载IR780/PFH纳米粒双模态成像及增效高强度聚焦超声消融牛肝的实验研究

杜 燕 唐 瑜 欧 霞 林 丽 张 中 汪瑶台 罗 勇 邹建中

恶性肿瘤会严重影响人类心身健康，尤其是乳腺癌，作为女性最常见的恶性肿瘤之一，受环境、遗传、生活方式等影响，近年其发病呈年轻化趋势［1-2］。因此，迫切需要探索一种精准的诊疗方式，早期发现并对症治疗，以减轻手术、放化疗带来的身体及心理负担，提高患者生活质量［3］。高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）作为一种非侵入性肿瘤消融新技术在临床已广泛应用，纳米粒协同HIFU可以提高消融肿瘤的效率，但其存在靶向性差、成像模式单一的局限。因此，如何更安全、高效地提高纳米粒协同HIFU 消融肿瘤的疗效是临床亟需解决的问题。本实验通过制备载IR780/全氟己烷（PFH）的脂质体纳米粒（IR780-CLs），旨在实现诊疗一体化的目的，为乳腺癌的精准诊疗提供新思路。

材料与方法

一、主要实验材料及仪器

1.主要材料：IR780 碘化物（美国Sigma 公司）；二甲基亚砜（DMSO）、三氯甲烷（重庆川东化工有限公司）；二棕榈酰基卵磷脂（DPPC）、聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000-Amine）、胆固醇盐酸盐（美国Avanti公司）；PFH（上海麦克林生化科技有限公司）；4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、细胞膜红色荧光探针（DiI）均由上海碧云天生物技术有限公司提供；4T1 乳腺癌细胞由重庆医科大学超声影像学研究所提供。

2.主要仪器：声震仪（XL2020，美国Sonic 公司）；旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）；透射电镜（H-7600，日本日立公司）；Zeta 电位及粒度分析仪（美国布鲁克海文仪器公司）；超声波清洗仪（上海超声仪器有限公司）；电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；紫外分光光度计（NanoDrop 2000，美国Thermo Scientific 公司）；高速离心机（德国Eppendorf 公司）；光声成像系统（Vevo LAZR，加拿大Visual Sonics 公司）；共聚焦显微镜（A1+R，日本Nikon 公司）；DFY 软件（重庆医科大学超声影像学研究所），JC 200 海扶刀®聚焦超声肿瘤治疗系统（重庆海扶医疗科技股份有限公司）。被动空化检测由空化检测换能器（V309-SU，焦距40 mm，直径13 mm，中心频率5 MHz，美国泛美公司）、NI 超高速数据采集卡（PXIe-5122，美国国家仪器有限公司）及LabVIEW 数据采集程序（v10.0.1，美国国家仪器有限公司）组成。

二、实验方法

1.IR780-CLs的制备：使用电子天平按质量比12∶4∶4∶1精密称取DPPC、DSPE-PEG2000-Amine、胆固醇盐酸盐、IR780 碘化物，加入100 ml 的圆底烧瓶内，并将15 ml 三氯甲烷置于水浴锅内充分溶解。于避光条件下将装有混合物的圆底烧瓶连接在旋转蒸发仪上，设置参数为45℃、100 r/min，1 h 后去除圆底烧瓶内的三氯甲烷，瓶壁形成均匀的脂质体薄膜。加入2 ml PBS至烧瓶内，置于超声波清洗仪上充分振荡使脂质体薄膜完全溶解，将溶解后的脂质体溶液转移至10 ml EP管内，加入200µl PFH，在冰浴条件下将上述混合液用声振仪均质乳化3 min（功率125 W，工作时间2 s，间歇1 s）。将乳化后的IR780-CLs 溶液转移至15 ml 离心管，加入双蒸水至10 ml再放入高速离心机（8000 r/min、5 min）中洗涤3 次，弃掉离心后的上清液和未包裹的材料，得到同时包裹IR780 与PFH 的脂质体纳米粒白色沉淀，最后加入10 ml 去离子水重悬纳米粒，置于4℃冰箱保存、备用。

2.IR780-CLs 基本理化性质的检测：将制备好的IR780-CLs 用去离子水稀释后，使用透射电镜观察纳米粒的形态，Zeta 电位及粒度分析仪检测其电位和粒径。将IR780 碘化物溶解于DMSO 配置成不同浓度（1、2、5、10、20、30、40µg/ml）的混合液，使用紫外分光光度计检测其特异性吸收峰和不同浓度IR780 在特异性吸收峰下的吸光度，并绘制标准曲线计算其包封率。

