芪参益气滴丸调控Sirt1与eNOS互作促进糖尿病心肌缺血损伤修复再生

刘 鑫，刘甜甜*，姚魁武，张彦丽，巩 颖，顾媛媛，曹俊岭, 3*

芪参益气滴丸调控Sirt1与eNOS互作促进糖尿病心肌缺血损伤修复再生

刘 鑫1，刘甜甜1*，姚魁武2，张彦丽1，巩 颖1，顾媛媛1，曹俊岭1, 3*

1. 北京中医药大学东方医院，北京 100078 2. 中国中医科学院眼科医院，北京 100040 3. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700

探讨芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠血管内皮功能及血管新生的作用机制。102只雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、尼可地尔片（4.55 mg/kg）组及芪参益气滴丸低、高剂量（227.5、455.0 mg/kg）组和芪参益气滴丸（227.5 mg/kg）＋EX-527（10 mg/kg）组。第2周开始对照组以正常饲料饲养，其余各组以高脂饲料饲养，然后持续7 d ip链脲霉素（50 mg/kg），建立2型糖尿病模型，对照组ip等体积生理盐水。第4周模型组和各给药组小鼠连续5 d颈背部sc异丙肾上腺素盐酸盐（100 mg/kg），对照组sc等体积生理盐水。第5周开始给予药物干预14 d，取血清测定心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTn I）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、内皮素-1（endothelin-1，ET-1）和血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）含量；病理染色检测心脏形态结构、胶原纤维比值、心肌凋亡数量和血管新生情况；Western blotting检测心脏组织沉默信息调节因子1（silence information regulator 1，Sirt1）、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、磷酸化苏氨酸495位点eNOS（phosphorylation of Thr495-eNOS，pT495-eNOS）、磷酸化丝氨酸1177位点eNOS（phosphorylation of Ser1177-eNOS，pS1177-eNOS）蛋白表达。免疫荧光双标染色检测心脏Sirt1与eNOS共定位。与对照组比较，模型组小鼠血清cTnI水平及CK-MB活性均明显增加（＜0.01），ET-1、vWF和NO水平均显著减少（＜0.01）；心肌细胞排列紊乱，肌纤维缺失，肌间隙增大，心肌纤维化面积和心肌凋亡数目显著增加（＜0.01），血小板-内皮细胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）标记的新生血管数量明显减少（＜0.01），心脏Sirt1、eNOS表达降低（＜0.01），pT495-eNOS水平升高（＜0.01），Sirt1和eNOS共定位减少。芪参益气滴丸干预后均有显著的保护效应，加入EX-527能部分逆转芪参益气滴丸的作用。芪参益气滴丸可通过上调Sirt1和eNOS水平，增加Sirt1与eNOS相互作用，提高NO生物利用度，保护内皮功能，改善血管新生，抑制心肌纤维化和心肌凋亡，从而促进糖尿病心肌缺血损伤修复。

芪参益气滴丸；糖尿病；心肌缺血；血管新生；内皮功能；沉默信息调节因子1；内皮型一氧化氮合酶

预计到2045年，全球糖尿病人数将达7.84亿[1]，庞大的糖尿病人口加剧经济负担，另外，糖尿病迁延不愈易导致各种心脑血管并发症。研究表明，糖尿病患者的动脉粥样硬化血管病变发生率增加，心肌梗死和脑梗死发病率是非糖尿病患者的4～5倍，且预后较差[2]。关于糖尿病心肌梗死的病理机制并不明确，研究认为高血糖可能通过其代谢途径增加炎症和活性氧产生，导致血管结构和功能改变，造成心肌受损及心功能障碍[3]。近年来对糖尿病心肌梗死有效治疗途径的需求日益增加，临床治疗既要控制血糖水平，改善心绞痛症状，还需预防心脑血管病进展引起的致死致残，改善生活质量。为此，探寻糖尿病心肌梗死的潜在靶标及治疗药物具有重要意义和潜在应用价值。

沉默信息调节因子1（silence information regulator 1，Sirt1）调控哺乳动物细胞多个重要病理生理过程[4-5]。研究表明，敲除基因导致小鼠心肌缺血/再灌注损伤加重，高表达Sirt1则下调凋亡蛋白和上调抗氧化分子改善心肌缺血[6-8]。Sirt1能活化内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），提高内皮源性一氧化氮（nitric oxide，NO）水平，抑制血管老化，抗动脉粥样硬化，改善脑动脉和胸主动脉舒张功能，介导缺血区域血运重建[9]。此外，研究发现抑制eNOS活性及NO水平显著降低Sirt1的表达，引起血管内稳态失衡，说明eNOS也正向调控Sirt1表达[10]。可见，增加Sirt1与eNOS相互作用对维持血管内皮功能、促进缺血区域血管再生发挥一定的作用。

