异氟醚通过TLR4/JNK信号通路干预心肌梗死大鼠室性心律失常的作用机制研究

樊帅帅,宋磊军,蔺 聪

心肌梗死(myocardial infarction,MI)指因冠状动脉狭窄或堵塞引起的心肌持续性缺血、缺氧性坏死[1]。心律失常及传导障碍是心肌梗死的主要病理症状,也是导致心肌梗死发病率及死亡率增加的主要因素之一[2]。减少心肌梗死诱发的心律失常,对缓解心肌梗死病死率有重要意义。异氟醚是心脏搭桥手术过程中的常用麻醉剂,研究发现异氟醚对缺血心肌组织有保护作用且能降低恶性心律失常病人的病死率[3-5]。因此,异氟醚可能为缓解心肌梗死心律失常的潜在药物,但其具体作用机制尚不明确。研究发现,多种炎性因子不仅可造成心肌细胞炎性损伤,还可影响心肌细胞动作电位的改变及传导,与心肌梗死后心律失常的发生发展密切相关[6]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)及c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路是调控炎症反应的关键通路,且参与调控心肌梗死后心肌细胞L-型钙电流、细胞过度挛缩等过程,与心律失常的发生发展密切相关[7-8]。本研究建立大鼠心肌梗死模型,从TLR4/JNK信号通路探究异氟醚影响心肌梗死大鼠心律失常的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物及细胞来源 6～7周龄无特定病原体(SPF)级SD大鼠120只,体质量180～200 g,购自甘肃中医药大学[许可证号为:SCXK(甘)2020-0001]。本实验经医院动物护理和使用委员会(IACUC)批准(编号:105062)。

1.1.2 实验试剂及仪器 异氟醚(货号:JKLN010784a,上海经科化学科技有限公司);苏木精-伊红(HE)及Masson染色试剂盒(货号:AG1120、GMS80012,上海吉至生化科技有限公司、深圳子科生物科技有限公司);四氮唑红染色法(TTC)染色试剂盒(货号:YT8005,北京伊塔生物科技有限公司);Fluo-3/AM钙荧光指示剂(货号:70-F1243,杭州联科生物技术股份有限公司);磷酸肌酸激酶(CK)试剂盒(货号:XG-E98764,上海西格生物科技有限公司);磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒(货号:GOY13667,上海谷研实业有限公司);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(货号:YS-E8189,上海研生实业有限公司);儿茶酚抑素(CST)及超敏C-反应蛋白(hs-CRP)等酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(货号:BS-E11100R1,E02680,江苏博深生物科技有限公司及上海瓦兰生物科技有限公司);TLR4、JNK2、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-β(IL-β)、核转录因子-κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)等抗体(均购自美国abcam公司,货号:ab13556,ab76125、ab183218、ab254360、ab220803、ab239882、ab181052);PowerLab数据采集系统购自澳大利亚ADInstruments公司;Langendorff心脏灌流装置购自济南千司生物技术有限公司;L-420F生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠心肌梗死模型建立及分组给药 参照文献[9]中的方法于大鼠左侧第3肋、第4肋间开胸,暴露心脏,结扎左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型,当大鼠左心室心尖变白、心电图ST段异常抬高或降低,表明造模成功。共造模成功100只大鼠,随机分为模型组、异氟醚组、ad-TLR4组、ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组,每组20只。另选取大鼠20只,只暴露心脏,分离左冠状动脉前降支但不结扎作为假手术组。所有大鼠术后连续3 d肌肉注射青霉素8×105U防止感染。参照文献[4]中的方法,异氟醚组用麻醉呼吸机于术前30 min及术后每天给予异氟醚1.0个最低肺泡气浓度(MAC)吸入(时间为30 min)进行干预处理;ad-TLR4组及ad-NC组于术前30 min及术后第3天,经尾静脉注射携带TLR4过表达序列的腺病毒载体溶液(50 μmol/L)及TLR4阴性对照序列的腺病毒载体溶液(50 μmoL/L);异氟醚+ad-TLR4组在异氟醚组基础上于术前30 min及术后第3天经尾静脉注射给予携带TLR4过表达序列的腺病毒载体溶液(50 μmoL/L);假手术组及模型组于术前30 min及术后每天,用麻醉呼吸机给予等量不含异氟醚的空气给予辅助呼吸。各组均于术后第7天给药结束进行后续试验。