3.IR780-CLs 的体外靶向性检测：将对数生长的4T1 乳腺癌细胞接种至共聚焦培养皿中培养，24 h 后加入DiI 标记的IR780-CLs，分别孵育0.5、2、4 h 后用PBS 洗涤3 次，去除多余纳米粒，并用4%多聚甲醛固定细胞，最后避光加入DAPI进行细胞核染色，使用共聚焦显微镜观察纳米粒与4T1乳腺癌细胞的结合情况。

4.IR780-CLs 的体外双模态成像：①体外超声成像。使用琼脂糖凝胶粉制作带孔的固体脂糖凝胶模型，取PBS和IR780-CLs溶液（80µg/ml）各1 ml置于琼脂糖凝胶块中，用120 W、3 s 的能量辐照，采集辐照前后的二维及超声造影图像，并用DFY 软件对回声信号的灰度变化值进行定量分析。②体外光声成像。使用琼脂糖凝胶粉制作带孔的固体脂糖凝胶模型，将IR780-CLs 配置成不同浓度（20、40、60、80 µg/ml）溶液，取上述溶液各100µl分别置于琼脂糖凝胶块中，放入光声成像系统进行光声成像，获取其光声信号值。

5.离体牛肝实验及被动空化检测：选择肝实质均匀、肝内管道较少的一整叶新鲜离体牛肝，洗净后将其置于脱气水中负压脱气50 min，切成100 mm×100 mm×50 mm块状并置于底部有透声膜的HIFU专用模具内，用注射器抽取PBS 和IR780-CLs 溶液各100µl垂直插入牛肝内（分别设为PBS 组和IR780-CLs 组），通过聚焦超声肿瘤治疗系统对牛肝内针头的位置进行准确定位，保证针头位置与HIFU 辐照焦点重合，然后推出注射器内溶液，即刻用不同能量（120 W、3 s，150 W、3 s，180 W、3 s）进行辐照，同时采用空化检测换能器检测空化信号。使用带通滤波器提取3～7 MHz 信号，并对该频带范围内的谐波信号及高次谐波附近±30 kHz的信号进行滤除，得到瞬态空化发生特征信号的宽带噪声。取宽带噪声信号幅度的均方根值（RMS）随时间变化曲线作为反映实时空化信号的指标。HIFU 辐照后，沿消融最大面切开，测量靶区凝固性坏死区体积并计算能效因子（EEF），EEF（J/mm3）=ŋPT/V，其中ŋ=0.7，为HIFU 换能器系数，V 为HIFU 辐照后靶区产生的凝固性坏死区体积，P 为辐照功率，T 为辐照时间。EEF越低，代表HIFU消融效率越高。

三、统计学处理

应用SPSS 25.0统计软件，计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、IR780-CLs的基本理化性质

成功制备的IR780-CLs外观呈绿色乳液状，透射电镜显示纳米粒呈表面光滑的球形，粒径约200～300 nm（图1），平均粒径为（246.5±12.4）nm，表面带正电荷，平均电位为（34.5±3.2）mV。紫外分光光度计检测不同浓度IR780吸收光谱，发现IR780在780 nm处出现特异性吸收峰。通过特异性吸收峰与浓度的关系，得到IR780浓度-吸光度标准曲线：Y=0.0191X+0.0439（R2=0.9909），其包封率为88%。

图1 IR780-CLs透射电镜图

二、IR780-CLs的体外靶向性检测结果

共聚焦显微镜显示DiI 标记的纳米粒呈红色荧光，DAPI 标记的细胞核呈蓝色荧光。随着孵育时间的延长，靶向至细胞周围的IR780-CLs 逐渐增多。见图2。

图2 IR780-CLs的体外靶向性检测图（标尺为100µm）

三、IR780-CLs的体外双模态成像结果

1.体外超声成像显示，IR780-CLs辐照前后二维超声回声信号的灰度变化值分别为42.09±0.35 和48.25±0.93，超声造影回声信号的灰度变化值分别为45.10±0.74 和87.30±1.76，两者辐照前后回声信号的灰度变化值较差异均有统计学意义（均P＜0.001）；而PBS 无明显变化。见图3。

图3 PBS和IR780-CLs辐照前后二维超声和超声造影图

2.体外光声成像显示，浓度为20、40、60、80µg/ml的IR780-CLs 溶液对应的光声信号值分别为0.476、0.864、1.378、1.996 a.u.。见图4。

