黄化病槟榔园中8种植物植原体分子检测及其遗传变异分析

朱安娜　于少帅　苏莉惠　刘丽　宋薇薇　阎伟

关键词：植原体；槟榔黄化病；自然寄主；分子检测；遗传多样性

中图分类号：S763.7 文献标识码：A

植原体（phytoplasma）是一类无细胞壁、寄生于植物韧皮部、难分离培养的原核致病菌[1]，该致病菌于1967 年由日本学者DOI 等首次发现[2]。由植原体引起的植物病害是一种毁灭性病害，其引起的植物病害典型症状包括花变叶、黄化、丛枝、皱缩、小叶等[3-4]。海南植原体病害种类较为丰富，约占我国植原体病害的1/4，给海南当地农林产业和生态环境造成严重影响。植原体在海南危害的植物包括槟榔、橡胶、花生等，其中由植原体引起的槟榔黄化病（areca palm yellow leafdisease， AYL）在海南发生范围广且危害严重[5]。

槟榔（Areca cathecu L.）是一种极具观赏、药用价值的棕榈植物，其特点是高大挺拔、容易栽植，具有绿化、美化、净化、优化环境的作用[6]。由植原体引起的槟榔黄化病是一种传染性极强，导致产量降低的植物病害。我国槟榔黄化病首次发现于海南屯昌，目前已经蔓延至琼海、万宁、定安等众多市（县），该病扩散速度快，发病范围逐年扩大[5]。早期金开璇等[7]通过电镜和DAPI染色方法在感病组织中观察到植原体。此后，其他学者相继通过PCR 扩增、四环素注射等方法证实了植原体为引起槟榔黄化病的病原[8-9]。

植原体病害以防为主，明确植原体自然寄主、传播媒介等病害循环途径和病原传播载体，找出其病害循环的薄弱环节，对于精准制定该类病害的防控措施具有重要意义。目前海南槟榔黄化植原体及其病害传播媒介和扩散途径不清，严重制约该病害的防控管理，也给园林景观带来了严重影响。因此，本研究开展槟榔黄化植原体自然寄主的分子检测及其遗传变异规律与系统发育关系分析。根据植原体病害典型症状特征，对海南黄化病槟榔园中疑似植原体自然寄主进行调查、采样，明确不同植物携带植原体情况及植原体遗传变异规律，确定发病槟榔园中槟榔黄化植原体的自然寄主情况，为制订切实可行、精准有效的槟榔黄化病防控管理策略提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 根据植原体病害典型的症状特征，对海南定安（110°8′59.57″E， 19°34′33.56″N）、琼海（110°23′3.06″E， 19°7′56.29″N）黄化病槟榔园中疑似植原体病害植物进行调查、采样，调查采样时间为2021—2022 年，采样部位为植物叶片组织，同时采集健康植株样品作为阴性对照，所有樣品保存于–20 ℃，备用。

1.1.2 主要试剂和仪器 植物基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）、2×PCR Master Mix 预混液购于天根生化科技公司（北京）有限公司，PCR扩增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其他试剂均为国产分析纯。KZ-III-F 高速低温组织研磨仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司，Biometra 070-851 型PCR 仪购自德国耶拿公司，DYY-6C 型电泳仪购自北京六一仪器厂，Universal320R 型高速冷冻离心机购自广州深华公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 称取0.1 g 植物样品，利用CTAB法提取样品总DNA，方法参照天根植物基因组DNA 提取试剂盒说明书，并保存于–20 ℃备用[10]。

1.2.2 PCR 扩增 利用植原体通用引物P1/P7 和R16mF2/R16mR1 进行植原体16S rRNA 基因PCR扩增，利用SecAFor1/SecARev3 进行植原体secA基因扩增，引物扩增信息如表1 所示。PCR 扩增模板为样品总DNA。16S rRNA 基因第1 轮PCR扩增条件：94.0 ℃预变性5 min；94.0 ℃变性30 s，50.0 ℃ 退火40 s ， 72.0 ℃ 延伸2 min ， 72 ℃10 min，共35 个循环。第1 轮PCR 扩增产物稀释50 倍后用作第2 轮PCR 扩模板，16S rRNA 基因第2 轮扩增条件：94.0 ℃预变性5 min；94.0 ℃变性30 s，50.0 ℃退火40 s，72.0 ℃延伸1 min30 s，72 ℃ 10 min，共35 个循环。secA 基因的PCR 扩增反应条件为：94.0 ℃预变性5 min；94.0 ℃变性30 s，53.0 ℃退火40 s，72.0 ℃延伸1 min，72 ℃ 10 min，共35 个循环。PCR 反应体系均为50 μL，所得PCR 扩增产物经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测确定目的条带，将PCR 扩增产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.3 16S rRNA 与secA 基因序列比对 将测序所获得的核苷酸序列用DNAMAN 6.0 软件校正编辑，进行多重序列比对分析，通过BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov//Blast.cgi）进行比对析，与GenBank 数据库中已知的植原体核苷酸序列进行比对分析。通过多重序列比对与BLAST比对明确不同植原体植株之间的相似性，以山杜英衰退植原体（登录号：OL689207）为参考序列进行变异位点分析，该序列长度为1503 bp。