糖尿病心肌梗死属中医消渴并发胸痹、心痛等范畴[11]。患者临床症状及中医证候，多以心气不足、心血失于推动，血脉滞涩为发病原因。基本病机主要是本虚标实、气虚血瘀，故益气活血化瘀、标本同治为其重要治则。芪参益气滴丸是益气活血法的代表方药，研究显示，芪参益气滴丸增加2型糖尿病合并冠心病老年患者的左室射血分数和舒张功能[12-13]，减轻高糖诱导的心肌细胞氧化损伤、抑制心肌细胞凋亡[14]，但具体作用机制不详。本研究采用高脂饮食联合链脲霉素及颈背部sc异丙肾上腺素构建糖尿病心肌缺血模型，探讨芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠血管内皮功能和心肌修复再生的机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠102只，6～8周龄，体质量17～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（京）2021-0006，质量合格证号110011221108055625，使用许可证号SYXK（京）2019-0013。动物实验由北京中医药大学东方医院实验动物使用与管理委员会批准（批准号DFYY202225M）。

1.2 药品与试剂

60%脂肪供能高脂饲料（H10060，批号20220801）购自北京华阜康生物科技股份有限公司；NO试剂盒（批号20221014）、肌酸激酶MB同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）试剂盒（批号20221014）购自南京建成生物工程研究所；链脲霉素（批号WXBD1402V）、异丙肾上腺素盐酸盐（批号WXBD0774V）购自美国Sigma-Aldrich公司；芪参益气滴丸（批号220313）购自天士力制药集团股份有限公司；尼可地尔片（批号220209249）购自天方药业有限公司；选择性SIRT1抑制剂EX-527（批号A1527018）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；血小板-内皮细胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）抗体（批号C76821022003）购自武汉塞维尔生物科技有限公司；GAPDH（批号20210615）购自天德悦（北京）生物科技有限责任公司；山羊抗兔二抗（批号158319）、山羊抗小鼠二抗（批号139283）购自美国Jackson公司；磷酸化丝氨酸1177位点-eNOS（phosphorylation of Ser1177-eNOS，pS1177-eNOS）抗体（批号ab215717）购自英国Abcam公司；Sirt1抗体（批号sc74465）、eNOS抗体（批号sc376751）、磷酸化苏氨酸495位点-eNOS（phosphorylation of Thr495-eNOS，pT495-eNOS）抗体（批号sc136519）购自美国Santa公司；小鼠心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTn I）ELISA试剂盒（批号W17025589）、小鼠内皮素-1（endothelin-1，ET-1）ELISA试剂盒（批号W18025590）、小鼠血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）ELISA试剂盒（批号W19025591）均购自武汉华美生物工程有限公司；血糖试纸（批号26054442）购自德国Roche公司。

1.3 仪器

活力型血糖仪（德国Roche公司）；Synergy H1型多功能微孔板检测仪（美国Bio-Tek公司）；Forma™ 900系列−80 ℃超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；5424R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；BX51型正置显微镜（日本Olympus公司）；P250 FLASH型全载玻片数字病理扫描仪和Caseviewer切片扫描分析软件（匈牙利3DHISTECH有限公司）。

2 方法

2.1 分组、造模及给药

C57BL/6J小鼠适应性饲养1周，采用随机数字表法选取12只为对照组，其余分为模型组、尼可地尔片（4.55 mg/kg，相当于临床等效剂量）组及芪参益气滴丸低、高剂量（227.5、455.0 mg/kg，分别为1、2倍临床剂量）组和芪参益气滴丸（227.5 mg/kg）＋EX-527（10 mg/kg）组，每组18只。第2周开始除对照组继续喂养正常饲料外，其余小鼠均喂养高脂饲料至实验结束，然后ip链脲霉素（50 mg/kg），连续注射7 d，对照组ip等体积生理盐水。注射链脲霉素后第8、10、11天测定各组小鼠空腹血糖。第4周开始模型组和各给药组小鼠连续5 d颈背部sc异丙肾上腺素盐酸盐（100 mg/kg），建立心肌缺血模型，对照组颈背部sc等体积生理盐水。第5周开始各给药组分别ig尼可地尔片、芪参益气滴丸或ip EX-527。对照组和模型组ig等体积纯水，给药干预2周后取材。

