UPLC指纹图谱多模式识别结合多指标成分测定的清热消炎宁胶囊质量控制研究

韦卓纯，林 绘，彭 颖，张卉青，李 健

UPLC指纹图谱多模式识别结合多指标成分测定的清热消炎宁胶囊质量控制研究

韦卓纯，林 绘，彭 颖，张卉青，李 健

东莞市滨海湾中心医院，广东 东莞 523905

建立清热消炎宁胶囊（Qingre Xiaoyanning Capsules，QXC）UPLC指纹图谱及多指标成分定量分析方法，结合化学模式识别技术对多批次制剂进行质量评价。通过优化样品前处理及色谱检测方法，建立合适UPLC指纹图谱和含量测定条件。色谱柱为UPLC HSS T3柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱；检测波长280 nm；柱温40 ℃；体积流量0.5 mL/min。采用层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和聚类热图分析对20批清热消炎宁胶囊进行质量评价。清热消炎宁胶囊UPLC指纹图谱及含量测定方法学考察结果均符合测定要求，获得21个共有峰，运用对照品比对方式指认了7个色谱峰；20批样品的相似度均大于0.954，样品间一致性及稳定性良好；由HCA可知，20批样品可大致聚成2类；PCA从21个共有峰中提取了4个主成分，通过OPLS-DA筛选了迷迭香酸、绿原酸、隐绿原酸、丹参素钠、新绿原酸等8个影响样品质量差异性较大的化合物；7个定量成分线性关系均良好（≥0.999 8），平均加样回收率98.41%～101.18%，RSD均不大于1.81%；聚类热图分析结果表明，20批样品可聚为2类。建立的同一色谱条件下的清热消炎宁胶囊UPLC指纹图谱结合多指标成分定量方法专属性强、简便、准确，可为其整体质量控制和品质评价提供参考依据。

清热消炎宁胶囊；UPLC指纹图谱；聚类分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判别分析；定量分析；聚类热图分析；质量控制；迷迭香酸；绿原酸；隐绿原酸；丹参素钠；新绿原酸

清热消炎宁胶囊（Qingre Xiaoyanning Capsules，QXC）为肿节风经水提取加工而成的清热解毒类中成药制剂[1]，临床疗效确切，安全性良好，主要含有咖啡酰类衍生物、香豆素、有机酸、黄酮、倍半萜、多糖等多种化学成分[2-3]。目前，QXC没有统一的国家质量标准，部颁标准质量控制仅有【鉴别】和【检查】两项[1]，其他质量控制近几年未见大的突破，主要针对指标成分异嗪皮啶及活性成分迷迭香酸进行含量测定[4-5]，检测方法均采用常规的HPLC法，暂时未见QXC的指纹图谱研究报道，故QXC现行质量标准较为低下，测定一种或两种指标成分不能有效保证其质量，有必要探索整体质量控制模式研究。中药指纹图谱具有整体性强、专属性高、分析手段丰富等特点，能表征被测样品主要化学成分的整体特征，确保其内在质量的均一和稳定等[6-7]，现已广泛应用于中药及中成药制剂的整体质量评价研究[8-12]。本实验在前期对QXC化学成分检识分析的基础上[3]，首次采用UPLC法建立20批次制剂指纹图谱，标定了21个共有峰，指认了其中7个色谱峰，进而借助化学计量学方法对多批次制剂进行质量评价，根据正交偏最小二乘-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）差异性成分筛选及前期入血成分研究结果[13]，定量分析了涵盖有机酸、咖啡酰类衍生物、香豆素的7个化学成分，以期为QXC的整体质量控制及质量标准的进一步提升提供有效的参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters Acquity UPLC H-Class型超高效液相色谱仪，配有四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、柱温箱、PDA测器和Empower 3色谱工作站，美国Waters公司；SQP型万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；XPE26型百万分电子天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；DC400型超声仪，东莞市大朗速洁超声设备制造厂；2-16N型高速离心机，湖南恒诺仪器设备有限公司；明澈TM-D 24UV型超纯水系统，默克密理博实验室设备（上海）有限公司。

