低强度耳屏迷走神经刺激通过减轻心房内质网应激缓解长程起搏诱导的心房颤动

韩亚凡 汤宝鹏 王菲菲 孙华鑫 李瑶 桑婉玥 王璐 杨杭 周贤惠 芦颜美 张玲 李耀东

(1.新疆医科大学第一附属医院心脏中心起搏电生理科 新疆心电生理与心脏重塑重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830054;2.成都市第四人民医院心身医学中心,四川 成都 610000)

心房颤动(atrial fibrillation, Af)作为临床中最常见的快速室上性心律失常,可导致心力衰竭或体循环栓塞等多种并发症,具有较高的死亡率[1-2]。既往研究[3-5]表明,氧化应激、钙超载和自主神经紊乱等均与Af密切相关,可导致心房肌结构重构和电重构,对Af的发生和发展具有重要的维持作用。内质网作为调节蛋白质稳态和维持细胞正常功能的细胞器,参与钙稳态、蛋白质合成与折叠等多种细胞过程[6]。由于炎症、氧化应激和缺血等内在或外在因素致使内质网稳态失衡,诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[7-8],长期或过度的ERS将促进CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP) 和胱天蛋白酶-12等促凋亡因子激活,诱导细胞凋亡,参与Af和室性心动过速等多种心律失常疾病的进展[9-11]。本课题组前期研究证实,低强度耳屏迷走神经刺激(transcutaneous auricular vagal nerve stimulation, ta-VNS)具有增加心室电稳定性并减轻心室间质纤维化的作用[12];亦可通过平衡胸腔内自主神经活动,减少心脏交感神经过度支配,发挥抗室性心律失常作用[13];课题组近期研究并报道了ta-VNS对阻塞性睡眠呼吸暂停所导致的Af也具有显著的保护作用,其机制为ta-VNS通过改善交感神经兴奋和心房肌细胞凋亡等降低Af易感性[14]。然而ta-VNS对长程起搏介导的Af中ERS的调节作用及潜在机制并无研究报道。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

本研究遵从《美国国立卫生研究院实验动物研究指南》,并得到新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会审批通过(批号:IACUC201902-K05)。由新疆医科大学动物实验中心提供18只健康Beagle犬,年龄3～5岁,体重8～10 kg,采用随机数字法分为3组(每组6只):假手术组、Af组和Af+ta-VNS组。所有犬植入起搏器,其中假手术组不起搏,Af组与Af+ta-VNS组起搏频率设为600次/min,持续4周。Af+ta-VNS组于4周后给予ta-VNS直至8周末,其余分组给予假刺激。参照课题组前期研究[12-14],刺激脉宽0.1 ms,频率20 Hz,引起窦性心率下降20%或房室传导减慢20%的最低电压值定义为阈值电压,其阈值电压的一半设为低强度刺激电压,刺激频率为隔天1次,每次2 h,两耳交替,且每次刺激前重新校正阈值电压。

1.2 材料与试剂

LEAD-7000多通道电生理记录仪(锦江电子,中国),呼吸麻醉机(广州柯之蓝仪器有限公司,中国),起搏器(恩识医疗科技(上海)有限公司,中国),多集电极(美敦力,美国),KZ-Ⅲ 研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司,中国),e-BLOT电子压片成像仪(易孛特光电技术(上海)有限公司,中国)。TUNEL检测试剂盒(MK1025,博士德生物工程(武汉)有限公司);犬乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)试剂盒(JL48115,上海江莱生物科技有限公司)。一抗:抗葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)抗体(稀释1：500,ab109659,Abcam),抗蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)抗体(1：1 000,3192S,CST),抗磷酸化PERK(p-PERK)抗体(1：1 000,3179S,CST),抗真核翻译起始因子2亚基α(eIF2α)抗体(1：1 000,NBP2-02669,Novus Biologicals),抗磷酸化的eIF2α(p-eIF2α)抗体(1：1 000,NBP2-67353,Novus Biologicals),抗转录激活因子4(activating transcription factor,ATF4)抗体(1：500,bs-1531R,Bioss),抗CHOP抗体(1：1 000,bs-20669R,Bioss)。抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体(1：10 000,ab8245,Abcam)。二抗:山羊抗兔抗体(1：10 000,ZB-2301,中杉金桥)及山羊抗鼠抗体(1：10 000,ZB-2305,中杉金桥)。

1.3 神经递质浓度测定

按时抽取实验犬静脉血3～5 mL,置于肝素抗凝管中离心并收集上清液,使用高效液相色谱仪检测血液样本中肾上腺素(epinephrine,E)及去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)等儿茶酚胺类物质浓度;ELISA试剂盒检测ACh神经递质浓度,操作过程严格遵守仪器使用规范及试剂盒说明书进行。