2.2 血清cTnI、CK-MB、ET-1、vWF、NO检测

实验结束后摘眼球取血，收集血液静置后，4 ℃、3500 r/min离心15 min，取上清，按照试剂盒说明书测定各组小鼠血清中cTn-I、CK-MB、ET-1、vWF、NO含量。

2.3 心脏病理染色

实验结束后，迅速摘取心脏，将心脏置于4%中性多聚甲醛溶液中固定48 h。然后进行组织脱水、石蜡包埋、切片。每组小鼠心脏进行苏木素-伊红（HE）染色、Masson染色，切片扫描仪观察各组心脏病理变化及胶原纤维沉积情况。采用Image-Pro Plus软件半定量分析心脏纤维化面积比值。

2.4 心脏TUNEL染色

每组选取6个小鼠心脏组织进行TUNEL染色，观察各组小鼠心肌细胞凋亡情况。将制备好的石蜡切片脱蜡、水化后，与蛋白酶K孵育20 min，PBS清洗3次。将切片与荧光标记液和TdT酶置于37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3次，苏木素复染核。于切片扫描仪下随机选取8个视野，采用Image-Pro Plus软件统计绿色荧光细胞核的面积比。

2.5 心脏免疫组化染色

每组选取6个小鼠切片进行CD31免疫组化染色，观察心脏血管表达变化。于切片扫描仪下随机选取8个视野，采用Image-Pro Plus软件统计棕褐色阳性血管面积占比。

2.6 Western blotting检测心脏eNOS、pT495-eNOS、pS1177-eNOS和Sirt1蛋白表达

提取心脏组织蛋白，BCA测试盒定量蛋白浓度。蛋白样品在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上分离并转膜。采用5%脱脂牛奶或5%牛血清白蛋白溶液室温封闭1 h，4 ℃孵育eNOS、pS1177-eNOS、pT495-eNOS、Sirt1、GAPDH抗体过夜，次日TBST洗膜，室温孵育二抗1 h。化学发光成像系统检测蛋白条带，采用Quantity One软件统计相对蛋白灰度值。

2.7 心脏免疫荧光共染

每组选取3个小鼠心脏切片进行Sirt1和eNOS免疫荧光共染，观察心脏Sirt1和eNOS的定位和相互作用。在切片扫描仪下随机选取10个视野，采用Image-Pro Plus软件统计Sirt1和eNOS互作的橙黄色面积占比。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠心功能的影响

如图1所示，小鼠注射链脲霉素后第8、10、11天检测的空腹血糖值均显著大于对照组（＜0.01），并且第10、11天小鼠空腹血糖均＞11.1 mmol/L，同时观察到注射链脲霉素后小鼠出现多饮、多尿、多食、体质量减轻的“三多一少”典型症状，说明2型糖尿病模型成功。

与对照组比较：**P＜0.01，下图同

如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠血清cTnI水平和CK-MB活性均明显升高（＜0.01）；与模型组比较，尼可地尔片组和芪参益气滴丸低、高剂量组cTnI水平和CK-MB活性显著降低（＜0.01）；与芪参益气滴丸低剂量组比较，芪参益气滴丸＋EX-527组血清中cTnI水平明显升高（＜0.01），CK-MB活性无显著差异。结果表明，芪参益气滴丸能抑制糖尿病心肌缺血小鼠心功能损伤。

NT-尼可地尔片 QSYQ-芪参益气滴丸 与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与芪参益气滴丸低剂量组比较：&&P＜0.01，下图同

3.2 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠心脏病理变化的影响

各组小鼠心脏形态拍照和HE、Masson染色结果见图3，对照组小鼠心脏形态饱满，充血发红，心肌纤维结构完整，排列整齐，蓝色胶原纤维沉积极少。模型组小鼠心脏表面可见明显凹陷，心肌缺血发白，心肌纤维排列紊乱，肌纤维缺失明显，肌间隙增大，存在大量蓝色胶原纤维积聚。与模型组比较，尼可地尔片组和芪参益气滴丸低、高剂量组小鼠心脏均有不同程度的改善。与芪参益气滴丸低剂量组比较，芪参益气滴丸＋EX-527组心脏缺血发白，肌纤维排列稍显紊乱，肌间隙加大，心肌纤维部分缺失，胶原纤维含量有所提升。表明芪参益气滴丸可以有效逆转糖尿病小鼠缺血心脏病变。