1.2 试剂与药物

甲醇，分析纯，广东光华科技股份有限公司；乙腈（HPLC色谱级）、甲醇（HPLC色谱级）、甲酸（HPLC色谱级）为Fisher公司；水为实验室超纯水系统制备所得。对照品原儿茶酸（批号PS012604，质量分数98.2%）、丹参素钠（批号PS010590，质量分数98.0%）、新绿原酸（批号PS000974，质量分数98.0%）、隐绿原酸（批号PS001110，质量分数98.0%）、异嗪皮啶（批号PS012652，质量分数99.7%），上述5个对照品购自成都普思生物科技股份有限公司；对照品绿原酸（批号5077，质量分数98.1%）、迷迭香酸（批号5828，质量分数98.3%），上述2个对照品购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。前期收集QXC制剂共20批，其中样品S1～S13生产厂家为广州白云山敬修堂药业股份有限公司，样品S14～S20生产厂家为广东五虎山药业有限公司，具体信息见表1。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 将QXC内容物混匀、研细，取0.25 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 60%甲醇，密塞，称定质量，超声45 min（功率400 W、频率40 kHz），放冷，再次称定质量，减失的质量用60%甲醇补足，摇匀，静置，取上清液，12 000 r/min离心10 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取“1.2”项下7种对照品适量，分别置于10 mL棕色量瓶中，用纯甲醇溶解，摇匀，定容配制成母液；分别精密吸取上述各母液适量制成含原儿茶酸19.26 μg/mL、丹参素钠29.31 μg/mL、新绿原酸8.30 μg/mL、隐绿原酸7.49 μg/mL、异嗪皮啶16.62 μg/mL、绿原酸15.31 μg/mL、迷迭香酸39.67 μg/mL的混合对照品溶液。

表1 20批QXC样品

2.2 色谱条件

色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～1.0 min，2%乙腈；1.0～4.0 min，2%～6%乙腈；2.0～9.0 min，6%～16%乙腈；9.0～13.0 min，16%～20%乙腈；13.0～15.0 min，20%～25%乙腈；15.0～16.0 min，25%乙腈；16.0～16.1 min，25%～2%乙腈；检测波长为280 nm；体积流量0.5 mL/min；柱温40 ℃；进样量1 μL。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 按“2.1.1”项下方法制备QXC供试品溶液（S4），按“2.2”项下色谱条件连续6次进样测定，以异嗪皮啶为参照峰，得到21个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.10%～0.21%和0.22%～1.78%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批QXC样品（S4），按“2.1.1”项下方法，分别平行制备6份QXC供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以异嗪皮啶为参照峰，得到21个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.12%～0.37%和0.99%～2.02%，结果表明样品处理方法具有良好的重复性。

2.3.3 稳定性试验 取QXC的供试品溶液（S4），按“2.2”项下色谱条件，在0、2、6、12、24、36、48 h分别进样测定，以异嗪皮啶为参照峰，得到21个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.12%～0.97%和1.26%～2.47%，表明供试品溶液在室温下48 h内稳定。

2.4 UPLC指纹图谱的建立

按“2.1.1”项下方法制备20批QXC供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，将20批QXC UPLC图谱色谱峰积分转为AIA格式，利用《中药色谱指纹图谱相似度软件评价系统（2012版）》对数据进行处理，以样品S1为参照图谱，时间窗宽度设置为0.1 min，采用中位数法，通过多点校正进行峰匹配，建立了20批QXC UPLC指纹图谱，在此基础上生成对照指纹图谱（图1），并进行相似度评价，结果20批QXC样品（S1～S20）的相似度分别为0.991、0.983、0.993、0.993、0.986、0.992、0.999、0.997、0.995、0.994、0.979、0.996、0.954、0.998、0.976、0.993、0.972、0.999、0.971、0.998，20批QXC与其对照图谱的相似度在0.954～0.999，表明2个厂家不同批次样品一致性及稳定性良好。经过全峰匹配后确定了21个共有峰，与混合对照品溶液比对，指认了7个共有峰（图2），根据保留时间先后顺序依次为峰4（原儿茶酸）、5（丹参素钠）、9（新绿原酸）、10（绿原酸）、11（隐绿原酸）、14（异嗪皮啶）、20（迷迭香酸），其中，异嗪皮啶是QXC原料药肿节风的特征指标成分[14]，故选择其作为参照峰。