1.4 在体电生理检测

实验犬静脉麻醉后,取仰卧位穿刺右侧股静脉,将电极导管插入右心房,并使用LEAD-7000电生理仪检测心房有效不应期(atrial effective refractory period,AERP)、Af易损窗(window of vulnerability,WOV)、Af诱发率及Af持续时间等电生理参数。AERP的测定通过高于基础心率20%频率起搏的S1S1刺激诱导,S1S2间期从160 ms以10 ms逐次递减,直至达到不能被夺获的最长S1S2间期。其在AERP测试中,诱发出Af最长和最短的S1S2间期之差称为WOV。Af诱发率定义为短阵快速脉冲刺激(burst刺激)10次(S1S1=50 ms,持续10 s)出现Af的百分比。Af定义为不规则心房率≥500次/min且不规则房室传导持续时间≥5 s。Af从起搏诱发到自行终止之间的时间称为Af持续时间。

1.5 超声心动图评估

实验员将犬安抚后,胸前区备皮并右侧卧位。由同一位超声专科医师使用超声仪(HD11XE,美国飞利浦股份有限公司)于基线期、4周末、8周末测量左/右心房最大内径、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)及心率,连续测量3次取平均值。

1.6 心肌细胞凋亡检测

采用TUNEL凋亡试剂盒对石蜡切片的心房组织检测细胞凋亡,操作过程严格遵守说明书步骤。于显微镜下观察凋亡细胞呈棕色,正常细胞核呈蓝色。细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.7 ERS相关蛋白检测

取各组心房组织50 mg,加入高效放射免疫沉淀分析裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制剂,使用研磨仪匀浆后冰上静置30 min离心,提取上清并常规使用二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取适量蛋白上清加入上样缓冲液煮沸10 min备用,常规电泳并转至聚偏二氟乙烯膜,5%牛血清白蛋白封闭液室温封闭1 h,加入一抗并4 ℃孵育过夜,三乙醇胺缓冲盐水溶液+吐温20洗涤后加入二抗室温孵育1 h,使用超敏显色液在电子压片成像仪下显影条带,Image J软件分析并计算目的蛋白灰度值,最终以目的蛋白与GAPDH的灰度比值作为相应目的蛋白的表达水平。

1.8 统计分析

使用SPSS 26.0分析数据。计量资料呈正态分布的以均数±标准差表示,两组间采用t检验比较,多组间采用单因素方差分析比较,对总体有差异的采用Bonferroni两两比较。计数资料以频数和百分比(%)表示,多组间比较采用克鲁斯卡尔-沃利斯检验,并使用Bonferroni校正P值。所有统计分析基于双侧假设检验,P<0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 血清神经递质浓度

4周末,Af组及Af+ta-VNS组的E、NE水平与同组基线期及假手术同时期相比增高,ACh水平降低(P<0.05);但Af组E、NE及ACh水平与Af+ta-VNS组相比无差异(P>0.05)。8周末,Af+ta-VNS组E、NE水平与同组4周末及Af组同时期相比下降,ACh水平升高(P<0.05),但未回落至正常水平,与同组基线期或假手术组同时期相比仍具有统计学差异(P<0.05)(见表1)。

表1 三组不同时间胆碱类和儿茶酚胺类浓度及超声指标

注：a表示与同组基线期对比,P<0.05;b表示与同组4周末对比,P<0.05;c表示与假手术组同时期对比,P<0.05。

2.2 在体电生理检测

8周末,与假手术组相比,Af组AERP缩短,而WOV和Af持续时间延长,Af诱发率增高[AERP: (83.33±5.16)ms vs(133.33±10.33)ms,t=-10.607,P<0.001;WOV:(56.67±8.16)ms vs (8.33±7.53)ms,t=10.661,P<0.001;Af持续时间:(11.83±2.48)s vs (2.75±0.37)s,t=8.857,P<0.001;Af诱发率:(88.33±9.83)% vs (8.33±7.53)%,t=15.825,P<0.001];而与Af组相比,8周末Af+ta-VNS组AERP延长,而WOV和Af持续时间缩短,Af诱发率降低[AERP:(123.33±10.33)ms vs (83.33±5.16)ms,t=8.485,P<0.001;WOV:(40.00±6.32)ms vs (56.67±8.16)ms,t=-3.953,P=0.003;Af持续时间:(5.00±0.74)s vs (11.83±2.48)s,t=-6.461,P<0.001;Af诱发率:(43.33±8.16)% vs (88.33±9.83)%,t=-8.625,P<0.001](图1)。

注:A图和B图为AERP和WOV的变化,C图和D图为burst刺激10次后平均Af持续时间及Af诱发率,E图为在体电生理图。表示与假手术组相比,P<0.05;表示与Af组相比,P<0.05。