图3 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠心脏结构的影响 (×400)

3.3 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠心肌细胞凋亡的影响

TUNEL荧光染色结果见图4，绿色荧光细胞核为凋亡的心肌细胞。与对照组比较，模型组小鼠心肌细胞凋亡数量明显增加（＜0.01）；与模型组比较，尼可地尔片组和芪参益气滴丸低、高剂量组小鼠心肌凋亡数量明显减少（＜0.01）；与芪参益气滴丸低剂量组比较，芪参益气滴丸＋EX-527组心肌细胞凋亡数目显著增加（＜0.01）。说明芪参益气滴丸具有抑制糖尿病心肌缺血损伤小鼠心肌凋亡的作用。

3.4 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠血管新生和内皮功能的影响

免疫组化染色和内皮功能相关因子ELISA测定结果见图5，与对照组比较，模型组心脏CD31及血清ET-1、vWF、NO水平均显著降低（＜0.01）；与模型组比较，尼可地尔片组和芪参益气滴丸低、高剂量组心脏CD31及血清ET-1、NO水平均明显增加（＜0.01），芪参益气滴丸低剂量组vWF水平明显增加（＜0.01），芪参益气滴丸高剂量组vWF水平明显降低（＜0.05）；与芪参益气滴丸低剂量组比较，芪参益气滴丸＋EX-527组相关因子水平均显著下调（＜0.01）。

图4 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠心肌凋亡的影响(×400;, n = 6)

图5 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠心脏血管新生(A) 和内皮功能(B) 的影响(×400;, n = 6)

3.5 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠心脏Sirt1和eNOS蛋白表达的影响

如图6所示，与对照组比较，模型组小鼠心脏Sirt1、eNOS表达明显降低（＜0.01），pT495-eNOS水平明显升高（＜0.01），pS1177-eNOS水平无显著性差异。与模型组比较，尼可地尔片组心脏Sirt1表达显著增加（＜0.01），pT495-eNOS和eNOS表达明显降低（＜0.01）；芪参益气滴丸低、高剂量组心脏Sirt1、eNOS表达均显著升高（＜0.01），pT495-eNOS水平显著降低（＜0.01）；芪参益气滴丸高剂量组心脏pS1177-eNOS水平显著降低（＜0.01）；与芪参益气滴丸低剂量组比较，芪参益气滴丸＋EX-527组小鼠心脏的Sirt1和eNOS表达均显著降低（＜0.01）。

图6 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠心脏Sirt1和eNOS蛋白表达的影响(, n = 6)

3.6 芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血损伤小鼠心脏Sirt1与eNOS共定位的影响

免疫荧光共染结果见图7，红色荧光标记Sirt1，绿色荧光标记eNOS，蓝色荧光标记细胞核。对照组小鼠心脏组织中可见Sirt1大量表达于细胞质中，eNOS大部分表达在细胞质的血管内皮中，胞质中存在大量橙色荧光，说明Sirt1与eNOS共定位增多。与对照组比较，模型组小鼠心脏组织中Sirt1和eNOS共定位减少。与模型组比较，芪参益气滴丸低剂量组心脏组织中Sirt1和eNOS共定位增加，而EX-527能够逆转芪参益气滴丸对Sirt1和eNOS的共定位。

箭头表示Sirt1和eNOS共定位

4 讨论

糖尿病是心血管病的独立危险因素，由血糖升高所致血管病变引起的冠心病、心绞痛、心肌梗死、缺血性脑血管病是糖尿病致残致死的首要病因[15-16]。芪参益气滴丸是治疗气虚血瘀型冠心病心绞痛的中成药[17]，由黄芪、丹参、三七、降香油制成，具有益气通脉、活血止痛之功[18]。研究发现，激活Sirt1信号能通过抗炎抗氧化、抑制心肌凋亡，改善大鼠心肌缺血损伤[19]。eNOS是血管内皮特异蛋白，对维持血管内稳态至关重要，目前有关Sirt1与eNOS表达改变及二者互作对糖尿病合并心肌梗死的调控机制尚不清楚。本研究证实芪参益气滴丸抑制糖尿病缺血心脏病变、减少心肌凋亡、促进血管再生，保护血管内皮功能，改善缺血心功能，而芪参益气滴丸介导的治疗作用可能与促进内皮功能因子及NO释放，增加Sirt1与eNOS相互作用有关。

