UCH-L3通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化

胡蕾，王轶敏，张林林，李新，郭益文，丁向彬

UCH-L3通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化

胡蕾，王轶敏，张林林，李新，郭益文，丁向彬通信作者

（天津农学院 动物科学与动物医学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392）

本研究旨在探究泛素蛋白酶体系统中羧基末端水解酶L3（Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3，UCH-L3）通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的机制。使用已经建立的牛骨骼肌卫星细胞体外成肌分化模型，体外模拟骨骼肌的发育过程，采用免疫沉淀技术检测UCH-L3与RAD51是否相互作用，检测UCH-L3是否调控RAD51的泛素化水平，设计并合成RAD51的si-RNA，转染牛骨骼肌卫星细胞，筛选出有显著干扰效果的si-RNA，研究干扰RAD51后增殖和分化标志基因和表达水平变化，综合分析UCH-L3通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的机制。结果表明：过表达UCH-L3后RAD51的蛋白水平显著升高，UCH-L3可以调控RAD51的表达水平。UCH-L3与RAD51存在体内相互作用，UCH-L3可以影响RAD51的蛋白稳定性，干扰UCH-L3表达可以缩短RAD51的半衰期，UCH-L3能够调控RAD51泛素化水平，干扰RAD51后，牛骨骼肌卫星细胞增殖标志因子PAX7的蛋白水平与对照组无差异，分化标志因子MyHC的蛋白水平显著低于对照组（＜0.05），干扰RAD51表达对细胞增殖没有明显影响，但可以抑制牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化。本研究结果表明，UCH-L3可以通过影响RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化进程。

RAD51；UCH-L3；牛骨骼肌卫星细胞；增殖；成肌分化

骨骼肌中的肌卫星细胞是一种肌源性干细胞，在肌纤维受损后可增殖、分化、融合成为成熟的肌管或肌纤维来修复受损的肌细胞。真核细胞中80%以上的细胞内蛋白质降解由泛素-蛋白酶体系统完成，主要包括泛素化、蛋白酶体降解、去泛素化3个过程[1]。去泛素化是指已经泛素化的蛋白质在去泛素化酶的作用下水解泛素分子，将泛素分子从底物上水解下来，使泛素能够循环利用，一方面在底物靶蛋白降解时避免泛素链也被降解，另一方面还能阻止靶蛋白过度被降解，即实现对底物靶蛋白降解调控。羧基末端水解酶L3，（Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L3，UCH-L3）是一种去泛素化酶，属于UCHs家族，UCH-L3对肌肉发育分化具有一定调控作用，课题组前期研究中发现干扰UCH-L3表达能够抑制牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程[2]。

基因的最早研究起源于大肠杆菌，由339个氨基酸组成[3]。主要作用于DNA，它是DNA同源重组酶中最关键的酶之一，维持基因组稳定，并参与了同源重组修复过程[4]。蛋白的重组酶活性能够促进DNA双链断裂修 复[5-6]。同源重组是哺乳动物细胞DNA双链断裂修复的主要途径之一，同源重组缺陷引发基因组不稳定，导致癌症易感性。研究表明在乳腺癌等肿瘤中的表达上调，促进肿瘤细胞转移并维持恶性特征。有研究比较了23对人类乳腺癌原发性肿瘤的脑转移组织的基因表达谱，发现这类与DNA损伤修复关联的基因高表达于脑组织中[7]。有研究报道，抑制表达，c/EBPβ转录活性被抑制了，同时患有乳腺癌小鼠体内的肿瘤生长受到显著抑制作用，转移减缓[8]。在非小细胞肺癌上应用虾青素，结果表明和表达均显著下降，细胞的增殖活性显著减弱，存活率下降[9]。