1.2.4 系统发育分析 利用MEGA 7.0 软件基于N-J 法（neighbor-joining）构建不同植原体株系的系统进化树。将自展值设为1000，揭示所获得的植原体与GenBank 数据库中已收录植原体株系间的系统发育关系。将洋葱黄化植原体（ onionyellows phytoplasma， OY-M， AP006628）、翠菊黄化植原体（aster yellow phytoplasma， CP000061）、苹果簇生植原体（apple proliferation phytoplasma，CU469464）、葡萄黄化植原体（Ca. phytoplasmaaustraliense， AM422018）、草莓致死性黄化植原体（strawberry lethal yellows phytoplasma， CP002548）等植原体株系作为系统发育树的外类群，其他植原体株系相关序列信息见表2。

2 结果与分析

2.1 疑似植原体病害植物调查

对海南定安、琼海的黄化病槟榔园中疑似植原体病害植物进行调查、采样，共采集8 种植物45 份疑似植原体病害植物样品，样品包括苦楝、龙葵、山黄麻、藿香蓟、野茼蒿、黄皮、白背叶、鬼针草；样品表现的疑似植原体病害典型症状包括丛枝、黄化、小叶及叶片皱缩等。采集的疑似植物植原体病害样品信息见表3，疑似植物植原体病害症状如图1 所示。

2.2 PCR 扩增及病原检测

利用通用引物P1/P7、SecAFor1/SecARev3 分别进行PCR 扩增，在6 个山黄麻样品中分别扩增到约1.8、0.6 kb 的目的条带，其他样品中未扩增到。利用通用引物R16mF2/R16mR1 进行巢氏PCR扩增，在1 个苦楝样品检测到约1.4 kb 的目的条带，其余样品均未扩增到。通过目的条带测序，在6 个山黄麻丛枝样品中均获得植原体16S rDNA 序列和secA 基因序列。6 个山黄麻植原体株系的16SrDNA 序列一致， 经测序所得序列长度均为1425 bp；secA 基因序列也一致，测序所得序列长度均为595 bp。基于16S rDNA 序列多重比对分析表明：所得山黄麻植原体与已报道的山黄麻丛枝植原体株系（MW138004）序列相似性为100%。这6 个山黄麻丛枝植原体株系分别为TtWBDA18、TtWB-DA19、TtWB-DA20、TtWB-DA21、TtWB-DA22 和TtWB-DA23。在1 个苦楝丛枝样品中扩增到植原体16S rDNA 序列，测序所得序列长度为1122 bp。基于该序列比对分析表明：所得苦楝植原体与海南三亚已报道苦楝丛枝植原体（KP662119；KP662120）序列相似性为100%，该苦楝丛枝植原体株系为CWB-DA55。

2.3 序列变异分析

基于16S rDNA序列比对分析表明，本研究中苦楝丛枝植原体与16SrⅠ组的苦楝丛枝植原体hnsy1 （ KP662119 ）、苦楝丛枝植原体hnsy2（KP662120）、马松子绿变植原体（KX150461）等序列相似性均为100%，与其他组植原体株系的序列相似性均低于99.8%（表4）。基于secA 基因序列比对分析表明，本研究中山黄麻丛枝植原体与16SrⅩⅩⅩⅡ组的山黄麻丛枝植原体（MW139904）、山杜英衰退植原体（OL689202）序列相似性分别为100%、99.1%，与其他组植原体株系的相似性均低于86%（表5）。基于SecA 氨基酸序列比对分析表明，本研究中山黄麻丛枝植原体与16SrⅩⅩⅩⅡ组的山黄麻丛枝植原体（MW139904）、山杜英衰退植原体（OL689202）序列相似性分别为100%、98.5%（表6）。由此可知，不同植原体株系间氨基酸序列的变异水平较高。基于16S rDNA 序列的遗传变异分析表明，本研究中山黄麻丛枝植原体与山杜英衰退植原体（OL689207）共存在5 个变异位点，分别在67位、102 位、1088 位、1277 位、1446 位（表7）。

2.4 系统发育分析

基于16S rRNA 基因的系统发育分析表明（图2），山黄麻丛枝植原体与马来西亚长春花绿变（EU371934）、山杜英衰退植原体（OL689207）等16SrⅩⅩⅩⅡ组植原体聚于同一个进化分支，支持率为90%。苦楝丛枝植原体与海南长春花绿变植原体株系（GU113146）、蛇婆子绿变植原体株系（ MW353909 ）、马松子绿变植原体（KX150461）、刺芫荽丛枝植原体（GU113156）等16SrI 组植原体聚于同一个进化分支，支持率为95%。基于secA 基因序列系统发育分析表明（图3），本研究所得山黄麻丛枝植原体与已报道的山黄麻丛枝植原体（MW139904）、山杜英衰退植原体（OL689202）等16SrⅩⅩⅩⅡ组植原体聚于同一个进化分支，支持率为100%。基于SecA 氨基酸系统发育分析表明（图4），山黄麻丛枝植原体与已报道的山黄麻丛枝植原体（MW139904）、山杜英黄化植原体（LC257973）等16SrⅩⅩⅩⅡ组植原体聚于同一个进化分支，支持率为100%。

