甜菜碱对阿霉素心脏毒性的作用及机制

滕藤 唐其柱

(1.武汉大学人民医院心血管内科,湖北 武汉 430060; 2.代谢与慢病相关湖北省重点实验室,湖北 武汉 430060)

阿霉素(doxorubicin)是一种广泛使用的蒽环类高效化疗药物,用于治疗各种类型的癌症,然而,阿霉素的剂量依赖性心脏毒性极大地限制了其临床应用[1]。目前为止还没有任何一种有效的疗法可以预防或者消除阿霉素的心脏毒性。活性氧的大量产生是阿霉素造成心脏损伤的主要因素,这引起心肌细胞氧化损伤和心肌细胞凋亡,最终导致心力衰竭的发生[2]。

右雷佐生是美国食品和药物管理局(FDA)唯一批准用于阿霉素心脏毒性治疗的药物,但由于其潜在的致癌性,因此临床使用受到限制[3-4]。许多天然化合物具有明显的抗氧化、抗炎症等作用[5]。甜菜碱广泛存在于动植物体内[6],是动物代谢的中间产物,是动物体内重要的甲基供体。甜菜碱可以促进肝脏和肾脏同型半胱氨酸的代谢[7],同时,甜菜碱也具有较强的抗炎、抗氧化以及抗凋亡作用[8-10],但关于其在阿霉素心脏毒性中的作用机制尚不清楚,现探究甜菜碱在阿霉素心脏毒性中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

甜菜碱(betaine)购于阿拉丁;阿霉素购于深圳万乐药业有限公司;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化蛋白激酶B(phosph-protein kinase B,p-AKT)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化糖原合成激酶-3β(phosph-glycogen synthase kinase-3β,p-GSK-3β)均购于CST公司;4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)购于Abcam公司;TUNEL凋亡检测试剂盒购于碧云天;丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒以及胱天蛋白酶(caspase)-3活性检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所;心肌损伤标志物试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。

1.2 模型建立与动物分组

选取购自北京华阜康生物科技股份有限公司8～10周龄的雄性C57/BL6小鼠48只,体重为23.5～27.5 g,饲养环境为SPF级,恒温、恒湿,12 h昼夜节律,并可自由饮食。本研究涉及的所有动物实验均通过武汉大学动物伦理委员会批准。小鼠经过适应性喂养1周后,按照随机数字表分为4组,每组12只,分别为生理盐水+生理盐水组、生理盐水+甜菜碱组、阿霉素+生理盐水组、阿霉素+甜菜碱组。实验开始第一天,阿霉素组小鼠给予阿霉素(15 mg/kg)单次腹腔注射,对照组小鼠腹腔注射同体积生理盐水;甜菜碱组小鼠给予甜菜碱(800 mg·kg-1·d-1)连续灌胃7 d,对照组小鼠给予同等体积生理盐水灌胃。

1.3 心功能检测及取材

各组小鼠结束灌胃后于异氟烷(2%浓度诱导,1%浓度维持,氧流量300～500 mL/min)吸入麻醉下进行心脏超声检查,评估心功能情况[左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)]、[左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)]等。完成检测后处死小鼠、收集心脏标本并记录取材信息,用于分子生物学检测和病理检测。

1.4 组织病理检测

1.4.1 免疫组织化学染色

将心脏组织脱蜡、水合、抗原修复、H2O2处理、封闭后滴加一抗(4-HNE)于4 ℃过夜,第二天进行二抗孵育以及DAB显色,显色完全后及时终止,经苏木素复染、脱水、透明后用树脂封片。

1.4.2 组织TUNEL染色

将心脏组织脱蜡、水合后,按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书进行检测。

1.5 分子生物学检测

1.5.1 蛋白免疫印迹试验

取左心室组织样本提取蛋白并进行BCA定量。经SDS-PAGE电泳分离、转膜后,于4 ℃过夜进行一抗的孵育,次日孵育对应种属二抗,然后按照比例配置ECL化学发光显影液,曝光显影,然后用Image Lab软件对条带进行灰度分析。