2.5 化学模式识别分析

2.5.1 层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 以14号峰（异嗪皮啶）为参照峰，将20批QXC样品的21个共有峰的相对峰面积（表2）导入SIMCA 14.1软件进行HCA，由结果知，20批QXC整体分为2类，其中来自广东五虎山药业有限公司的7批样品（S14～S20）聚为第1类，其余来自广州白云山敬修堂药业股份有限公司的13批样品（S1～S13）聚为第2类，详见图3，QXC质量受到原料、提取工艺、炮制加工、生产等多方面环节的影响，根据聚类分析结果，考虑除了原料影响外，不同厂家的提取工艺、生产等也是影响制剂质量的重要原因，而对于总体聚成2大类的其他具体原因仍需进一步研究。

图1 20批QXC样品(S1～S20)的UPLC指纹图谱(A)和对照指纹图谱(B)

4-原儿茶酸 5-丹参素钠 9-新绿原酸 10-绿原酸 11-隐绿原酸 14-异嗪皮啶 20-迷迭香酸

表2 20批QXC21个共有峰的相对峰面积值

2.5.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 以14号峰（异嗪皮啶）为参照峰，将20批QXC的21个共有峰的相对峰面积（表2）导入SIMCA 14.1软件进行PCA，PCA特征值及方差贡献率见表3，结果知前4个主成分的特征值均大于1，累积贡献率达87.5%，可反映QXC指纹图谱共有峰的基本信息。由PCA得分图（图4）知PCA结果与HCA结果基本一致，20批样品大致分为2大类，第1类样品主要来自五虎山药业有限公司，第2类样品主要来自广州白云山敬修堂药业股份有限公司。

图3 20批QXC的HCA结果

表3 QXC样品主成分方差贡献率和特征值

图4 20批QXC的PCA得分图

2.5.3 正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 结合HCA和PCA，20批样品大致可分为2组，为进一步寻找组间的差异性原因，采用OPLS-DA建立分析模型。结果表明模型稳定性（R2）达到0.853，模型解释率（R2）达到0.94，预测力（2）达到0.872，表明建立的OPLS-DA模型稳定且预测能力较强。对OPLS-DA模型进行置换检验（200次），得置换检验图（图5）。在图5中，2在轴的截距为0.421，2在轴的截距为−0.871，斜率均大于0，表明建立的OPLS-DA模型无过度拟合的现象，能够用于20批样品组间差异的判别分析。OPLS-DA模型生成的变量重要性投影（VIP）值见图6，VIP值是筛选差异性化合物的重要指标，通常以VIP值大于1作为筛选标准，VIP值越高，对组间差异的影响越大。本实验以VIP＞1为标准，结果共找到了8个成分，根据VIP值大小排序依次为20号峰（迷迭香酸）＞16号峰＞2号峰＞10号峰（绿原酸）＞19号峰＞11号峰（隐绿原酸）＞5号峰（丹参素钠）＞9号峰（新绿原酸），提示这8个成分是引起不同批次QXC差异的主要标志性成分。

2.6 多指标成分的含量测定

2.6.1 色谱条件 色谱条件同“2.2”项。

2.6.2 供试品溶液的制备 供试品溶液的制备方法同“2.1.1”项。

图5 OPLS-DA置换检验图

图6 20批QXC的OPLS-DA得分图(A)和VIP图(B)

2.6.3 混合对照品溶液的制备 分别精密称取“1.2”项下7种对照品适量，分别置于棕色量瓶中，用纯甲醇溶解，摇匀，定容配制成母液；分别精密吸取上述各母液适量制成含原儿茶酸51.905 μg/mL、丹参素钠216.646 μg/mL、新绿原酸51.645 μg/mL、隐绿原酸101.478 μg/mL、异嗪皮啶85.064 μg/mL、绿原酸132.984 μg/mL、迷迭香酸299.186 μg/mL的混合对照品溶液1。

2.6.4 专属性考察 分别精密吸取60%甲醇、混合对照品溶液及供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图（图2），结果表明，供试品中7个定量成分均与相邻峰的分离度良好（均大于2.0）；空白溶剂对测定无干扰，说明方法的专属性良好。