3 讨论

本研究在表现黄化病的槟榔园中检测到16SrⅩⅩⅩⅡ组山黄麻丛枝植原体和16SrⅠ组苦楝丛枝植原体。因植原体难分离培养，导致其检测较为困难。随着分子生物学技术的不断发展，植原体病害的诊断与检测也在不断进步。在植原体的检测中，16S rDNA 序列分析可以很好地说明植原体间的遗传变异规律和系统发育关系。目前，学者将植原体分为49 个组[14]。经比较发现本研究中苦楝丛枝植原体与陈健鑫等[15]报道的滇朴丛芽植原体云南株系、车海彦等[16]报道的海南长春花绿变植原体株系均属于16SrI 组植原体，且变异程度较小。进一步深入研究苦楝丛枝植原体和滇朴丛芽植原体、长春花绿变植原体之间的遗传变异规律还需从多个基因进行探究。本研究中的山黄麻丛枝植原体与墨西哥长春花绿变植原体、前期研究[10]报道的海南山黄麻海南株系同属于16SrⅩⅩⅩⅡ组植原体，变异程度不大。万琼莲等[17]报道的云南羽脉山黄麻丛枝植原体属于16SrⅠ-Ⅹ亚组。本研究与前期研究[10]报道采用的引物不同，本研究扩增出来的序列片段除了16S rDNA，还包括16S-23S rDNA 基因间区序列，揭示了本组植原体相对更多的序列信息，为后续研究这类植原体提供参考。

植原体不同DNA 序列的扩增效率存在差异。本研究从苦楝丛枝植原体中扩增获得1122 bp 的16S rDNA 基因片段，但secA 基因未扩增出，可能是植原體总DNA 浓度低，扩增效率较低导致。郑文虎[18]报道了海南长春花小叶病植原体secA和secY 基因，苏帆等[19]报道了云南芝麻丛枝和花变叶植原体16S rRNA 和rp 基因，杨静宇[20]报道了海南竹柏扁枝植原体16S rRNA、tuf 基因。相同植物寄主植原体种类也存在多样性。国外研究的苦楝植原体也有相关报道，如GALDEANO 等[21]和ARNEODO等[22]通过研究阿根廷的苦楝丛枝植原体株系，发现二者均属于16SrⅧ组，症状类型表现为黄化和衰退，与本研究检测的苦楝丛枝症状有相同之处，但16Sr 组存在差异。本研究发现白背叶、藿香蓟、野茼蒿等样品也表现典型植原体病害症状，PCR 反应也扩增到特异性条带，但测序后经过BLAST 发现并不是植原体而是植物的叶绿体。由此可见，植原体的检测受多种因素影响。为更方便快捷开展此类难培养微生物的检测诊断工作，需要专研出一种高效、快速、灵敏度高的检测技术以满足不同寄主的需求，目前已有槟榔黄化植原体等相关快速可视化检测技术的报道[23]。

植原体自然寄主的多样性有助于其相关病害的传播扩散。海南地处热带，自然资源丰富，由于夏冬季节温度较高，一些介体昆虫也会传播植原体病害[24]。近年来，人们对植原体的研究广泛，其种类也日益增加，不同的寄主也有利于传播植原体，同组的变异水平不高，由此推测植原体可能是通过同一种昆虫或者是同一中间寄主在不同环境下进行传播。如莴苣退绿植原体可被叶蝉传播[25]，泡桐丛枝植原体可通过牛筋草、辣椒、花生等7 种自然寄主传播[26]。由于自然寄主引起的相关植物黄化、小叶、丛枝等症状，喷洒农药、施肥、采取建造水肥调节一体化等措施及时清理植原体传染的源头，有利于减少中间寄主[27]。由于目前槟榔黄化病病害传播媒介昆虫和扩散途径尚不明确，对园林景观也造成了一定的影响。海南槟榔黄化植原体属于16SrⅠ组，本研究的苦楝丛枝植原体也为16SrⅠ组，进一步明确了槟榔园中植原体的自然寄主范围。由此可知，及时清理苦楝等寄主植物，可有效清除病源，切断病原传播途径。海南作为我国槟榔主产地，更需要有效防控该类病害，减少中间寄主，清除传染源头，从而有效地减少或防止相关植原体传播。本研究利用分子生物学检测方法对该病害的带病自然寄主及其病原多样性进行检测分析，基于检测结果，及时清理槟榔病园内病树病草，对于防止槟榔黄化病的大面积扩散起到重要作用。研究结果对于制订切实可行的海南槟榔黄化病防控管理策略具有重要意义。