1.2.2 血清学指标检测 各组大鼠于术后第7天,麻醉取腹主动脉血3 mL,用自动生化分析仪联合试剂盒法检测血清CK、CK-MB、LDH水平,按ELISA试剂盒说明书方法检测CST、hs-CRP水平。

1.2.3 心电图参数及心律失常相关指标检测 体表心电图及离体灌流监测记录心电图参数及心律失常相关指标。术后第7天,各组随机选取大鼠6只,参照文献[10]中的方法,通过Ⅱ导联体记录2 h心电图变化,并采用PowerLab数据分析系统记录和分析QT间期、QTC间期、QRS波时限变化。分离心脏、4 ℃改良台式液中去除残血,将主动脉套在Langendorff心脏灌流装置上灌流15 min(8 mL/min灌注流速,37 ℃恒温,5.86 kPa恒压,新鲜K-H液+95%氧气+二氧化碳混合气体逆行灌流),采用2个铂金电机分别连接肺动脉圆锥及心尖部,通过L-420F生物机能实验系统,观察记录分析心律失常相关指标如单相动作电位时程(APD)复极至50%(APD 50)时程、90%(APD 90)时程、APD电交替、心室有效不应期(ERP)、室性心律失常诱发率等指标变化。

1.2.4 TTC染色法检测心肌梗死面积 术后第7天,随机选取各组大鼠6只,麻醉处死,取完整心脏,按TTC染色试剂盒说明书方法进行染色后,检测心肌梗死面积(梗死部位为白色)。

1.2.5 HE及Masson染色检测心肌组织病理变化 麻醉后处死剩余大鼠,取心脏,于冰上去除大血管及周围组织,取左心室心肌组织分成3部分,一部分于液氮中冷冻后于-80 ℃冰箱保存备用;另一部分置于-80 ℃冰箱保存;剩余部分迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h,透明、浸蜡、包埋后切成5 μm切片,取部分切片按HE及Masson试剂盒说明书方法染色后,置于显微镜下观察组织病理变化。

1.2.6 免疫组化法检测左心室组织TLR4、JNK2阳性表达水平 取1.2.5剩余切片,脱蜡及抗原修复后,加入一抗抗体(TLR4、JNK2,1∶200)37 ℃孵育3 h,加入二抗抗体IgG(1∶500)室温孵育、苏木精复染后,于显微镜下观察拍照,并采用Image J软件分析单位面积内阳性表达的平均光密度值。

1.2.7 Ca2+荧光探针Fluo-3/AM法检测心肌组织细胞Ca2+浓度 取液氮中冷冻后-80 ℃冰箱保存的心肌组织标本,制成20 μm冷冻切片,按Fluo-3/AM钙荧光指示剂说明书方法染色后,用激光共聚焦显微镜在488～500 nm激发波长下,观察心肌组织Ca2+的荧光强度,采用Image-RroPlus 6.0图像处理系统,测定标本单位面积内荧光强度,以荧光强弱代表心肌组织细胞内Ca2+的水平。

1.2.8 蛋白免疫印迹法(Western Blot)法检测左心室心肌组织中TNF-α、IL-β、NF-κB、p-NF-κB、CaMKⅡ蛋白表达 取1.2.5中-80 ℃冰箱保存的左心室心肌组织,4 ℃解冻后取100 mg,加入裂解液匀浆提取蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度,取50 μg蛋白上样,行电泳、转膜反应,加入一抗TNF-α、IL-β、NF-κB、p-NF-κB、CaMKⅡ抗体(1∶800)、内参β-actin(1∶1 000)抗体,4 ℃孵育过夜,加入羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)二抗(1∶1 500),37 ℃孵育1.5 h,增强化学发光法显色后,用化学发光仪显影曝光,以Image J软件分析蛋白相对表达水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般行为变化比较 假手术组大鼠无死亡、行为活动正常。模型组、ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组大鼠均有2只死亡,且活动量减少。异氟醚组大鼠无死亡,活动量有所增加。ad-TLR4组大鼠有4只死亡,活动量及饮食进一步减少。

