基于外泌体miR-30转运探讨益肾解毒法对尿毒症小鼠心肌自噬的作用

童梦瑶， 江坚青， 罗富里， 晏子友

（1.江西中医药大学第二附属医院呼吸科，江西南昌 330006；2.江西中医药大学附属医院肾病科，江西南昌 330006）

尿毒症心肌病（uremic cardiomyopathy，UCM）是慢性肾功能衰竭的主要并发症，以心脏肥大、纤维化、炎症和代谢重塑为特征，约占慢性肾病死亡人数的50%[1]。尽管包括代谢性酸中毒、炎症、氧化应激增加和胰岛素抵抗在内的许多因素可能导致UCM 的发展[2]，但确切的机制仍然未知。自噬是一种高度保守的机制，通过这种机制，真核细胞将潜在危险的细胞质物质输送到溶酶体进行降解，最终实现物质循环[3]。最新研究[4]表明，自噬在心脏内稳态和功能中发挥重要作用，大多数报告支持自噬活性缺陷导致心衰的进展。然而，UCM 是否涉及自噬过程以及相关潜在机制尚未阐明。 哺乳动物细胞产生的微小RNAs（microRNAs，miRNAs，miRs）不仅调节基因表达，而且影响邻近细胞甚至其他远处器官中的细胞[5]。外泌体（exosome，Exos）来源于细胞内溶酶体微粒形成的多囊泡，携带各种信号分子从大多数细胞类型的表面膜穿梭[6]。越来越多的证据表明，Exos 在细胞内通讯和物质运输中起着至关重要的作用[7]。Exos 可以携带miRs 并将其释放到附近的细胞中。Exos中许多miRs介导心肌细胞损伤和心脏修复过程。研究[8]发现，miR-30可以靶向调控Beclin1基因，影响Beclin1-PI3KC3复合体的形成，进而促进细胞自噬，参与缺氧、糖尿病诱导的心肌病的进展。由于Exos 中的miRs 在心肌细胞通讯中至关重要的作用，因此成为药物治疗的靶点潜在。然而，很少有研究评价Exos的miRs在UCM中的作用。

临床上，UCM 的胸闷、气促、心悸、怔忡、水肿等症状主要与中医“心肾不交”证有关[9]。因此，益肾解毒法通过益肾助阳、泄浊解毒，被广泛应用于心肾不交证的防治。课题组前期临床研究[10]结果表明，益肾解毒法可有效保护慢性肾病患者的肾功能，减轻或延缓心血管疾病的发生与发展。可见益肾解毒法有助于改善UCM，但其保护机制尚不清楚。因此，本研究假设益肾解毒法通过干预外周血Exos 中miR-30 转运调控心肌自噬，通过体内以及体外实验探讨益肾解毒法对UCM 自噬的影响及对Exos 中miR-30 转运的调控作用，以期为UCM 临床管理的中医治疗策略提供新见解。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验药物益肾解毒法中药复方（YSJD），由生黄芪30 g、生地10 g、党参15 g、山萸肉10 g、淮山药15 g、丹参20 g、泽泻10 g、土茯苓20 g、白花蛇舌草20 g、六月雪20 g、生大黄10 g（后下）、淫羊藿15 g等共12味中药组成，所有中药材均由江西中医药大学中药饮片厂杨明教授鉴定后提供。常规方法水煎，浓缩成每毫升含生药2.00 g（含相当成人剂量/kg 的10 倍，给药均按照沈映君教授主编的《中药药理学》中药实验用药选择换算小鼠用药剂量，10 倍于临床用药剂量折算为等效剂量），真空密封包装，每袋150 mL，4 ℃冰箱保存。由江西中医药大学附属医院药剂科制备。

1.2 试剂乳酸脱氢酶（LDH）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）ELISA 试剂盒（英国Abcam 公司）；ExoQuick-TC 试剂（美国Biomars 公司）；2，3-丁二酮一肟（BDM，美国Sigma-Aldrich 公司）；消化培养基（瑞士Roche公司）；Lipofectamine 2000（美国Invitrogen 公司）；pcDNA 载体、miR-30 过表达质粒（上海GenePharma 公司）；荧光染料PKH67（美国Sigma-Aldrich 公司）；4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美国Invitrogen 公司）；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（英国Abcam 公司）；mirVana miRNA 分离试剂盒、TaqMan miRNA 逆转录试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； LC3 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）；Alexa Fluor 594 偶联的山羊抗兔IgG 二抗（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；二喹啉甲酸（BCA）试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；抗CD9 抗体、抗CD63 抗体、抗TSG101 抗体、抗LC3 抗体、抗Beclin1 抗体、抗p62 抗体、抗β-肌动蛋白抗体、HRP 偶联的山羊抗小鼠IgG 二抗、山羊抗兔IgG 二抗（美国Cell Signaling Technology公司）。