图4 不同浓度IR780-CLs溶液的体外光声成像图

四、离体牛肝增效实验结果

HIFU 辐照后，牛肝靶区凝固性坏死区呈边界清晰、形态规则的灰白色（图5）；随辐照能量的增加，IR780-CLs 组和PBS 组牛肝凝固性坏死区体积均增加，EEF 均减小，两组比较差异均有统计学意义（均P＜0.001）。见表1。

表1 两组不同HIFU辐照能量下离体牛肝凝固性坏死区体积及EEF比较（）

表1 两组不同HIFU辐照能量下离体牛肝凝固性坏死区体积及EEF比较（）

与PBS组同一辐照能量下比较，#P＜0.001。EEF：能效因子

组别EEF（J/mm3）2.86±0.05 1.54±0.04#EEF（J/mm3）1.73±0.02 0.49±0.01#EEF（J/mm3）6.47±0.09 3.11±0.06#150 W、3 s凝固性坏死区体积（mm3）88.03±1.58 164.36±3.75#PBS组IR780-CLs组120 W、3 s凝固性坏死区体积（mm3）38.98±0.53 81.17±1.53#180 W、3 s凝固性坏死区体积（mm3）145.95±1.99 512.05±3.19#

图5 两组不同HIFU辐照能量下离体牛肝凝固性坏死区大体图

五、被动空化检测结果

被动空化检测结果显示，随着HIFU 辐照能量的增加，IR780-CLs 组和PBS 组RMS 均增加，在同一HIFU 辐照能量下，IR780-CLs 组的RMS 均高于PBS组。见图6。

图6 两组不同HIFU辐照能量下离体牛肝靶区内RMS随时间变化规律

讨论

HIFU是一种微无创治疗肿瘤的新技术，现已广泛应用于各种实体肿瘤的临床治疗［4］，但如何提高HIFU对形态不规则、边界不清晰、体积较大及血供丰富肿瘤的消融效率一直是临床亟需解决的问题［5］。纳米粒能改善肿瘤靶区的微环境，有研究［6-7］表明将其作为HIFU 增效剂能提高消融效率；孙廷宇等［8］使用脂质纳米氟碳液滴（L-PFP）协同HIFU 消融兔肝的实验研究发现，L-PFP通过增强空化效应能有效提高HIFU消融效率。但单一成像模式的纳米粒在HIFU消融肿瘤的同时不能提供全面的诊断信息，而包裹光热材料的纳米粒能在实现有效显像的同时对肿瘤进行治疗，可以极大地增强肿瘤的诊疗效果。本实验应用薄膜水化法成功制备同时包裹IR780与PFH的多功能纳米粒IR780-CLs，旨在评估其体外超声、光声双模态成像能力及其协同HIFU增效体外消融牛肝的效果，并初步探讨其增效机制。

本实验体外超声成像结果显示，IR780-CLs 辐照后二维超声及超声造影回声信号的灰度变化值均较辐照前增加，差异均有统计学意义（均P＜0.001），分析原因主要为IR780-CLs 包裹PFH，PFH 作为一种相变材料，常温下为液态，性质稳定［9］，HIFU 辐照靶区产生的热效应能激发PFH 发生液气相变产生微泡，增强靶区空化效应，从而提高HIFU消融肿瘤的效率［10］。体外光声成像实验结果显示，IR780-CLs 具有良好的光声成像能力，光声信号值随纳米粒溶液浓度增加呈线性增加。IR780是一种近红外荧光染料，除了具有良好的近红外荧光性能外，纳米粒体外靶向检测也表明IR780-CLs 能很好地与4T1 乳腺癌细胞结合。与既往研究［11-12］报道IR780具有肿瘤线粒体靶向能力，可特异性聚集于肿瘤区域的结论相符，为进一步开展体内精准诊疗提供了可行性依据。

离体牛肝实验结果表明，随辐照能量的增加，IR780-CLs 组和PBS 组靶区凝固性坏死区体积均增加，EEF 均减小，两组比较差异均有统计学意义（均P＜0.001）。分析原因为IR780-CLs 中的PFH 在HIFU辐照时发生液气相变产生微泡，明显增加了靶区空化核的数量，有效增加HIFU 辐照时的空化效应。本实验被动空化检测结果显示，在HIFU辐照过程中PBS组产生的RMS 较低，而IR780-CLs 组RMS 较高，说明空化效应在IR780-CLs 协同增效HIFU 过程中发挥了主要的作用，为体内抗肿瘤研究奠定了基础。

综上所述，本实验成功制备IR780-CLs，体外实验表明其具有良好的超声、光声双模态成像能力，并能显著提高HIFU 消融牛肝的效率，空化效应可能为其增效HIFU 的主要机制，但其在体内的效果及作用尚需今后进一步探讨。