2.6.5 线性关系及检测限、定量限考察 依次精密吸取“2.6.2”项下的混合对照品溶液1适量，分别置于2、5、10、50、100、200 mL量瓶中，加纯甲醇定容至刻度、摇匀，得7个不同质量浓度系列混合对照品溶液，分别按“2.2”项下色谱条件进样分析，并记录上述7个成分的峰面积，以峰面积为纵坐标（）、质量浓度为横坐标（）进行线性回归分析，得到QXC中7个定量成分的回归方程、相关系数和线性范围分别为原儿茶酸＝2 912.595＋211.274，＝0.999 9，线性范围0.519～51.905 μg/mL；丹参素钠＝1 310.550＋391.515，＝0.999 8，线性范围2.166～216.646 μg/mL；新绿原酸＝2 946.539＋408.317，＝0.999 8，线性范围0.516～51.645 μg/mL；绿原酸＝3 195.288＋623.986，＝0.999 8，线性范围1.330～132.984 μg/mL；隐绿原酸＝ 2 893.893＋673.930，＝0.999 8，线性范围1.015～101.478 μg/mL；异嗪皮啶＝1 803.268＋451.271，＝0.999 8，线性范围0.851～85.064 μg/mL；迷迭香酸＝3 556.987＋1 741.879，＝0.999 8，线性范围2.992～299.186 μg/mL；结果表明7个定量成分在线性范围内线性关系良好。以最低质量浓度的对照品溶液逐级稀释，以信噪比为3的质量浓度作为检测限，结果检测限分别为0.165、0.472、0.189、0.149、0.197、0.282、0.186 μg/mL；以信噪比为10的质量浓度作为定量限，结果定量限分别为0.369、0.868、0.266、0.231、0.229、0.463、0.620 μg/mL。

2.6.6 精密度试验 按“2.1.1”项下方法制备QXC供试品溶液（S4），按“2.2”项下色谱条件连续6次进样测定，分别计录所含原儿茶酸、丹参素钠、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的峰面积并计算其RSD，结果测得上述7个定量成分峰面积的RSD分别为1.42%、0.16%、0.39%、0.15%、0.18%、0.55%、0.22%，表明该方法仪器精密度良好。

2.6.7 重复性试验 取同一批QXC样品（S4），按“2.1.1”项下方法分别平行制备6份QXC供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，分别计算QXC所含原儿茶酸、丹参素钠、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的质量分数并计算其RSD，结果测得上述7个定量成分质量分数的RSD分别为0.65%、0.32%、1.04%、1.38%、0.75%、1.94%、0.71%，表明该方法重复性良好。

2.6.8 稳定性试验 取QXC供试品溶液（S4），按“2.2”项下色谱条件，在0、2、6、12、24、36、48 h分别进样测定，计录所含原儿茶酸、丹参素钠、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的峰面积并计算其RSD，结果测得上述7个定量成分峰面积的RSD分别为1.01%、1.63%、1.02%、0.65%、0.53%、1.50%、0.81%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.6.9 加样回收率试验 取同一批QXC样品（S4）共6份，每份0.125 g，精密称定，分别按已知指标成分含量的100%加入原儿茶酸、丹参素钠、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸混合对照品溶液，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，上述7个成分的平均加样回收率分别为98.92%、99.93%、98.41%、100.45%、99.70%、98.39%、101.18%，RSD分别为1.10%、1.81%、1.25%、1.22%、1.60%、1.12%、0.92%，均不超过1.81%，表明该方法准确度良好。

2.6.10 样品测定 按“2.1.1”项下方法制备20批QXC供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算7个成分的质量分数，结果见表4。结果20批QXC中原儿茶酸、丹参素钠、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸的质量分数分别为0.284～0.948、1.868～3.758、0.493～1.178、1.002～2.278、0.672～1.744、0.456～0.821、1.943～5.282 mg/g，初步提示不同批次样品中各成分质量分数存在一定的差异，7个成分质量分数上下波动范围均不超过3.3倍，其中异嗪皮啶质量分数波动范围最小。