1.3 仪器Vevo 3100 超声系统（日本Fujifilm VisualSonics 公司）；光学显微镜（日本Nikon 公司）；Amicon Ultra-15 离心超滤装置（美国Millipore公司）；电子显微镜（美国Electron Microscopy Sciences 公司）；H7500 透射电子显微镜（TEM，日本Hitachi 公司）；IX73 倒置荧光显微镜（日本Olympus 公司）；共聚焦显微镜（德国Leica 公司）；ABI 7900HT Fast 实时荧光定量PCR 系统（美国Applied Biosystems 公司）；ChemiDoc MP 成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.4 体内实验

1.4.1 动物 24 只SPF 级6 ～8 周龄雄性C57BL/6J小鼠，体质量22 ～25 g，购自江西中医药大学动物实验中心，动物使用合格证号：SYXK（赣）2018-0085。

1.4.2 分组、造模与给药 将小鼠随机分为3组：Sham 组（假手术组）、UCM 组和UCM+YSJD 组。给予小鼠戊巴比妥麻醉，采用两步法、5/6 肾切除术建立UCM 模型。在第1 周，切除2/3 左肾。经过1 周的恢复，切除右肾。第2 次手术后，所有小鼠给予喂食1%的盐水。将血尿素氮水平超过35.60 mmol/L 的小鼠确定为尿毒症。Sham 组仅与模型组同期进行2次手术，但不切除肾脏。手术后第3 天，UCM+YSJD 组小鼠按0.8 g/mL YSJD 浓缩剂给药，即给药剂量为8.0 g·kg-1·d-1灌胃，Sham组和UCM 组小鼠给予等体积生理盐水灌胃。治疗3 周后，通过超声系统评估每组小鼠的心脏功能。在评估结束时，用戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，收集血液和心脏组织用于后续研究。

1.4.3 超声心动图检查 应用Vevo 3100 超声系统进行超声心动图检查，使用30 MHz 线性阵列超声换能器。以1.5%异氟醚麻醉后，小鼠接受二维超声分析。M模式录像用于测量以下心脏结构：射血分数（EF%）、缩短分数（FS%）、收缩期左室后壁厚度（LVPWs）、舒张期左室后壁厚度（LVPWd）。

1.4.4 组织学分析 心脏组织采用4%多聚甲醛溶液固定，进行石蜡包埋，制作5 μm 切片。采用苏木素-伊红（HE）染色法观察心脏组织病理学形态；采用Masson 三相染色法评估心脏纤维化含量。光学显微镜（放大200倍）下观察染色图像。

1.4.5 酶活性测定 使用ELISA 试剂盒检测血清LDH、CK-MB酶活性。

1.4.6 免疫组织化学法检测心脏组织LC3 表达将脱腊、水化、灭活、封闭后的心脏组织载玻片样品与LC3 抗体（1∶100）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，用二氨基联苯胺（DAB）染色和苏木素复染。然后将载玻片样品进行梯度乙醇脱水和二甲苯透明，并用中性树脂盖玻片封固，在光学显微镜下观察图像。LC3抗体阳性表达位于细胞浆。

1.4.7 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡 心脏组织石蜡切片用二甲苯脱蜡10 min。滴加1%蛋白酶K，加入增强型过氧化物酶封闭缓冲液后，将标本在室温下孵育25 min。TBS 冲洗后，样品用3% H2O2淬灭5 min。将淬灭的样品用TdT 平衡缓冲液平衡30 min，与TdT 标记反应混合物在37 ℃下孵育1.5 h。加入终止溶液并与细胞一起孵育5 min。冲洗和封闭后，将样品在室温下浸入1 × 偶联物中30 min，用DAB溶液覆盖样品15 min。洗涤后，样品用甲基绿复染液染色3 min。最后，染色的细胞样品再次在乙醇和二甲苯中脱水，应用IX73 倒置荧光显微镜捕获图像。1.4.8 透射电子显微镜（TEM）观察 取心脏组织，经戊二醛、锇酸固定，常规丙酮脱水、树脂包埋，超薄切片，3%醋酸铀、柠檬酸铅双染色，将制备好的样品用H7500 透射电镜观察心肌超微结构。并应用ImageJ 软件量化自噬囊泡占据的细胞面积。