2.2 各组大鼠心肌梗死面积比较 与假手术组比较,模型组大鼠心肌梗死面积增加(P<0.05)。与模型组比较,异氟醚组大鼠心肌梗死面积较少(P<0.05),ad-TLR4组大鼠心肌梗死面积进一步增加(P<0.05)。与异氟醚组比较,ad-TLR4组、ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组大鼠心肌梗死面积均增加(P<0.05)。与ad-TLR4组比较,异氟醚+ad-TLR4组、ad-NC组大鼠心肌梗死面积减少(P<0.05)。详见图1、表1。

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较(±s) 单位:%

图1 大鼠心肌梗死面积TTC染色图

2.3 各组大鼠心肌损伤血清标志物水平比较 与假手术组比较,模型组大鼠CK、CK-MB、LDH水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,异氟醚组CK、CK-MB、LDH水平均降低(P<0.05);ad-TLR4组CK、CK-MB、LDH水平均进一步升高(P<0.05)。与异氟醚组比较,ad-TLR4组、ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组CK、CK-MB、LDH水平均升高(P<0.05)。与ad-TLR4组比较,异氟醚+ad-TLR4组、ad-NC组CK、CK-MB、LDH水平均降低(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心肌损伤血清标志物水平比较(±s) 单位:U/L

2.4 各组大鼠血清CST、hs-CRP水平比较 与假手术组比较,模型组大鼠血清CST、hs-CRP水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,异氟醚组大鼠血清CST、hs-CRP水平均降低(P<0.05);ad-TLR4组大鼠血清CST、hs-CRP水平均进一步升高(P<0.05)。与异氟醚组比较,ad-TLR4组、ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组CST、hs-CRP水平均升高(P<0.05)。与ad-TLR4组比较,异氟醚+ad-TLR4组、ad-NC组CST、hs-CRP水平均降低(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血清CST、hs-CRP水平比较(±s) 单位:pg/mL

2.5 各组大鼠心电图参数比较 与假手术组比较,模型组大鼠心电图参数QT间期、QTC间期、QRS波时限均延长(P<0.05)。与模型组比较,异氟醚组大鼠心电图参数QT间期、QTC间期、QRS波时限均缩短(P<0.05);ad-TLR4组大鼠心电图参数QT间期、QTC间期、QRS波时限均进一步延长(P<0.05)。与异氟醚组比较,ad-TLR4组、ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组大鼠心电图参数QT间期、QTC间期、QRS波时限均延长(P<0.05)。与ad-TLR4组比较,异氟醚+ad-TLR4组、ad-NC组大鼠心电图参数QT间期、QTC间期、QRS波时限均缩短(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠QT间期、QTC间期、QRS波时限变化比较(±s) 单位:ms

2.6 各组大鼠ERP、APD 50、APD 90、APD电交替及室性心律失常诱发率比较 与假手术组比较,模型组大鼠ERP、APD 50、APD 90、APD电交替均延长,室性心律失常诱发率升高(P<0.05)。与模型组比较,异氟醚组大鼠ERP、APD 50、APD 90、APD电交替均缩短,室性心律失常诱发率降低(P<0.05);ad-TLR4组大鼠ERP、APD 50、APD 90、APD电交替均进一步延长,室性心律失常诱发率进一步升高(P<0.05)。与异氟醚组比较,ad-TLR4组、ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组ERP、APD 50、APD 90、APD电交替均延长,室性心律失常诱发率升高(P<0.05)。与ad-TLR4组比较,异氟醚+ad-TLR4组、ad-NC组ERP、APD 50、APD 90、APD电交替均缩短,室性心律失常诱发率均降低(P<0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠ERP、APD 50、APD 90、APD电交替及室性心律失常诱发率比较(±s)

2.7 各组大鼠心肌组织病理变化比较 假手术组心肌细胞结构正常。模型组HE染色可见心肌组织细胞间隙缩小、纤维组织增生、炎性浸润明显;Masson染色可见心肌组织胶原纤维沉积严重。异氟醚组大鼠心肌内纤维组织增生、炎性浸润及胶原沉积等病理损伤缓解明显。ad-TLR4组大鼠心肌内纤维组织增生、炎性浸润及胶原沉积等病理损伤进一步加重。ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组大鼠心肌组织病理变化与模型组相近。详见图2。