对比2个不同生产厂家数据，7个定量成分质量分数（mg/g）均值分别如下：原儿茶酸（白云山五虎山）：（0.6010.572），丹参素钠（白云山五虎山）：（2.6543.095），新绿原酸（白云山五虎山）：（0.7760.893），绿原酸（白云山五虎山）：（1.4451.696），隐原酸（白云山五虎山）：（1.0731.250），异嗪皮啶（白云山五虎山）：（0.5950.599），迷迭香酸（白云山五虎山）：（3.8654.197），采用SPSS 26.0软件对2个厂家QXC 7个定量成分含量均值进行检验，结果值为0.797（＞0.05），表明2个厂家QXC多指标成分含量均值无显著性差异。为更好的展示各批次同一成分含量差异，将20批QXC中7个定量成分的含量测定结果数据导入Hiplot科研绘图平台（https://hiplot.com. cn/），选择“Word.D2”法，设置距离度量为“euclidean”，并选择“按行标准化”处理，绘制聚类热图，结果见图7（图中颜色由蓝到红代表含量由低到高），结果表明20批样品大致可聚成2大类，其中S17、S12、S18、S20、S19、S8、S9、S13、S15 9批聚为第1类，其余11批样品聚为第2类，第1类样品主要来自广东五虎山药业有限公司，第2类样品除S14和S16外，均来自广州白云山敬修堂药业股份有限公司，基本佐证了指纹图谱聚类分析的结果。

表4 20批QXC中7个定量成分的含量测定结果

图7 26批QXC7个定量成分含量的聚类热图分析

另外，由聚类热图结果知来自第1类的样品丹参素钠、新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸等4个成分的含量相对较高，来自第2类的样品丹参素钠、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量相对较低，提示这4个成分对样品间分组有显著影响，而这4个成分均来自指纹图谱OPLS-DA筛选的差异性成分，二者相互吻合。

3 讨论

3.1 样品前处理考察

本实验前期通过比较水、60%甲醇、甲醇、70%乙醇和乙醇作为提取溶剂的UPLC图谱，发现以60%甲醇作为提取溶剂色谱峰信息较为丰富且峰面积相对较大，故选用60%甲醇作为提取溶剂。通过比较超声提取，加热回流提取和冷浸提取3种不同提取方式的UPLC图谱，发现冷浸提取效果较超声提取和加热回流提取差，而超声提取和加热回流提取差别不大，考虑实验操作的简便性和可行性，故选择超声提取法。通过比较不同提取时间下的UPLC图谱，发现各色谱峰峰面积都随着提取时间的增加而增加，但是45、60 min变化不大，为保证样品提取完全且操作简化性、节能等原则，故选择超声45 min。

3.2 色谱条件优化

实验前期对不同的色谱柱［HSS T3柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Cortecs C18（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）］进行了考察，结果BEH C18色谱柱前端3 min前分离较好，但3 min后色谱峰的分离度没有HSS T3柱好，Cortecs C18柱整体分离度没有HSS T3柱好，因此选择HSS T3柱。分别考察比较甲醇-水系统、甲醇-水（含0.1%甲酸）系统、甲醇-水（含0.1%冰乙酸）系统、乙腈-水系统、乙腈-水（含0.1%甲酸）系统、乙腈-水（各含0.1%甲酸）系统、乙腈-水（含0.1%冰乙酸）系统，结果乙腈-水（含0.1%甲酸）色谱峰信号丰富且分离度相对较好，故选择乙腈-水（含0.1%甲酸）作为QXC指纹图谱的流动相梯度洗脱系统。通过PDA检测器在190～400 nm全波长扫描，结果280 nm色谱峰最多、基线噪音较低，各成分的分离情况相对较好，故选择280 nm作为检测波长。

3.3 参照峰的选择

异嗪皮啶为QXC原料药肿节风的特征指标成分，且出峰时间和峰面积适中，峰型较好，故选择其作为参照峰，结合20批样品的测定结果知异嗪皮啶质量分数波动范围最小，含量较为稳定，提示选择异嗪皮啶作为参照峰可减小因数据大幅度波动对实验结果的影响。

3.4 含量测定成分确定

本研究通过OPLS-DA分析找到了影响QXC质量的8个差异性较大的化合物，提示这些成分对样品分组有显著影响，并指认了其中5个，分别为迷迭香酸、丹参素钠、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸，初步将上述5个成分作为定量候选化合物。另外，结合课题组前期对QXC大鼠体内药代动力学研究结果显示原儿茶酸、异嗪皮啶、迷迭香酸均为入血原型成分[13]，提示可能为QXC药效物质基础，其中原儿茶酸具有抗炎[15]、抗菌[16]等药理活性，异嗪皮啶为原料药肿节风的特征指标成分，迷迭香酸与其他3个差异性化合物新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸均属咖啡酰类衍生物，有文献报道该类化合物具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等药理作用[17-20]，故将原儿茶酸、异嗪皮啶同时纳入定量分析，建立同时涵盖药理活性及特征成分的多成分含量测定方法。