1.5 体外实验

他一动不动地仰面躺着，现在，他能够听到病狼一呼一吸地喘着气，慢慢地向他逼近。它愈来愈近，总是在向他逼近，好像经过了无穷的时间，但是他始终不动。它已经到了他耳边。那条粗糙的干舌头正像砂纸一样地磨擦着他的两腮。他那两只手一下子伸了出来——或者，至少也是他凭着毅力要它们伸出来的。他的指头弯得像鹰爪一样，可是抓了个空。敏捷和准确是需要力气的，他没有这种力气。

1.5.1 小鼠外周血Exos 的分离和鉴定 将各组小鼠外周血以1 680 ×g离心10 min 后吸出上层血清成分，将血清3 000×g离心15 min以除去其中的细胞碎片以及血小板，在离心超滤装置中以5 000×g离心30 min，将样品与ExoQuick-TC 试剂混合，孵育过夜，然后于4 ℃1 500 ×g离心30 min，取沉淀并重悬于磷酸盐缓冲（PBS）溶液中，储存在-80 ℃。采用Western Blot 法检测特定的Exos 表面标志物（CD9、CD63、TSG101）。对于形态学分析，将获得的沉淀物洗涤并重悬于0.2%多聚甲醛中，取3 μL 重悬的沉淀物放置在Formvar-碳涂层的镍电子显微镜格栅上，并在室温下孵育5 min。用1.75%乙酸铀酰染色，PBS 洗涤格栅，并使其在室温下半干燥，然后在透射电子显微镜下观察Exos。

1.5.2 小鼠原代心肌细胞的分离培养及分组 在戊巴比妥注射麻醉前30 min，C57/BL6 小鼠预先注射肝素（1 000 μL/kg 体质量）。打开胸腔快速解剖心脏，将其转移到冰上。去除肺组织和大血管后，用含有20 mmol/L BDM 的PBS 清洗心脏以去除血液；再将心脏浸入24 孔板中的500 μL 隔离培养基中，用弯剪刀切成小块（约1 mm3），把心脏组织收集在装有10 mL 冷分离培养基的15 mL 管中，4 ℃轻轻搅拌过夜。第2 天，去除大部分上清液并加入5 mL 消化培养基，在37 ℃温和搅拌下消化心脏组织碎片30 min，以300 r/min（离心半径7 cm）离心5 min。吸出上清液后，将细胞沉淀重新悬浮在铺板培养基（L-15 培养基中添加20 mmol/L BDM）中，培养3 h，去除成纤维细胞和附着在培养皿上的内皮细胞。收集上清液中未贴壁的心肌细胞、计数，并以2.0×105个/cm2重新接种到胶原涂层培养皿中。

心肌细胞以4×104个/孔接种于96 孔板，分成Sham-Exos 组、UCM-Exos 组、UCM+YSJD-Exos组、UCM+YSJD-Exos+pcDNA 组和UCM+YSJDExos+miR-30 组，每组设3 个平行复孔。Sham-Exos 组、UCM-Exos 组、UCM+YSJD-Exos 组分别用从动物实验中Sham 组、UCM 组和UCM+YSJD 组小鼠外周血中分离得到的含50%Exos 培养液处理48 h。UCM+YSJD-Exos+pcDNA 组和UCM+YSJDExos+miR-30 组心肌细胞分别使用Lipofectamine 2000将pcDNA 载体或miR-30过表达质粒转染细胞24 h，然后用从UCM+YSJD 组小鼠外周血中分离得到的含50%Exos培养液处理48 h。

1.5.3 Exos 进入小鼠原代心肌细胞的内在化 用绿色荧光染料PKH67 标记纯化的Exos。将小鼠原代心肌细胞接种到8孔室载玻片，8×103个细胞/孔，与5 μL PKH67 孵育24 h 以允许Exos 内化。将小鼠原代心肌细胞用DAPI 染色5 min 以显示细胞核。使用共聚焦显微镜捕获图像。