图2 各组大鼠心肌HE及Masson染色图(×200)

2.8 各组大鼠心肌组织Ca2+水平、TLR4及JNK2阳性表达比较 免疫荧光显示,假手术组心肌组织细胞有少量显绿色荧光。免疫组化染色显示,TLR4及JNK2在心肌组织细胞胞浆中呈弱阳性表达。与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织细胞Ca2+水平荧光染色强度、TLR4及JNK2阳性表达均升高(P<0.05)。与模型组比较,异氟醚组大鼠Ca2+水平荧光染色强度、TLR4及JNK2阳性表达均降低(P<0.05);ad-TLR4组大鼠Ca2+水平荧光染色强度、TLR4及JNK2阳性表达均进一步升高(P<0.05)。与异氟醚组比较,ad-TLR4组、ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组大鼠心肌组织细胞Ca2+水平荧光染色强度、TLR4及JNK2阳性表达均升高(P<0.05)。与ad-TLR4组比较,异氟醚+ad-TLR4组、ad-NC组大鼠心肌组织细胞Ca2+水平荧光染色强度、TLR4及JNK2阳性表达均降低(P<0.05)。详见图3、表6。

表6 各组大鼠心肌组织Ca2+水平、TLR4及JNK2阳性表达比较(±s)

图3 各组大鼠心肌组织Ca2+荧光染色、TLR4及JNK2免疫组化染色图(×400)

2.9 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-β、NF-κB、p-NF-κB、CaMKⅡ蛋白表达比较 与假手术组比较,模型组大鼠TNF-α、IL-β、p-NF-κB/NF-κB、CaMKⅡ蛋白表达均升高(P<0.05)。与模型组比较,异氟醚组大鼠TNF-α、IL-β、p-NF-κB/NF-κB、CaMKⅡ蛋白表达降低(P<0.05);ad-TLR4组大鼠TNF-α、IL-β、p-NF-κB/NF-κB、CaMKⅡ蛋白表达均进一步升高(P<0.05)。与异氟醚组比较,ad-TLR4组、ad-NC组、异氟醚+ad-TLR4组TNF-α、IL-β、p-NF-κB/NF-κB、CaMKⅡ蛋白表达均升高(P<0.05)。与ad-TLR4组比较,异氟醚+ad-TLR4组、ad-NC组TNF-α、IL-β、p-NF-κB/NF-κB、CaMKⅡ蛋白表达均降低(P<0.05)。详见图4、表7。

表7 各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-β、p-NF-κB/NF-κB、CaMKⅡ蛋白表达比较(±s)

图4 各组心肌组织TNF-α、IL-β、p-NF-κB、NF-κB、CaMKⅡ蛋白表达条带图(A为假手术组;B为模型组;C为异氟醚组;D为ad-TLR4组;E为异氟醚+ad-TLR4组;F为ad-NC组)

3 讨 论

心肌梗死是心血管系统常见疾病,多以冠状动脉狭窄及堵塞为诱因[11]。本研究结扎大鼠左心室冠状动脉前降支,模拟人心肌梗死模型后发现,大鼠出现死亡现象,且心肌损伤标志物CK、CK-MB、LDH水平升高及心肌梗死面积增大,心肌组织炎性浸润及心肌纤维化损伤加重,提示造模成功。心肌梗死一段时间后,可引起心肌细胞电生理紊乱、代谢紊乱及心律失常的发生[12]。Wu等[13]研究表明,心律失常是心肌梗死的常见并发症,也是导致心肌梗死病人死亡率增加的关键诱因。心电图及血清学指标是临床诊断心肌梗死后心律失常的主要方法。Zang等[14]研究显示,QT间期延长可反映心室复极延缓,导致心室肌传导性和自律性改变,引起心室易损期延长,诱发各种室性心律失常,导致心源性猝死的发生,且QT间期延长与心肌梗死室性心律失常的发生密切相关。魏涧琦等[15-16]研究表明,恶性心律失常的发生随CST、hs-CRP水平的升高而升高,CST、hs-CRP可能作为心肌梗死病人心律失常的潜在生物学指标。本研究结果显示,心肌梗死大鼠心电图参数QT间期、QTC间期、QRS波时限均延长,血清CST、hs-CRP水平也异常升高,预示心肌梗死大鼠出现心律失常。异氟醚为手术中常用麻醉剂,研究证实,其对心肌缺血损伤有一定的保护作用[17]。临床研究显示,异氟醚预处理可延缓心脏手术病人QT期延长,延缓心肌梗死病人QT离散性猝死[3,5]。本研究结果显示,异氟醚预处理后,大鼠心肌梗死面积及心肌损伤程度在得到明显改善的同时,大鼠心电图参数QT间期、QTC间期、QRS波时限均缩短,血清CST、hs-CRP水平也明显降低,提示异氟醚预处理可明显缓解心肌梗死大鼠心律失常的发生。