3.5 质量控制策略

QXC现行质量标准及质量控制方法较为低下，目前尚未见开展指纹图谱的研究报道，不同以往文献报道研究仅选取单一指标异嗪皮啶或迷迭香酸进行质量控制，考虑中药制剂成分复杂，药理活性多样化，本实验采取“色谱指纹图谱＋多指标成分定量”的模式，并紧密结合化学模式识别技术进行分析评价。

本实验在运用中药指纹图谱表征QXC整体概貌的基础上，选择与临床疗效相关性强、以特征指标成分、药理活性成分、质量差异性成分作为定量评价指标，这样不仅丰富了QXC质量鉴别的检测方法，还可准确地标示与限定其成分种类、含量与配比等，克服了中药指纹图谱模糊性特点，保留其整体性特点，提供了一种多变量整体、精确评价QXC质量控制模式。

结果表明，20批QXC指纹图谱相似度较高，表明其质量在整体水平上具有较好的一致性，但不足以辨别差异性与质量优劣，进而借助CA、PCA、OPLS-DA等化学模式识别技术进行综合分析，20批样品大致分为2类，并筛选了8个质量差异性成分，指认了其中5个成分，以上3种方法结果互为验证，相互补充。

在此基础上，对OPLS-DA分析筛选并指认的5个质量差异性成分及原儿茶酸、异嗪皮啶等7个成分进行定量分析并进行聚类热图分析，20批样品大致聚为2类，结果可见基于指纹图谱和基于含量测定的20批次样品间分类基本一致，基于含量测定的聚类热图分析寻找组间差异性成分和指纹图谱OPLS-DA筛选的差异性成分基本吻合，提示本实验定量成分选择具有一定的合理性和可行性。

另外，因目前市面销售QXC多为广州白云山敬修堂药业股份有限公司产品，广东五虎山药业有限公司产品批次更新较慢，本次收集的2个厂家样品数目可能存在差异，尽管指纹图谱中HCA和PCA结果提示2个厂家的样品可能存在差异，但相似度结果显示2个厂家样品相似度均较高；定量分析方面，本实验同时纳入各厂家各定量成分质量分数均值指标，进一步减少组间样品数量对结果的影响，结果表明2个厂家QXC多指标成分含量均值无显著性差异。综合定性定量分析结果表明，2个厂家的多批次样品整体质量较为接近。

综上，本实验采用统一的色谱条件实现了指纹图谱定性和多成分定量的同时分析，建立的方法专属性强，可快速、准确地评价不同厂家不同批次QXC的质量差异和重点成分，从而为全面控制和整体评价该制剂质量提供科学依据及为其质量标准制定的规范化提供重要借鉴。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

[1] 《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂(第九册) [S]. 北京: 中华人民共和国卫生部药典委员会, 1994: 191.

[2] Li X, Zhang Y F, Zeng X,. Chemical profiling of bioactive constituents inand its preparations using ultra-high-pressure liquid chromatography coupled with LTQ Orbitrap mass spectrometry [J]., 2011, 25(17): 2439-2447.

[3] 韦卓纯, 林绘, 彭颖, 等. 基于UPLC-Q-TOF-MS技术的清热消炎宁胶囊化学成分分析 [J]. 今日药学, 2021, 31(10): 741-747.

[4] 骆维康, 黄湘穗, 刘文坚. RP-HPLC法测定清热消炎宁胶囊中异秦皮啶的含量 [J]. 中药材, 2003, 26(6): 439-440.

[5] 黎雄, 杨柳, 曾星, 等. HPLC测定清热消炎宁胶囊中异秦皮啶与迷迭香酸含量 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(11): 53-55.

[6] 姚令文, 刘燕, 郑笑为, 等. 指纹图谱、特征图谱技术在中药材和中成药中的应用 [J]. 中国新药杂志, 2018, 27(8): 934-939.

[7] 李佳涵, 王慧, 刘佳星, 等. 整合指纹图谱与多成分含量测定的酸枣仁汤质量评价研究 [J]. 中草药, 2022, 53(15): 4698-4708.

[8] 王东晗, 梁宇飞, 张欣欣, 等. 不同产地刺五加UPLC指纹图谱 [J]. 中成药, 2019, 41(6): 1343-1348.

