坤泰胶囊治疗卵巢储备功能下降的作用机制*

武桐，吴越，李伟莉，3

1 安徽医科大学 安徽合肥 230031

2 安徽中医药大学 安徽合肥 230031

3 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

卵巢储备功能下降（diminished ovarian reserve，DOR），是指卵巢产生卵子的能力减弱、卵母细胞质量下降，从而导致女性性激素缺乏、生育能力下降的一种疾病，进一步发展可演变为卵巢早衰[1]。西医主要采用激素替代疗法、促排卵疗法及辅助生殖技术等方法进行治疗[2]，但其缺点不容忽视，比如增加妇科肿瘤和心血管疾病等发病几率的风险、依赖性强、失败率高、价格高昂等。中医药治疗本病历史悠久，已积累了丰富的经验。中医学中，并无卵巢储备功能下降的病名，但可根据其临床表现归属于“月经过少”“月经后期”“不孕”“经断前后诸证”等范畴。现临床常用中成药制剂--坤泰胶囊，由《伤寒论》中“黄连阿胶汤”化裁而来，具有滋阴清热、安心除烦、补血养血、调和阴阳等多重功效，主要用于绝经期前后诸证、妇女卵巢功能衰退等妇科疾病。坤泰胶囊组方为熟地、黄芩、黄连、茯苓、白芍和阿胶，其中熟地为君药，生精益髓、滋阴养血；黄连苦寒，入心经而清降心火，阿胶甘平，入肾经而补血滋阴，两药相伍以达心火降、肾水旺，调和阴阳之功，此共为臣药；黄芩助黄连清热泻火，白芍养血调经，柔肝敛阴，助阿胶滋补肾水，茯苓健脾宁心，此共为佐药。

网络药理学是一种基于系统层次和生物网络的整体角度，解析药物和治疗对象之间的分子关联规律的新兴学科[3]。坤泰胶囊虽已在临床上取得一定效验，但其发挥作用的有效活性成分、潜在靶点、生物过程尚不十分明确。故本研究将采用网络药理学方法，通过挖掘坤泰胶囊治疗 DOR 的有效成分、潜在作用靶点，进行Go功能富集及KEGG通路富集分析，系统的对其作用机制进行深入探讨，以期为卵巢储备功能下降的临床决策提供科学依据。

资料和方法

1 坤泰胶囊的活性成分及靶标基因收集

通过TCMSP（http：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）对坤泰胶囊中熟地、黄连、白芍、黄芩、茯苓进行检索，利用BATMAN-TCM（bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm）和化学专业数据库（www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm）对阿胶进行检索，由此建立坤泰胶囊的化学成分数据库。以药动学参数中的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（druglikeness，DL）≥0.18作为筛选条件，最终获得的化合物共77个。将获得的活性成分输入TCMSP数据库，检索出对应的靶点，结合Uniprot数据库获得坤泰胶囊的基因靶点。

2 DOR疾病靶标收集

以“diminished ovarian reserve”为关键词，在人类孟德尔遗传综合数据库数据库（http：//www.omim.org/）及Genecards数据库（http：//genecards.org/）中检索DOR的疾病靶点。

3 活性成分-作用靶点网络构建

将整理好的坤泰胶囊有效成分及靶点上传至Cytoscape3.8.0软件，建立“成分-靶点”可视化网络图，由此得出坤泰胶囊治疗 DOR 的主要活性成分。

4 PPI网络构建

通过Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic/tools/venny/index.html）获取坤泰胶囊与疾病的交集靶点，然后将交集靶点导入String数据库（http：//www.string-db.org），限定物种选择“Homo sapiens”，置信度选择“medium confidence（0.400）”，同时将游离点设置隐藏，得到相互作用网络图，并利用Cytoscape3.8.0软件进行可视化展示。