2.3 超声心动图评估

4周末,Af组和Af+ta-VNS组的LVEF水平与同组基线期及假手术组同时期相比较低,而左心房和右心房内径扩大且心率加快(P<0.05)。8周末,Af+ta-VNS组LVEF值与同组4周末及Af组同时期相比升高,左/右心房内径缩小且心率下降(P<0.05)。而8周末LVEF、左/右心房内径及心率回落至正常水平,与同组基线期及假手术组同时期相比无统计学差异(P>0.05)。同时,值得注意的是,LVEF与神经递质E、NE水平呈负相关,与ACh水平呈正相关;而左心房、右心房内径及心率变化与神经递质E、NE水平呈正相关,与ACh水平呈负相关。见表1。

2.4 TUNEL染色及ERS相关蛋白检测

TUNEL染色发现Af组的心肌凋亡指数较高,Af+ta-VNS组心肌细胞凋亡减少(P<0.05)。Af组GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP等ERS相关蛋白表达水平与假手术组相比明显增加(P<0.05);而Af+ta-VNS组抑制了Af介导的ERS相关蛋白的表达水平,与Af组相比具有统计学差异(P<0.05)(图2和图3)。

注:A图为三组ERS标志物免疫印迹结果,每组6只犬;B～F图为定量分析GRP78、ATF4、CHOP蛋白水平以及p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值。表示与假手术组相比,P<0.05;表示与Af组相比,P<0.05。

注:A、B、C图为三组左心房组织TUNEL染色,每组6只犬,蓝色为细胞核,棕黄色代表TUNEL染色阳性(40倍放大,比例尺=20 μm);D图为TUNEL染色细胞凋亡率的定量分析。表示与假手术组相比,P<0.05;表示与Af组相比,P<0.05。

3 讨论

本研究首次将ta-VNS缓解长程起搏诱导Af犬模型的有益作用与心房ERS的潜在作用联系起来。其研究主要发现:(1)ta-VNS可提高血清ACh浓度,降低血清E及NE浓度;(2)ta-VNS可降低Af犬心房电重构和结构重构;(3)ta-VNS可降低GRP78和PERK通路蛋白表达水平、心房组织内凋亡因子CHOP的表达以及心肌细胞凋亡率。

心脏交感神经活性增加导致心肌细胞长期暴露于E及NE中,继而通过β-肾上腺素受体信号通路激活ERS,诱导心肌细胞凋亡,维持Af的发生和发展[15]。同时,Mottillo等[16]的研究也表明,交感神经递质可激活β3-肾上腺素受体,引起GRP78和CHOP的表达升高,应用β-肾上腺素受体拮抗剂后可有效逆转儿茶酚胺对ERS的影响[17-18]。因此,交感神经递质和β-肾上腺素受体在ERS诱导心肌细胞凋亡的过程中发挥重要作用[15]。本研究结果显示ta-VNS可有效减轻Af犬模型的心房电重构和结构重构,与既往研究报道一致[19];同时,笔者观察到ta-VNS可降低血清E及NE浓度,降低心房ERS标志蛋白GRP78表达水平和PERK等ERS信号通路的蛋白表达水平,阻滞心房组织CHOP的表达,降低心肌细胞凋亡率。故笔者推测ta-VNS具有提升迷走神经活性而抑制交感神经活性的作用,通过减少心脏神经再生从而削弱Af的神经基础,发挥抗ERS及抗心肌细胞凋亡等作用,限制Af底物的形成[20-21]。

就临床转化而言,ta-VNS对Af的防治作用一直是讨论的热点话题。目前临床研究已证实ta-VNS除可降低心脏术后患者Af的发生率[22]外,对于患有阻塞性睡眠呼吸暂停合并Af、高血压合并Af等疾病的患者均具有良好的治疗效果[21,23]。然而,Kulkarni等[24]和Stavrakis等[25]的研究得出不同的结论,他们的研究表明单纯ta-VNS只能减少Af负荷,并不能改善Af的复发或终止。即便如此,笔者的大动物研究发现,ta-VNS可通过缓解ERS发挥抗心脏重构作用,提示ta-VNS仍具有一定的抗心律失常效果。

不足之处,本研究的刺激参数均参照既往研究中所报道的刺激方案进行,未进行不同刺激电压下的疗效对比,故未得出大动物最优的刺激参数;此外,ta-VNS调控ERS的具体分子机制未深入研究,未来需进一步探索。

综上所述,ta-VNS减轻长程起搏诱导的Af模型犬的机制可能与抑制心房ERS及细胞凋亡有关。其抗心律失常的效应为Af的防治提供了新思路。

利益冲突所有作者均声明无利益冲突