1.5.2 实时荧光定量聚合酶链式反应试验

取左心室组织样本提取总RNA,逆转录成cDNA后,进行目标基因的表达检测。

1.6 生化检测

将左心室组织制成匀浆后分别用心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、MDA以及caspase-3活性检测试剂盒按照说明书进行检测。

1.7 统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件进行统计分析,两组间样本比较采用两独立样本t检验,多组间样本比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况及心功能比较

阿霉素+甜菜碱组的小鼠体重以及心重/胫骨长的下降程度较阿霉素+生理盐水组的小鼠明显减轻(P<0.05)。阿霉素处理的小鼠较对照组小鼠的LVEF以及LVFS明显降低(P<0.05),甜菜碱治疗可以明显改善阿霉素损伤的心功能(P<0.05)(图1)。阿霉素处理的小鼠的心肌损伤标志物cTnI以及LDH较对照组小鼠明显升高(P<0.05),而甜菜碱治疗可以明显减轻小鼠由阿霉素导致的心肌损伤(P<0.05)(图2)。

注:*表示与生理盐水+生理盐水组相比,P<0.05;# 表示与阿霉素+生理盐水组相比,P<0.05;n=12。

注:∗表示与生理盐水+生理盐水组相比,P<0.05;#表示与阿霉素+生理盐水组相比,P<0.05;n=12。

2.2 各组小鼠心脏氧化应激情况比较

阿霉素处理的小鼠心脏较对照组小鼠心脏中的MDA以及4-HNE含量明显升高(P<0.05),甜菜碱治疗可以明显减少小鼠心脏中由阿霉素诱导的MDA以及4-HNE的生成(P<0.05)(图3)。与对照组小鼠相比,阿霉素处理的小鼠心脏中的超氧化物歧化酶-2(superoxide dismutase-2,SOD-2)、谷胱甘肽过氧化物酶-1(glutathione peroxidase-1,GPx-1)以及过氧化氢酶(catalase,CAT)的mRNA表达降低(P<0.05),甜菜碱治疗的小鼠心脏较阿霉素小鼠心脏中的SOD-2、GPx-1以及CAT的mRNA表达上调(P<0.05)(图4)。

注:*表示与生理盐水+生理盐水组相比,P<0.05;#表示与阿霉素+生理盐水组相比,P<0.05;n=12。

2.3 各组小鼠心肌细胞凋亡情况比较

与对照组小鼠相比,阿霉素处理的小鼠心脏中caspase-3的活性明显增加(P<0.05),甜菜碱治疗可以降低由阿霉素诱导增加的心脏caspase-3活性(P<0.05)。TUNEL染色显示,阿霉素处理的小鼠心脏较对照组小鼠的心脏凋亡水平显著增加(P<0.05),经过甜菜碱治疗,阿霉素导致的小鼠心脏凋亡水平显著降低(P<0.05)(图5)。

注:∗表示与生理盐水+生理盐水组相比,P<0.05;#表示与阿霉素+生理盐水组相比,P<0.05;n=12。

2.4 相关通路改变情况

蛋白质免疫印迹结果显示,阿霉素组的小鼠心脏中,p-AKT、p-GSK-3β显著降低(P<0.05);甜菜碱恢复了小鼠心脏中p-AKT和p-GSK-3β的含量(P<0.05)(图6)。这说明,甜菜碱可能是通过AKT/GSK-3β通路发挥对阿霉素所致心肌损伤的保护作用。