cTn-I和CK-MB是评估心肌受损的标记物，二者活性变化常提示心脏功能异常[20]。cTn-I主要表达在心肌组织，抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合，在心肌收缩和舒张过程中发挥重要作用，当心肌细胞受损时血清中cTn-I含量显著升高，是诊断心肌受损的高灵敏性和特异性指标[21]。CK-MB是心肌特有的肌酸激酶，参与细胞内能量转运、肌肉收缩、提供心肌产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）[22]，当血液CK-MB活性剧烈上升，预示有发生心肌梗死、心肌损伤、心包炎等疾病的风险。本研究结果提示糖尿病心肌缺血小鼠血清中cTn-I水平和CK-MB活性显著提升，说明心肌细胞受损严重，给予芪参益气滴丸明显降低糖尿病心肌缺血模型小鼠血清中cTn-I水平和CK-MB活力，表明芪参益气滴丸能有效改善心肌缺血损伤。

ET-1是长效血管收缩调节因子，对维持血管张力与心血管系统稳态起重要作用，ET-1已成为冠状动脉疾病、心肌梗死和心力衰竭的预测因子和预后标志物[23]。vWF是一种糖蛋白，在血管损伤期间介导血小板黏附到内皮下层，稳定凝血因子发挥止血作用，vWF在血管系统中还介导血管炎症、渗透和血管新生作用[24]。因此，ET-1、vWF变化是反映血管内皮功能的关键指标。本研究结果说明，糖尿病心肌缺血损伤小鼠血液中ET-1和vWF水平均显著减少，芪参益气滴丸能提升ET-1、vWF水平，保护血管内皮功能。此外，EX-527逆转芪参益气滴丸的作用，说明芪参益气滴丸保护糖尿病血管内皮损伤可能与Sirt1有关。

内源性NO是调节血管功能的重要因子，由eNOS催化-精氨酸和多种辅因子产生[25]。在血管壁，内皮细胞的eNOS合成NO调控血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）舒张，介导血管新生，抑制VSMC增殖，NO扩散至血管腔能抑制血小板聚集及血栓形成。NO生物利用度降低会引起内皮功能障碍，触发一系列心血管事件，如脑卒中、心肌梗死、冠状动脉血运重建和不稳定型心绞痛[26]。eNOS是钙调蛋白依赖性二聚体酶，eNOS的丝氨酸1177（Ser1177）、Ser116、Ser635和Ser613位点磷酸化调控eNOS激活，而苏氨酸495（Thr495）和酪氨酸657（Tyr657）位点磷酸化则抑制eNOS功能[27]。生理条件下，eNOS可预防病理性血管重塑、高血压、动脉粥样硬化和心脏并发症[28]。糖尿病和缺血性心脏病患者中发现eNOS活性和NO含量降低，引发内皮功能、外周和冠状动脉血管新生障碍[29]。本研究结果显示糖尿病心肌缺血小鼠中eNOS和NO水平降低，eNOS的Thr495磷酸化位点提升，缺血心脏血管新生功能降低，反映糖尿病血管内皮功能障碍，与文献报道一致[30-31]。

研究发现，Sirt1可促进NO产生，减轻炎症，降低氧化应激，诱导自噬，延缓衰老，抑制血管老化和动脉粥样硬化进程。内皮细胞的Sirt1通过去乙酰化在转录和转录后水平调节eNOS，产生NO以保护血管，而NO反过来也能正向调控Sirt1[32]。说明Sirt1与eNOS之间存在动态调节，这对维持内皮功能和血管重塑十分重要。另外，Sirt1抑制内皮Notch信号和调节FoxO1活性，激活eNOS诱导内皮依赖性舒张，促进血管生成和缺血后新生血管形成。糖尿病心肌缺血损伤减弱eNOS活性和NO生成，而上调Sirt1能提高eNOS活性和NO生物利用度，降低糖尿病心肌损伤[33-34]。因此，通过促进Sirt1与eNOS相互作用，激活eNOS磷酸化及NO释放，保护血管内皮功能是糖尿病缺血性心脏病的重要治疗策略。本研究证实，芪参益气滴丸提高Sirt1和eNOS表达，增加Sirt1与eNOS共定位，提示芪参益气滴丸可能通过调控Sirt1与eNOS互作，促进糖尿病心肌缺血损伤修复再生。