有研究表明，UCHL3过度表达使乳腺癌细胞对放疗和化疗产生抗药性，而UCHL3缺失使细胞对这些治疗敏感，证明UCH-L3在癌症治疗中有着至关重要的作用，UCH-L3通过某种机制使去泛素化，同时还能促进BRCA2和紧密连接，从而调节DNA修复[10]。已有研究结果提示UCH-L3可以通过调控RAD51在肿瘤细胞中发挥作用，RAD51能够调控癌细胞增殖，而UCH-L3能够调控肌卫星细胞成肌分化，但UCH-L3是否可以通过调控RAD51发挥对肌肉发育分化调控作用还不清楚，为了进一步探究UCH-L3对牛骨骼肌卫星细胞调控作用机制，本研究研究了UCH-L3是否能够通过调节RAD51进而影响牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化过程。

1 材料

1.1 试剂

DMEM培养基，胎牛血清（FBS），马血清（HS），Opti培养基，青链霉素（Gibco）；TRIzolTMReagent，Lipofectamine 3000（Invitrogen）；山羊血清，胰蛋白酶，RIPA裂解液，电泳缓冲液，电转缓冲液，曝光液，4%多聚甲醛，DAPI，TBS和PBS（北京索莱宝公司）；Mouse Anti-MyHC Monoclonal Antibody（DSHB），Mouse Anti-GAPDH Monoclonal Antibody（北京中杉金桥公司）；Rabbit Anti-UCH- L3 Monoclonal Antibody（Cell Signaling）；逆转录试剂盒（北京康为世纪有限公司）；定量Mix（广州复能公司）；蛋白酶抑制剂混合物（SIGMA）；RAD51 Rabbit mAb（Cell Signaling）；UCH-L3和RAD51的干扰RNA（广州锐博生物科技有限公司合成）；pcDNA3.1-NC质粒（淼灵生物科技有限公司）；pcDNA3.1-UCH-L3（实验室自存）；IP试剂盒（海狸生物科技有限公司）。

1.2 仪器

CO2培养箱（Thermo-scientific）；Light Cycle 96 荧光定量PCR仪（Roche）；电泳仪（Bio-Rad）；高压灭菌锅（TOMY）；涡旋振荡器（德国艾卡公司）；电子天平（美国奥豪斯公司）；优普超纯水制造系统；恒温摇床（IKA）等。

2 方法

2.1 牛骨骼肌卫星细胞培养

原代牛骨骼肌卫星细胞为天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室分离冻存。牛骨骼肌卫星细胞培养和成肌诱导分化方法根据本实验室已建立的方法进行[11]。复苏前期实验室分离冻存的细胞，待细胞汇合度为80%时进行传代培养，用生长培养基（DMEM＋20%FBS＋1%青链霉素）进行培养，当细胞汇合度达80%后，更换为分化培养液（DMEM＋2%HS）继续培养。

2.2 牛骨骼肌卫星细胞转染

当观察到细胞汇合度达到80%时进行转染，以24孔板为例，每孔吸弃50 μL培养基，配制转染试剂，配制方法按照Lipofectamine 3000转染试剂试验方案进行，转染试剂配置好后向每个孔中添加50 μL转染试剂，并在6 h后更换增殖培养基。

2.3 RAD51 siRNA设计及干扰效果检测

根据RAD51序列设计siRNA（si-RAD51-1、si-RAD51-2、si-RAD51-3），siRNA转染接种于24孔板的牛骨骼肌卫星细胞，通过qRT-PCR技术检测转染24 h后牛肌卫星细胞中RAD51的表达量。

2.4 荧光定量PCR检测RAD51、PAX7和MyHC mRNA表达水平

荧光定量PCR体系：cDNA 2.0 μL，Forward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL，Mix 10.0 μL，RNase free water 7.0 μL。荧光定量PCR程序：预变性：95 ℃，60 s；变性：95 ℃ 10 s；退火：61℃ 20 s；延伸：72℃ 15 s；35个循环；熔解曲线：95 ℃ 10 s；65 ℃ 60 s；97 ℃ 1 s；冷却：37 ℃ 30 s。以GAPDH为内存参，通过qRT-PCR技术检测转染24 h后牛肌卫星细胞中RAD51、PAX7和MyHC mRNA的表达量。