APD电交替是恶性心律失常的决定性因素[18]。研究显示,炎性因子与心肌梗死心律失常的发生密切相关[6]。TNF-α可使动作电位滞留在平台期,使APD延长,造成传导异常及心律失常的发生[9]。Wang等[19]研究发现,心肌缺血犬左侧星状神经节内注射IL-β可降低ERP,改变复极化离散度,诱导室性心律失常的发生。Liu等[20]研究发现,降低炎性因子IL-β表达,可降低心肌细胞内Ca2+浓度,降低跨膜电位,改善心脏传导功能,降低室性心律失常的发生率。本研究发现,大鼠心肌组织中IL-β、TNF-α水平升高的同时,APD延长、ERP升高、心肌细胞内Ca2+升高,提示心肌梗死心律失常发生可能与炎性因子分泌水平升高有关。异氟醚预处理后,大鼠IL-β、TNF-α水平降低,APD缩短,ERP降低,心肌细胞内Ca2+降低,提示异氟醚降低心肌梗死大鼠心律失常的作用,可能与抑制炎性因子水平的升高有关。

TLR4及JNK通路可调控炎性因子表达,参与心肌梗死心肌损伤过程,且与心律失常的发生发展关系密切。研究表明,TLR4可与髓样分化蛋白88(MyD88)结合,激活胞内转导通路,促进NF-κB、JNK等多种转导通路表达参与细胞凋亡、炎性反应等生理过程[21]。蔡文科等[22]研究发现,心肌缺血后,心脏应激反应可激活TLR4介导NF-κB下游炎性因子如IL-β、TNF-α的释放,诱导心肌缺血的发生,且TLR4/NF-κB通路激活还可能与内源性Ca2+释放水平及心肌细胞收缩力增强、心律失常发生风险增加有关。Yan等[8]研究发现,JNK激活可硬性影响舒张期细胞内Ca2+活性,调控CaMKⅡ表达,促进心室收缩及心房颤动的发生而加重心律失常发生的风险。本研究结果显示,IL-β、TNF-α水平及Ca2+升高的同时,TLR4、JNK在心肌细胞胞浆中表达显著升高,其下游调控因子p-NF-κB、CaMKⅡ表达也显著升高,进一步上调TLR4表达后,心肌梗死大鼠死亡、心肌梗死面积及与心律失常有关的心电图指标及血清学指标均进一步升高,APD、ERP升高、心肌细胞内Ca2+等均进一步升高,提示上调TLR4可促进心肌梗死大鼠心肌损伤及心律失常的发生。异氟醚组大鼠出现TLR4、JNK、p-NF-κ-B、CaMKⅡ通路蛋白表达降低,提示异氟醚降低心肌梗死大鼠心律失常作用,可能与抑制TLR4/JNK通路激活有关。另外,异氟醚组大鼠心肌梗死面积、死亡及心肌损伤程度,心肌组织中IL-β、TNF-α水平以及APD、ERP和心肌细胞内Ca2+水平较ad-TLR4组和ad-NC组低,且上调TLR4可逆转异氟醚的上述作用。

综上所述,异氟醚可能通过抑制TLR4/JNK通路激活,降低炎症水平及细胞内Ca2+释放水平,减少心律失常的发生并缓解心肌梗死大鼠心肌损伤。但心律失常相关机制复杂,涉及多条通路、多个细胞因子共同调节,异氟醚降低心肌梗死大鼠心律失常作用的还需继续深入研究。