1.5.4 TUNEL 法检测心肌细胞凋亡 心肌细胞在二甲苯和乙醇梯度中脱水，1%蛋白酶K 中透化20 min后，其他步骤同组织检测。

1.5.5 免疫荧光染色法检测心肌细胞LC3 表达取在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上培养的细胞，于室温下用4%多聚甲醛固定15 min。洗涤后，细胞在室温下用0.1%Triton X-100透化15 min。将细胞用2% BSA 封闭30 min，用兔抗人LC3 抗体（1∶200）4 ℃孵育6 h。PBS 洗涤后，用Alexa Fluor 594偶联的山羊抗兔IgG（1∶200）4 ℃孵育细胞1 h。应用100 μg/mL DAPI 与细胞在室温下孵育15 min 以显示细胞核。洗涤后，将细胞置于IX73 倒置荧光显微镜进行成像。应用ImageJ软件量化细胞中LC3斑点。

1.5.6 RT-qPCR 法分析Exos 中miR-30 水平 通过mirVana miRNA 分离试剂盒从Exos 中提取总RNA。使用TaqMan miRNA 逆转录试剂盒对分离的RNA 进行逆转录。在ABI 7900HT Fast 实时荧光定量PCR 系统中使用SYBR 试剂盒进行实时PCR。反应条件：95 ℃扩增5 min；95 ℃10 s、55.7 ℃30 s，40个循环。miR-30和U6的引物由上海GenePharma公司合成。miR-30 正向引物序列为5’-GGCCCAA CACTTCCCTCAAA-3’，反向引物序列为5’-GGA CACAATGGATTGCAAGG-3’；U6 正向引物序列为5’-CAGGGAGAAACGACCTGGAG-3’，反向引物序列为5’-TAACCACTGCTCCACTCTGG-3’。通过2-ΔΔCt方法计算靶基因的相对表达。U6为内参基因。

1.6 统计方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，所有结果代表3 个独立实验中产生的数据，以均数±标准差（±s）表示。采用未配对的双尾学生t检验比较2 组之间的差异，采用单向方差分析和Tukey’s 事后检验进行多重比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益肾解毒法改善UCM小鼠的心脏功能障碍与Sham 组比较，UCM 组小鼠在实验结束时存在严重的心脏功能障碍，包括EF%和FS%的急剧下降（P＜0.05），以及LVPWd 显著增加（P＜0.05）。与UCM 组比较，UCM+YSJD 组EF%和FS%上升（P＜0.05）、LVPWd显著减小（P＜0.05）。表明益肾解毒法可明显改善UCM 诱导的心脏功能障碍。结果见表1。

表1 动物实验结束时各组小鼠经胸超声心动图检查结果Table 1 Transthoracic echocardiographic findings in each group of mice at the end of the animal experiment（±s）

表1 动物实验结束时各组小鼠经胸超声心动图检查结果Table 1 Transthoracic echocardiographic findings in each group of mice at the end of the animal experiment（±s）

注：Sham组为假手术组，UCM组为尿毒症心肌病组，UCM+YSJD组为尿毒症心肌病+益肾解毒法中药复方组，下同。①P＜0.05，与Sham组比较；②P＜0.05，与UCM组比较

?

HE 染色结果显示，与Sham 组比较，UCM 组小鼠表现出严重的心肌纹理和纤维排列紊乱，心肌丝破裂和炎症细胞浸润。同时，Masson 三相染色结果显示，UCM 组小鼠胶原沉积较Sham 组显著增加。超声心动图显示，UCM 组小鼠左心室质量和心脏质量/体质量比值较Sham 组增加（P＜0.05），表明UCM 存在心脏肥大。此外，UCM 组小鼠血清CK-MB 和LDH 含量较Sham 组显著增加（P＜0.05 或P＜0.001），表明UCM 存在心脏损伤。而与UCM 组比较，UCM+YSJD 组上述指标均得到逆转（P＜0.05 或P＜0.001），表明益肾解毒法治疗可明显改善UCM 诱导的心脏形态变化和重塑，并可降低血清CK-MB和LDH水平。见表1、图1。

图1 益肾解毒法中药复方（YSJD）对尿毒症心肌病（UCM）小鼠心功能不全、心脏病理改变及重构的影响Figure 1 Effect of Yishen Jiedu Chinese herbal compound（YSJD）on cardiac insufficiency，cardiac pathological changes and remodeling in mice with uremic cardiomyopathy（UCM）