2.5 Western blot检测RAD51、PAX7和MyHC蛋白表达水平

裂解细胞，收集蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，根据浓度将蛋白变性。SDS PAGE电泳：80 V- 30 min，120V-1 h；转膜：300 mA 1.5 h；奶粉封闭2 h后孵育一抗，4 ℃冰箱中孵育过夜；二抗孵育1 h；洗膜曝光并保存图像。

2.6 免疫沉淀检测UCH-L3与RAD51是否相互作用

贴壁细胞处理：IP专用裂解液裂解细胞，并收集蛋白；磁珠预处理：涡旋振荡磁珠，取25～50 μL的磁珠悬浮液洗涤，磁性分离，以备后用；抗体结合反应：制备抗体工作液，抗体磁珠吸附，洗涤备用；抗原沉淀反应：磁珠抗体-抗原复合物在4 ℃下反应过夜，洗涤和转移并磁性分离转移至新的1.5 mL EP管中；抗原洗脱：变性洗脱。

2.7 UCH-L3对RAD51蛋白稳定性检测

为了进一步验证UCH-L3对RAD51蛋白稳定性的影响，在牛骨骼肌卫星细胞中转染pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-UCH-L3，si-NC和si-UCH-L3，转染48 h后在相同时间点加入蛋白合成抑制剂CHX，在不同时间点（0、4、8、12 h）收集细胞，Western blot技术检测其蛋白水平变化。

2.8 统计分析

荧光定量PCR和Western blot的结果用检验分析（Prism8和Image Lab），＜0.05 表示差异显著（*表示），＜0.01表示差异极显著（**表示），N.S.表示差异不显著。

3 结果与分析

3.1 过表达UCH-L3对RAD51蛋白水平的影响

将pcDNA3.1-UCH-L3和pcDNA3.1-NC转染牛骨骼肌卫星细胞，6 h后更换一次增殖培养基并继续培养24 h，部分细胞在增殖期（GM）提取细胞蛋白和RNA；剩余细胞更换分化培养基继续培养72 h，最后提取分化期（DM3）细胞的蛋白和RNA。通过qRT-PCR和Western blot检测RAD51 RNA和蛋白水平，结果见图1。由图1可知，过表达UCH-L3后RAD51蛋白水平显著升高，说明UCH-L3可以调控RAD51的表达水平。

图1 过表达UCH-L3对牛骨骼肌卫星细胞中RAD51表达水平的影响

注：qRT-PCR检测增殖期RAD51 RNA表达水平（A）；Western blot检测增殖期RAD51蛋白表达水平（B）；qRT-PCR 检测分化期RAD51 RNA表达水平（C）；Western blot检测分化期RAD51蛋白表达水平（D）

3.2 免疫沉淀法检测UCH-L3与RAD51是否相互作用

提取牛骨骼肌卫星细胞总蛋白，用内源性UCH-L3抗体进行IP，Normal IgG作为阴性对照，结果显示UCH-L3与RAD51能够相互作用（图2A）；同时，用内源的RAD51抗体进行IP，Normal IgG作为阴性对照，同样也能检测到UCH-L3与RAD51存在体内相互作用（图2B）。

图2 免疫沉淀试验分析UCH-L3与RAD51的相互作用

3.3 UCH-L3对RAD51蛋白稳定性的影响

由图3可知，随着UCH-L3的过表达，RAD51的蛋白水平也呈现上升趋势，说明过表达UCH-L3可以延长RAD51的半衰期（图3A）。而干扰UCH- L3表达后，RAD51的蛋白水平也呈现下降趋势，说明干扰UCH-L3 表达可以缩短RAD51的半衰期（图3B）。

图3 UCH-L3对RAD51蛋白稳定性的影响

3.4 UCH-L3对RAD51泛素化水平的影响

为了进一步验证UCH-L3对RAD51蛋白泛素化水平影响。在牛骨骼肌卫星细胞中转染pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-UCH-L3，按照免疫沉淀试剂盒要求提取细胞蛋白，用内源的RAD51抗体IP，Ub抗体Western blot，结果如图4所示，过表达UCH-L3降低了RAD51的泛素化水平，说明UCH-L3能够调控RAD51泛素化水平。