3 讨论

许多癌症患者在接受治疗后因为阿霉素心脏毒性引起的心力衰竭导致生活质量显著降低[11]。因此,寻找一种有前景的药物治疗阿霉素引起的心脏毒性成为迫切需要。

注:*表示与生理盐水+生理盐水组相比,P<0.05;#表示与阿霉素+生理盐水组相比,P<0.05;n=12。

注:NS,生理盐水;DOX,阿霉素;BET,甜菜碱;∗表示与生理盐水+生理盐水组相比,P<0.05;#表示与阿霉素+生理盐水组相比,P<0.05;n=12。

氧化应激被认为是阿霉素诱导心脏毒性的最主要机制,此前的许多研究[12]表明,活性氧的过度产生会刺激脂质过氧化等损伤,并最终导致心力衰竭。Meng等[13]研究发现,甜菜碱可以减轻小鼠应激以及氧化应激引起的睾丸损伤。甜菜碱可以减轻乙醇引起的肝脏以及小脑的氧化应激损伤[14-15]。Lv等[16]研究报道,在ApoE-/-的小鼠中,补充甜菜碱可以减少血液中肿瘤坏死因子α等炎症因子,从而减小动脉粥样硬化的病变面积。Heidari等[17]报道,口服补充甜菜碱,可以减少氧化应激标志物,从而减轻胆汁淤积相关肾损伤。这些研究结果说明,甜菜碱具有较强的抗氧化作用。笔者研究也发现,甜菜碱可以提高阿霉素小鼠心脏中抗氧化酶的活性,并降低阿霉素小鼠心脏中过氧化物的水平。

阿霉素可以诱导细胞凋亡,Mizutani等[18]发现经阿霉素处理的人早幼粒白血病细胞表现出caspase-3蛋白的激活,导致细胞死亡。线粒体依赖的内源性通路在阿霉素心脏毒性中起着关键作用,这一途径是通过上调促凋亡蛋白,如B淋巴细胞瘤-2基因关联X蛋白,促进细胞色素C从线粒体释放,导致caspase-9激活,进而导致效应器caspase-3激活[19]。此外,阿霉素还可通过死亡受体(death receptor,DR)等外源性途径介导心肌细胞的凋亡。Zhao等[20]证实了阿霉素诱导的人多能干细胞来源的心肌细胞中DR的上调,如肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体、凋亡相关因子、DR4和DR5,这些上调的DR与其同源配体结合,触发caspase级联反应,最终导致细胞凋亡。Veskovic等[10]发现,甜菜碱可以通过AKT/mTOR与自噬通路减轻肝脏氧化应激、炎症以及凋亡,从而发挥对于非酒精性脂肪肝的保护作用。本研究发现,在阿霉素处理的小鼠心脏中,caspase-3活性明显升高,TUNEL染色显示心肌细胞的凋亡水平也明显增加;但经过甜菜碱治疗,小鼠心脏中caspase-3的活性被明显抑制,TUNEL阳性率也明显降低。这说明,阿霉素治疗会引起较为严重的心肌细胞凋亡发生,但甜菜碱可以明显减轻心肌细胞凋亡。

AKT和GSK-3β是胰岛素信号通路的两种重要蛋白激酶。当胰岛素与其受体结合时,Thr308位点被磷酸化从而激活AKT,活化的AKT磷酸化GSK-3β并抑制其激酶活性[21],而 GSK-3β活性升高会破坏线粒体膜电位,增加细胞内活性氧积累[22]。既往研究[23-24]表明,阿霉素诱导的损伤心脏中,AKT的活性明显降低,而AKT磷酸化的增强促进了心肌细胞的存活,预防了阿霉素诱导的心功能障碍。本研究发现,阿霉素处理的小鼠心脏中,p-AKT的含量显著降低,GSK-3β的活性明显增高;经过甜菜碱治疗,AKT的活性明显增加,而GSK-3β的活性则被明显抑制。这说明,甜菜碱对阿霉素心脏毒性的保护作用可能是通过AKT/GSK-3β通路实现的。

综上所述,甜菜碱可以减轻阿霉素引起的心脏氧化应激损伤和心肌细胞凋亡,而这些作用可能是通过激活AKT/GSK-3β实现的。