本文初步探究了芪参益气滴丸对糖尿病心肌缺血小鼠心脏中Sirt1与eNOS相互作用关系，eNOS活性和NO生成，以及血管内皮、心脏功能的影响。结果证实，芪参益气滴丸可能通过上调Sirt1、eNOS水平，增加Sirt1与eNOS互作，提高NO生物利用度，从而稳定内皮功能，促进血管新生，抑制心肌纤维化和凋亡，改善心脏功能，使气虚自复、瘀祛络通，揭示芪参益气滴丸改善糖尿病心肌缺血损伤、血管内皮功能障碍及血管新生的机制，为中药复方干预治疗糖尿病心病气虚血瘀证提供科学依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Qishen Yiqi Droplet promotes repair and regeneration of diabetes myocardial ischemia injury by regulating interaction of Sirt1 and eNOS

LIU Xin1, LIU Tian-tian1, YAO Kui-wu2, ZHANG Yan-li1, GONG Ying1, GU Yuan-yuan1, CAO Jun-ling1, 3

1. Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100078, China 2. Eye Hospital, Chinese Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100040, China 3. Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China

To explore the mechanism of Qishen Yiqi Droplet (芪参益气滴丸) on vascular endothelial function and angiogenesis in diabetes mice with myocardial ischemia injury.A total of 102 male C57BL/6J mice were randomly divided into control group, model group, Nicorandil Tablet (尼可地尔片, 4.55 mg/kg) group, Qishen Yiqi Droplet low-, high-dose (227.5, 455.0 mg/kg) groups and Qishen Yiqi Droplet (227.5 mg/kg) + EX-527 (10 mg/kg) group. In the second week, the control group was fed with normal diet, and the other groups were fed with high-fat diet. In the third week, streptozotocin (50 mg/kg) was intraperitoneally injected for 7 d to establish the model of type 2 diabetes. The control group was injected with equal dose of normal saline. At the fourth week, the model group and each administration group mice were subcutaneously injected with isoproterenol hydrochloride (100 mg/kg) on the nape of the neck for five consecutive days, while the control group mice were subcutaneously injected with the same volume of normal saline. After 14 d of drug intervention in the fifth week, serum was taken to measure cardiac troponin I (cTn I), creatine kinase MB isoenzyme (CK-MB), nitric oxide (NO), endothelin 1 (ET-1) and von willebrand factor (vWF) contents; Cardiac morphology, collagen fiber ratio, myocardial apoptosis and angiogenesis were detected by pathological staining; Western blotting was used to detect the expressions of silence information regulator 1 (Sirt1), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), phosphorylation of Thr495-eNOS (pT495-eNOS) and phosphorylation of Ser1177-eNOS (pS1177-eNOS) proteins in cardiac tissue. Immunofluorescence double staining was used to detect the co-localization of Sirt1 and eNOS in the heart.Compared with control group, cTnI level and CK-MB activity in serum of mice in model group were significantly increased (< 0.01), while the levels of ET-1, vWF, and NO were significantly reduced (< 0.01); Myocardial cells were disordered, muscle fibers were missing, muscle space was enlarged, myocardial fibrosis area and myocardial apoptosis number were significantly increased (< 0.01), the number of new blood vessels labeled by platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31) was significantly reduced (< 0.01), the expressions of Sirt1 and eNOS in heart were reduced (< 0.01), level of pT495-eNOS was increased (< 0.01), the co-localization of Sirt1 and eNOS was reduced. After intervention, Qishen Yiqi Droplet showed significant protective effects, and the addition of EX-527 could partially reverse the effect of Qishen Yiqi Dropping Pills.Qishen Yiqi Droplet can promote the repair of myocardial ischemia injury in diabetes by up-regulating the levels of Sirt1 and eNOS, increasing the interaction between Sirt1 and eNOS, improving the bioavailability of NO, protecting endothelial function, improving angiogenesis, inhibiting myocardial fibrosis and myocardial apoptosis.

Qishen Yiqi Droplet; diabetes; myocardial ischemia; angiogenesis; endothelial function; Sirt1; eNOS

R285.5

A

0253 - 2670(2023)14 - 4564 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.017

2023-02-28

国家自然科学基金青年科学基金项目（82104627）；中央高校基本科研业务费专项（2022-JYB-XJSJJ-065）

刘 鑫，女，硕士研究生，研究方向为中药防治心血管病的作用机制。E-mail: 1428382783@qq.com

刘甜甜（1989—），博士，主管药师，研究方向为中药防治心血管病的作用机制。E-mail: liutiantian008@126.com

曹俊岭（1972—），博士生导师，主任药师，研究方向为中药安全性及合理用药。E-mail: caojunling72@163.com

[责任编辑 李亚楠]