图4 UCH-L3对RAD51泛素化水平的影响

3.5 RAD51 siRNA设计及干扰效果检测

由图5可知，设计的3个si-RNA均具有显著干扰效果，其中si-RAD51-2对RAD51干扰效果最明显，本研究选用si-RAD51-2进一步研究干扰RAD51表达对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。

图5 牛骨骼肌卫星细胞中RAD51干扰效果检测

注：qRT-PCR检测牛骨骼肌卫星细胞RAD51 RNA表达水平（A）；Western blot检测牛骨骼肌卫星细胞RAD51蛋白表达水平（B）

3.6 干扰RAD51对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

使用si-RAD51和si-NC分别转染接种于6孔板以及24孔板中培养的牛骨骼肌卫星细胞。转染6 h后，更换增殖培养基并培养24 h，然后提取增殖阶段的RNA和蛋白质以检测增殖标志物PAX7表达变化。结果如图6所示。干扰RAD51表达后，与对照组相比牛骨骼肌卫星细胞中PAX7蛋白表达水平无显著差异，表明干扰 RAD51表达对细胞增殖没有明显影响。

图6 qRT-PCR和Western blot检测干扰RAD51后PAX7表达水平

注：qRT-PCR检测干扰后PAX7 mRNA表达水平（A）；Western blot检测干扰后PAX7蛋白表达水平（B）

3.7 干扰RAD51对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响

为了进一步探究干扰SMAD1表达对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化产生的调控作用，使用si-NC和si-RAD51转染牛骨骼肌卫星细胞，通过qRT-PCR和Western blot检测诱导分化的标记基因表达，结果如图7所示。从图中可以看出，干扰RAD51表达后，试验组的MyHC蛋白水平显著低于对照组（＜0.05）。这部分研究的结果表明，干扰RAD51表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞成肌分化。

图7 干扰RAD51对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC的影响

注：qRT-PCR检测干扰后MyHC mRNA表达水平（A）;Western blot检测干扰后MyHC蛋白表达水平（B）

本研究发现UCH-L3可以调控RAD51的蛋白表达水平及其泛素化水平，而RAD51表达水平下调可以抑制牛骨骼肌卫星细胞成肌分化，课题组前期研究表明干扰UCH-L3表达能够抑制牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程，其可能的作用机制是，UCH-L3表达水平下调导致RAD51泛素化水平升高，使蛋白降解增加，RAD51蛋白水平下调，进而抑制了牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程（图8）。

图8 UCH-L3通过RAD51调控牛骨骼肌卫星细胞成肌分化作用机制

4 讨论

已有研究表明，RAD51在乳腺癌等恶性肿瘤中表达增加，会促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移，而抑制RAD51表达可以抑制癌细胞增殖。生物碱通过降低RAD51表达来阻止癌细胞的DNA损伤修复，从而抑制了癌细胞增殖[12]。青蒿素诱导氧化应激、DNA双链断裂和下调RAD51降低卵巢癌细胞中DNA双链断裂修复，并抑制卵巢癌细胞增殖[13]。乳腺癌细胞中microRNA 155过表达降低了RAD51的水平并增强癌细胞对电离辐射的敏感性，降低了同源重组修复的效率，抑制癌细胞增殖[14]。在体外培养的宫颈癌细胞用RI-1抑制RAD51表达，可以减弱宫颈癌细胞周期，减缓宫颈癌细胞增殖速度并抑制其生长[15]。已有研究结果提示UCH-L3可以调控RAD51在肿瘤细胞中发挥的作用[10]，RAD51能够调节癌细胞增殖，课题组前期研究发现UCH-L3能够调控肌卫星细胞成肌分化，但UCH-L3是否可以通过调控RAD51发挥对肌肉发育分化调控作用还有待研究。为了进一步探究UCH-L3对牛骨骼肌卫星细胞调控的作用机制，挖掘基因在肌肉发育分化中的可能作用，本研究首先分析了过表达UCH-L3对RAD51蛋白水平的影响，发现UCH-L3表达水平改变可以影响RAD51表达水平，然后采用免疫沉淀技术证明了UCH-L3与RAD51可以相互作用，改变UCH- L3表达水平可以改变RAD51蛋白的半衰期，UCH-L3可以调节RAD51的泛素化水平，过表达UCH-L3后RAD51的泛素化水平降低，这可能是过表达UCH-L3后RAD51蛋白表达水平显著上调的关键原因。本研究进一步设计研究si-RAD51干扰RAD51表达对牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响，发现干扰 RAD51表达对细胞增殖没有明显影响，这与RAD51在肿瘤细胞中的作用不一致，提示RAD51在肌肉发育分化中的作用途径和肿瘤中的作用途径可能还存在不同，而干扰RAD51表达可以抑制牛骨骼肌卫星细胞成肌分化。课题组前期研究表明干扰UCH-L3表达能够抑制牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程，我们推测其可能的作用机制是，UCH-L3表达水平下调导致RAD51泛素化水平升高，使蛋白降解增加，RAD51蛋白水平下调，进而抑制了牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程。