2.2 益肾解毒法通过抑制心肌细胞的自噬和凋亡减轻UCM诱导的心肌损伤TUNEL 法测定结果显示：与Sham 组比较，UCM 组心肌细胞凋亡率升高（P＜0.001）；与UCM 组比较，UCM+YSJD 组心肌细胞凋亡率降低（P＜0.01）。表明益肾解毒法有效地抑制了UCM 小鼠心肌细胞凋亡。见图2-A。此外，TEM 成像可见，UCM 组出现明显的心肌空泡化，而YSJD 组心肌空泡化较UCM 组减轻。表明益肾解毒法治疗可显著改善UCM 小鼠心肌空泡化损伤。见图2-B。使用TEM 数据量化自噬囊泡占据的细胞面积，结果显示，UCM 组自噬囊泡占据的细胞面积较Sham 组增加（P＜0.001），UCM+YSJD组自噬囊泡占据的细胞面积较UCM 组减小（P＜0.001）。表明UCM 诱导了自噬囊泡形成的有效上调，并被益肾解毒法治疗抑制。见图2-C。免疫组织化学结果显示：与Sham 组比较，UCM 组小鼠心肌组织中自噬标记蛋白LC3 表达升高（P＜0.005）；与UCM 组比较，UCM+YSJD 组LC3 表达降低（P＜0.001）。表明UCM 诱导了心肌组织中自噬标记蛋白LC3 的表达，并被益肾解毒法治疗抑制，证实了上述结果。见图2-D。

图2 益肾解毒法中药复方（YSJD）通过抑制心肌细胞的自噬和凋亡减轻尿毒症心肌病（UCM）诱导的心肌损伤Figure 2 Yishen Jiedu Chinese herbal compound（YSJD）reduces uremic cardiomyopathy（UCM）-induced myocardial injury by inhibiting autophagy and apoptosis of cardiomyocytes

2.3 益肾解毒法对外周血Exos中miR-30的影响从各组外周血中分离Exos，并通过TEM 成像观察到直径在40 ～100 nm 之间的圆形结构，具有细胞膜状结构，见图3-A。根据Western Blot 分析Exos 和总细胞裂解物中的蛋白质，观察到Exos 中CD9、CD63 和TSG101 均呈高表达，而β-actin 仅在细胞裂解物中表达，见图3-B。为了确定Exos 是否可以被小鼠原代心肌细胞吸收，用PKH67 染料标记Exos，该染料具有强烈的绿色荧光，结果显示，与PKH67 标记的Exos 一起孵育的原代心肌细胞胞质呈绿色荧光，见图3-C，表明Exos 可以被原代心肌细胞吸收。

图3 Exos的鉴定Figure 3 Identification of Exos

为了考察YSJD 对外周血Exos 中miRs 变化的影响， 采用高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus database，GEO）的GSE47420 数据集筛选各组小鼠外周血Exos 中变化的miRs。以FDR＜0.05 和|logFC|＞1 作为筛选条件。然后将筛选出的27个miRs显示在热图中，结果发现，miR-30在UCM 组小鼠外周血Exos 中上调，而在UCM+YSJD 组外周血Exos 中下调，见图4-A。RT-qPCR证实了上述结果，与Sham 组比较，UCM 组小鼠外周血Exos 中miR-30 表达显著上调（P＜0.001）。UCM+YSJD 组Exos中miR-30表达较UCM组显著下调（P＜0.001），见图4-B。这些数据表明，miR-30可能参与YSJD对UCM诱导心肌损伤的保护作用。

图4 益肾解毒法中药复方（YSJD）抑制尿毒症心肌病（UCM）小鼠外周血Exos中miR-30表达Figure 4 Yishen Jiedu Chinese herbal compound（YSJD）inhibits the expression of miR-30 in peripheral blood Exos of uremic cardiomyopathy（UCM）mice

2.4Exos中miR-30下调与益肾解毒法减轻UCM诱导的心肌损伤有关为了确定Exos 中miR-30 是否参与YSJD 对UCM 诱导的心肌损伤的调节，我们体外观察各组Exos 处理原代心肌细胞凋亡与自噬情况。结果显示，与Sham-Exos 组比较，UCMExos 组TUNEL 阳性细胞以及自噬体形成显著增加（P＜0.001），而与UCM-Exos 组比较，UCM+YSJD-Exos组则对心肌细胞凋亡和自噬体的形成不产生影响（P＞0.05）。当在UCM+YSJD-Exos与原代心肌细胞共培养系统中向心肌细胞转染miR-30后，心肌细胞的凋亡率和自噬体形成显著增加。见图5-A、-B。一致地，心肌细胞中Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达在UCM-Exos处理后增强，而在UCM+YSJD-Exos 处理后未发生明显变化。当在UCM+YSJD-Exos 与心肌细胞共培养系统中向心肌细胞转染miR-30 时，心肌细胞中Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达明显增强，见图5-C。这些实验结果表明，Exos 中miR-30 下调与YSJD 减轻UCM诱导的心肌损伤和自噬增强有关。