5 Go功能富集分析及KEGG通路富集分析

Metasacpe平台（http：//metascape.org/gp/index.html）是一个功能丰富的基因功能注释分析工具。将坤泰胶囊治疗 DOR 的靶点录入Metasacpe平台，限定物种选择“H.sapiens”，分析类型选择“Custom Analysis”，分别进行Go功能富集分析和KEGG通路富集分析，并将数据导入微生信（www.bioinformatics.com.cn）制作条形图、气泡图以求数据可视化。

结 果

1 坤泰胶囊的活性成分收集

由TCMSP数据库得出的活性成分分别为熟地2个，黄连14个，白芍13个，黄芩36个，茯苓15个，阿胶3个，由BATMAN-TCM和化学专业数据库得到阿胶的3个活性成分，部分活性成分信息见表1。

表1 坤泰胶囊所含部分化合物基本信息

2 坤泰胶囊作用靶点和DOR疾病靶点获取

在TCMSP和Uniprot数据库检索坤泰胶囊的基因靶点，在人类孟德尔遗传综合数据库数据库及Genecards数据库检索DOR 的疾病靶点，分别整合去重，最终得到140个药物作用靶点，3522个疾病靶点。同时绘制成韦恩图，得到交集靶点112个。如图1。

图1 药物靶点及疾病靶点的韦恩图

3 “成分-靶点”网络构建

将坤泰胶囊的有效成分及靶点传输至Cytoscape软件之后，构建“成分-靶点”网络图（见图2），包括294个节点，427条边，其中黄色菱形代表坤泰胶囊的有效成分，绿色圆形代表作用靶点，连接条数最多、较为密集的成分和靶点在该网络中起着关键作用。根据拓扑学性质（度值≥20），可以得到坤泰胶囊治疗DOR 的核心有效活性成分依次为槲皮素、山奈酚、β谷甾醇、汉黄芩素、豆甾醇、蛇床子素。

4 PPI网络构建

将在韦恩图中获得的交集基因导入String数据库，获取TSV格式文件后导入Cytoscape3.8.0绘制PPI网络图（见图3）。用节点的大小和颜色表示degree值的大小，即节点越大、颜色越深，degree值越大；用边的粗细和颜色表示combined score的大小，即边越粗、颜色越深，combined score值越大。其中关键节点涉及AKT1、VEGFA、PTGS2、CASP3、TP53、CXCL8、MMP9等。

图3 PPI网络图

5 Go功能富集分析及KEGG通路富集分析

将筛选到的坤泰胶囊治疗 DOR 的靶点导入Metascape数据库中，分别进行Go功能富集分析及KEGG通路富集分析，设定阈值P＜0.01，其中Go富集分析又包括生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）及细胞组分（cellar component）。搜集到生物过程112个条目，分子功能42个条目，细胞组分21个条目，信号通路107个。分别选取前20的条目进行可视化，将结果导入微生信进行Go富集分析三合一柱状图和KEGG富集分析气泡图绘制。其中KEGG富集分析气泡图中，P值用气泡颜色表示，代表富集程度，即越接近红色代表P值越小；count值用气泡大小表示，代表富集基因数，即气泡越大就代表富集的基因数目越多；横坐标为基因比例，纵坐标为信号通路名称（见图4、图5）。