本研究基于牛肌肉卫星的体外成肌分化模型，证明了UCH-L3可以通过泛素蛋白酶体途径调节RAD51蛋白水平，进而影响牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程。研究结果可以为牛肌肉发育和肌细胞增殖分化中的泛素化调控机制研究提供一定的参考。

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UCH-L3 regulating the proliferation and differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells by influencing RAD51

Hu Lei, Wang Yimin, Zhang Linlin, Li Xin, Guo Yiwen, Ding XiangbinCorresponding Author

（Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

The purpose of this study was to explore the mechanism of carboxyl terminal hydrolase L3（UCH-L3）in ubiquitin proteasome system regulating the proliferation and myogenic differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells by affecting RAD51. Using the established in vitro myogenic differentiation model of bovine skeletal muscle satellite cells, this study simulated the development process of skeletal muscle in vitro, detected whether uch-l3 interacts with RAD51 by immunoprecipitation technology, and whether uch-l3 regulates the ubiquitination level of RAD51, designed and synthesized si-RNA of RAD51, transfected bovine skeletal muscle satellite cells, and screened si-RNA with significant interference effect, detected the changes of the expression levels of proliferation and differentiation marker genesandafter interfering with Rad51, and comprehensively analyzed the mechanism of UCH-L3 regulating the proliferation and myogenic differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells by affecting Rad51. The results showed that the protein levels of RAD51 increased significantly after over-expression of UCH-L3, and UCH-L3 could regulate the expression level of RAD51. UCH-L3 interacts with RAD51 in vivo. UCH-L3 can affect the protein stability of RAD51. Interfering with UCH-L3 expression can shorten the half-life of RAD51. UCH-L3 can regulate the ubiquitination level of RAD51. After interfering with RAD51, the protein level of Pax7, a marker of bovine skeletal muscle satellite cell proliferation, was not different from that of the control group, and the protein level of MyHC, a marker of differentiation, was significantly lower than that of the control group（＜0.05）. Interfering with the expression of RAD51 had no significant effect on cell proliferation, but could inhibit the myogenic differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells. The results showed that UCH-L3 could regulate the proliferation and myogenic differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells by affecting RAD51.

RAD51; UCH-L3; bovine skeletal muscle satellite cells; proliferation; myogenic differentiation

1008-5394（2023）02-0001-06

10.19640/j.cnki.jtau.2023.02.001

S8

A

2021-08-23

天津市自然科学基金项目（18JCYBJC29700）；国家自然科学基金项目（311772559）

胡蕾（1995—），女，硕士在读，研究方向为动物胚胎与转基因工程。E-mail：18888108159@163.com。

丁向彬（1978—），男，教授，博士，研究方向为动物细胞工程与繁育生物技术。E-mail：xiangbinding@163.com。

责任编辑：张爱婷