3 讨论

尿毒症心肌病（UCM）是终末期肾病患者中广泛流行的心血管疾病，超过50%的透析患者死于心血管疾病。心脏肥大是UCM 最关键的特征之一，大约75%的成年患者在透析开始时出现，并且几乎100%的患者在透析5 年后出现[11]。因此，迫切需要寻找更好的方法来缓解UCM 症状，提高患者的生活质量。本课题组前期临床观察显示，益肾解毒法可明显降低慢性肾脏疾病（CKD）患者血清肌酐、尿素氮，提高患者内生肌酐清除率水平，同时可改善尿毒症患者心脏彩超左室射血分数（LVEF、EF 斜率），提示益肾解毒法有助于改善UCM[12]。本研究通过体内外实验研究了益肾解毒法对UCM 的心脏保护作用及其对自噬的调控机制。主要研究结果如下：（1）益肾解毒法改善了UCM 小鼠的心功能和心肌结构；（2）益肾解毒法通过抑制心肌细胞的自噬和凋亡减轻了UCM 诱导的心肌损伤；（3）Exos 中miR-30 转运下调与益肾解毒法减轻UCM诱导的心肌损伤有关。

凋亡和自噬是UCM 损伤病理机制中程序性细胞死亡的2 个关键事件[13]。研究报告称，自噬在心脏病中起双重作用，而UCM 长期的心肌压力和容量负荷过重，代谢毒素的毒性作用，炎症及某些营养物质的缺乏（如白蛋白、微量元素）等综合作用导致的过度自噬可能引起细胞死亡和心脏功能障碍[14]。因此，降低细胞凋亡和自噬程度有助于防止心肌细胞损伤。目前，关于UCM 自噬的发生情况及其对心功能影响的研究较少。有研究[15]证实，压力负荷所致的慢性心功能不全2周后小鼠心肌自噬明显增加伴有心肌细胞的重塑，加重心功能不全的进展。心肌细胞自噬导致大量细胞外基质蓄积并诱发心肌纤维化是UCM 的重要病理机制。鉴于心肌细胞自噬在UCM 中的重要作用，调控心肌细胞自噬可能是治疗UCM 的关键所在。本研究结果表明，益肾解毒法治疗可显著削弱体外和体内的细胞凋亡和过度自噬，减轻UCM 诱导的心肌细胞损伤。

细胞微环境的变化可能是UCM 进展的关键决定因素[16]。既往研究揭示了来自各种细胞的Exos通过介导细胞之间的通讯来调节多个过程的潜在功能，如免疫反应、肿瘤细胞发育和心肌细胞存活等[17]。直径为50 ～150 nm 的Exos 以诱导方式从心肌细胞中分泌出来，通过携带和释放细胞因子、营养因子和心血管疾病中的信号分子，在弥合心肌细胞之间的联系中发挥关键作用[18]。Ribeiro-Rodrigues 等[19]确定心肌细胞在缺血条件下分泌的Exos 促进心脏血管生成。Liu 等[20]证实，源自脂肪干细胞的Exos 可以保护心肌细胞免受氧化应激。因此，调节Exos 释放的药物可能是治疗UCM 的一种有前景的选择。据报道，Exos 可以将内容物（包括miRs）转移到宿主细胞内环境中，调节受体细胞活动[21]。本研究在体外表征了源自UCM 和/或益肾解毒法中药复方（YSJD）处理小鼠的外周血Exos，并采用GEO 的GSE47420 数据集筛选确定miR-30 在UCM 小鼠中上调，而在YSJD 干预组中明显下调。进一步通过体外研究证实，miR-30过表达逆转了YSJD 对UCM 诱导的心肌细胞凋亡、自噬的抑制作用。这些数据表明，miR-30 可能参与益肾解毒法对UCM诱导心肌损伤的保护作用。

综上所述，益肾解毒法通过干预外周血Exos中miR-30 转运可抑制UCM 诱导的心肌细胞凋亡、自噬，发挥心脏保护作用。