04,而hM3DqCNO组δ波为0.56±0.16,γ波为0.08±0.06,对结果进行统计分析,认为化学遗传学激活LDTVgat神经元缩短了七氟醚麻醉下小鼠LORR时间。而在RORR过程中:在七氟醚麻醉组hM3DqNS组RORR时间为(161.3±18.7)s,而hM3DqCNO组RORR时间为(337.0±180)s,皮层脑电的结果为在麻醉恢复期hM3DqNS组γ波为0.10±0.02,而hM3DqCNO组γ波为0.06±0.02,在麻醉过程中爆发性抑制率(burst suppression ratio,BSR) 为(1.260±1.154)%,hM3DqCNO组为(27.66±22.70)%,差异具有统计学意义。进行统计分析,认为化学遗传学激活LDTVgat可以促进七氟醚麻醉效应。

A:化学遗传学激活Vgat神经元缩短七氟醚麻醉诱导时间;B:激活Vgat神经元对麻醉诱导期皮层脑电的影响;C:激活Vgat神经元会延长七氟醚麻醉苏醒时间;D:激活Vgat神经元对麻醉苏醒期皮层脑电的影响;E:化学遗传学激活Vgat神经元在七氟醚麻醉中BSR增加;F:整个麻醉过程中BSR变化。脑电数据采用配对t检验进行分析;行为学各组数据间采用独立样本t检验进行分析;*:P<0.05。图5 化学遗传学激活LDTVgat神经元促进七氟醚的麻醉效应

2.2.3 化学遗传学抑制LDTVgat在七氟醚麻醉下免疫荧光验证 将 rAAV2/9-EF1α-DIO-hM4D(Gi)-EGFP注射到Vgat-IRES-Cre小鼠LDT脑区,免疫荧光染色结果显示,病毒特异的标记了Vgat神经元,结果如图6。

A:hM4D(Di)病毒(100 μm);B:Vgat神经元(100 μm);C:神经元免疫荧光染色与病毒重合结果(100 μm);D:C图的局部放大图。图6 化学遗传学抑制 LDTVgat神经元病毒注射位点验证

2.2.4 化学遗传学抑制LDTVgat对七氟醚麻醉下小鼠行为学及皮层脑电的影响 利用化学遗传学手段抑制LDTVgat神经元后小鼠在七氟醚麻醉下行为学及皮层脑电分析结果(图7):在LORR过程中:hM4DiNS组LORR时间为(89.67±11.62)s,而hM4DiCNO组LORR时间为(112.0±18.9)s;皮层脑电结果:在麻醉诱导期hM4DiNS组δ波为0.60±0.13,而hM4DiCNO组δ波为0.33±0.15,对结果进行统计分析,认为化学遗传学抑制LDTVgat神经元延长了七氟醚麻醉下小鼠的麻醉诱导时间。而在RORR过程中,在七氟醚麻醉下hM4DiNS组RORR时间为(149.3±58.60)s,而hM4DiCNO组RORR时间为(101.7±28.4)s;皮层脑电的结果:在麻醉恢复期hM4DiNS组δ波(1～4 Hz)为0.50±0.10,而hM4DiCNO组δ波为0.30±0.10,γ波为0.05±0.03,在麻醉过程中,hM4DiNS组BSR为(23.07±20.94)%,hM4DiCNO组为(22.57±22.27)%,差异无统计学意义。对结果进行统计分析,认为化学遗传学抑制LDTVgat神经元可以缩短小鼠七氟醚麻醉苏醒时间。

A:化学遗传学抑制Vgat神经元延长七氟醚麻醉诱导时间;B:抑制Vgat神经元对麻醉诱导期皮层脑电的影响;C:抑制Vgat神经元会缩短七氟醚麻醉苏醒时间;D:抑制Vgat神经元对麻醉苏醒期皮层脑电的影响;E:化学遗传学抑制Vgat神经元在七氟醚麻醉中BSR无明显变化;F:整个麻醉过程中BSR变化。脑电数据采用配对t检验进行分析;行为学各组数据间采用独立样本t检验进行分析;*:P<0.05。图7 化学遗传学抑制LDTVgat神经元促进七氟醚的麻醉苏醒效应

3 讨论

GABA能系统在控制清醒和睡眠过程中起着重要作用,许多麻醉药和镇静药物通过增强GABAA受体的导电性而起作用[14]。有实验表明异氟烷和丙泊酚不会改变GABA和谷氨酸的摄取、结合或者转运过程[15],然而异氟烷和丙泊酚已被证明能抑制皮层谷氨酸和GABA神经递质的释放[16]。光纤钙信号记录是将钙离子浓度敏感蛋白(genetically encoded fluorescent calciμm indicator GCaMP)表达至特定神经元中,通过光纤信号激发GCaMP的荧光可实时记录荧光信号强度的方法[17]。该方法记录的是被标记的神经元群体信号,在本实验中发现,Vgat神经元群体的活性在麻醉过程中呈现下降趋势,而在麻醉停止后意识恢复过程中,出现上升趋势。Luo等[18]研究发现,使用光纤钙信号记录腹外侧视前核(ventrolateral preoptic nucleus,VLPO)脑区的Vgat能神经元在丙泊酚、异氟烷、氯胺酮等麻醉后,神经元的Ca2+活性被强烈抑制,这与我们的结果是一致的。进一步使用内窥镜成像技术发现,在麻醉过程中大部分Vgat神经元活性被抑制,部分神经元活性没有变化,但仍有少部分Vgat能神经元在麻醉过程中被激活,而这部分被激活的Vgat神经元可能发挥着重要作用。猜测在LDT脑区的Vgat神经元可能和VLPO脑区结果相似。在七氟醚致全身麻醉过程中,大部分LDTVgat活性受到抑制,由于实验技术的局限性,我们未能对不同状态的LDTVgat活性进行细致的观察。

在脊椎动物的中枢神经系统中,GABA是分布最广泛的抑制性神经递质[19],而在LDT脑区,LDT所占比例最大为58%。GABAA和GABAC亚型与氯离子通道耦合,而GABAB亚型为G蛋白偶联受体[20]。GABA受体激动剂被证明会破坏发育阶段大鼠的皮层突触功能,导致出现记忆障碍[21]。而注射GABAA受体激动剂可减少大鼠引起翻正反射所用的麻醉剂量[22]。有数据表明,丙泊酚通过增强GABAA受体介导的紧张性抑制来抑制海马CA1神经元的兴奋性[23]。氯胺酮、水合氯醛、氟烷麻醉和非快速眼动睡眠均能降低VTA清醒激活Vgat神经元的放电率[24]。本研究发现,激活LDTVgat可以缩短七氟醚麻醉诱导时间,并延长麻醉恢复时间。而抑制LDTVgat则出现与之相反的结果。δ震荡是NREM期间的典型震荡[25],并且有研究表明,在麻醉诱导期或维持阶段,可以观察到δ震荡[26]。而皮层γ频率节律被认为是安静睡眠时期EEG的特征波[27]。本研究发现,激活LDTVgat神经元γ波增加,皮层活动增加;而抑制LDTVgat神经元δ波增加,皮层活动减少。

本实验仍存在一些局限性:在LDT脑区除了GABA能神经元以外,还存在胆碱能神经元以及谷氨酸能神经元[10],它们在麻醉致意识改变过程中的作用及其之间的局部环路仍不清楚。另一方面,LDT脑区分为多个亚区,本实验并未区分各个亚区,各亚区在麻醉中的作用仍待进一步研究。