图4 Go功能富集分析（三合一）

图5 KEGG富集分析

讨 论

本研究通过网络药理学手段，探索坤泰胶囊的物质基础和潜在作用机制。在化合物和作用靶点方面，共筛选出坤泰胶囊的主要活性成分有77个，作用靶点有112个。其中起关键作用的活性成分分别为槲皮素、山奈酚、β谷甾醇、汉黄芩素、豆甾醇、蛇床子素。槲皮素、山奈酚、汉黄芩素属于黄酮类化合物，都具有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及抗癌的作用。有研究证明槲皮素可以调节女性生殖系统功能，减少卵巢细胞凋亡，促进卵母细胞成熟、改善卵母细胞质量，直接调节类固醇和肽类激素的释放，即通过调节HGPA轴，下调FSH及LH水平，还可降低雌激素受体α（ERα）、β（ERβ）和孕激素受体（PR）在下丘脑、垂体和子宫内膜的表达[4]。β谷甾醇和豆甾醇属于植物甾醇类，为天然多酚羟酸类化合物。β谷甾醇有着抗炎、抗氧化、抗凋亡和神经保护的作用，曾莉萍认为β谷甾醇具有雌激素活性，诱导卵巢颗粒细胞产生雌激素[5]，更有研究表明β谷甾醇可通过增加P-AKT 和 P-PIK3CA蛋白表达水平促进颗粒细胞增殖，且降低Caspase-3蛋白表达水平，从而抑制颗粒细胞的凋亡[6]。豆甾醇可调节促性腺激素，具有抗氧化活性[7]。蛇床子素具有缓解氧化应激损伤的作用，可保护卵巢组织的功能，增强卵巢组织的抗氧化能力[8]。

通过PPI网络分析发现，AKT1、VEGFA、PTGS2、CASP3、TP53是坤泰胶囊治疗 DOR 的关键靶点。AKT1是P13K/AKT通路中的重要蛋白，可促进细胞存活、发育和增殖[9]，李锦英[10]等学者认为AKT1可维持原始卵泡正常的生长发育，调节卵母细胞的生长和颗粒细胞的增殖分化，并可抑制细胞凋亡。卵巢血管生成对卵泡发育起着至关重要的作用，冯逊逊[11]等人通过超声动态观察免疫性原发性卵巢功能不全的小鼠与正常小鼠，证明了卵巢血管顺应性和血管弹性与卵巢储备功能呈正相关。而VEGFA是主要的促血管内皮生长因子之一，一般来源于基质细胞，在血管生成和血管通透性方面发挥生理功能，Wei Jingzan[12]经体外实验表明，VEGFA与miR-185相互影响，达到减轻卵巢结构损伤，保护颗粒细胞层厚度、膜细胞层厚度的作用。诸多研究发现，PTGS2主要定位于颗粒细胞，卵丘细胞和黄体细胞，参与多种生殖活动，例如排卵、着床及妊娠等，且其高表达与血管生成密切相关，从而影响卵巢血供[13-14]。CASP3是Caspase家族重要的下游调控因子，是细胞凋亡的主要执行者，在卵母细胞、颗粒细胞中均有表达，可使卵巢功能下降[15]。TP53在细胞周期阻滞、凋亡、衰老和自噬等各种环节中扮演者重要角色。相关研究证明，衰老细胞在TP53缺失后，对凋亡信号失去反应，可重新进入细胞周期，使衰老细胞快速增殖[16]，这可能是TP53成为坤泰胶囊治疗 DOR 关键靶点之一的原因。

通过Go生物过程功能富集分析，可以得到坤泰胶囊可能主要参与炎症反应、循环系统过程、对无机物的应答、离子反应的正向调控等生物过程。通过KEGG通路富集分析，发现富集通路主要是信号传导通路（JAK-STAT、Wnt、VEGF、HIF-1、NF-KB、雌激素、趋化因子、长寿信号通路）、疾病通路（利什曼原虫感染、胰岛素抵抗、丙肝、癌症）等。其中显著性较高的通路为癌症、糖尿病并发症中的糖化终末产物及其受体信号通路、丙型肝炎等，JAK-STAT信号通路受雌激素调控，并与衰老相关通路有通向变化[17]，HIF-1通路与细胞增殖、血管生成的蛋白质表达有关[18]，Wnt通路的作用于胚胎发育，同时参与成年女性的生殖功能、维持体内稳态等。由此可见，坤泰胶囊是通过多靶点、多通路对 DOR 进行调控以达到治疗作用。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，初步阐释了坤泰胶囊治疗 DOR 的相关作用机制，体现了多成分、多靶点、多效应的治疗特点。然而由于现阶段中药化学数据库资料不足、各数据库之间差异较大等，本研究结果可能有偏差，且本次研究仅限于分子层面，仍需更多研究加以佐证。