[9] Li H, Gong X Q, Wang Z C,. Multiple fingerprint profiles and chemometrics analysis of polysaccharides from[J]., 2019, 123: 957-967.

[10] 吴学峰, 周熙, 黄晓兰, 等. 基于UPLC-Q-TOF MS的广佛手指纹图谱建立及炮制前后成分差异分析 [J]. 分析测试学报, 2022, 41(3): 299-308.

[11] 张涛, 张青, 易海燕, 等. 基于指纹图谱结合化学计量法对何首乌不同炮制品多指标成分分析 [J]. 中草药, 2022, 53(15): 4653-4662.

[12] 李硕, 俱蓉, 杨秀娟, 等. 红芪精准煮散饮片HPLC指纹图谱建立及3种指标成分测定 [J]. 中草药, 2022, 53(16): 5020-5025.

[13] Lin P, Dai Y, Yao Z H,. Metabolic profiles and pharmacokinetics of Qingre Xiaoyanning Capsule, a traditional Chinese medicine prescription of, in rats by UHPLC coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry [J]., 2019, 42(4): 784-796.

[14] 中国药典[S]. 一部. 2015: 223-224.

[15] Min S W, Ryu S N, Kim D H. Anti-inflammatory effects of black rice, cyanidin-3--beta--glycoside, and its metabolites, cyanidin and protocatechuic acid [J]., 2010, 10(8): 959-966.

[16] 林卫佳, 张亚平, 李峰, 等. 原儿茶酸抑制结核分枝杆菌Rv1654诱导肺泡巨噬细胞凋亡的机制研究 [J]. 中国临床药理学杂志, 2022, 38(15): 1747-1751.

[17] 林彤, 彭立生. 基于网络药理学和分子对接探讨肿节风的活性成分及药效机制 [J]. 中医药导报, 2020, 26(11): 106-111.

[18] Liu J X, Zhang Y, Hu Q P,. Anti-inflammatory effects of rosmarinic acid-4--β--glucoside in reducing acute lung injury in mice infected with influenza virus [J]., 2017, 144: 34-43.

[19] 李婉婷, 韦立群, 李清, 等. 迷迭香酸类似物-11通过EGFR-JNK通路抑制人胃癌MGC-803细胞增殖和迁移 [J]. 中国药理学通报, 2019, 35(4): 504-509.

[20] 潘力, 马秀丽, 黄中利, 等. 绿原酸体外抗新型鸭呼肠孤病毒作用的研究 [J]. 农业生物技术学报, 2020, 28(4): 754-760.

Quality control of Qingre Xiaoyanning Capsules based on multi-pattern recognition method of UPLC fingerprint and multi-index composition determination

WEI Zhuo-chun, LIN Hui, PENG Ying, ZHANG Hui-qing, LI Jian

Binhaiwan Central Hospital of Dongguan, Dongguan 523905, China

To establish the UPLC fingerprint and multi-component quantitative analysis of Qingre Xiaoyanning Capsules (清热消炎宁胶囊, QXC), at the same time, chemical pattern recognition technology was used to evaluate the quality of multiple batches of QXC.The sample pretreatment conditions and chromatographic analysis conditions of QXC were optimized, and the optimal UPLC fingerprint and multi-component quantitative analysis method were established. Column: UPLC HSS T3 column (50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm); mobile phase acetonitrile-water (containing 0.1% formic acid) with gradient elution; detection wavelengths 280 nm; column temperature 40 ℃; flow rate 0.5 mL/min. Cluster analysis (CA), principal components analysis (PCA), orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) and cluster heatmap analysis were applied for evaluating the quality of 20 batches of QXC.Methodological investigation of UPLC fingerprint and content determination were well verified and meeting the analysis requirements. A total of 21 common peaks were obtained by full peak matching, and seven of them were identified by comparing with the retention time of mixed reference substance. The similarity of 20 batches of samples was greater than 0.954, which showed good consistency and stability between the samples. Twenty samples could be classified into two clusters; Four principal components from 21 common peaks were extracted by PCA. Eight quality differential compounds were presented in the fingerprint by OPLS-DA, including rosmarinic acid, chlorogenic acid, 4-dicaffeoylquinic acid, salvianic acid A sodium, neochlorogenic acid and so on. The resolution and linear relationship of seven components in quantitative analysis were good. The average recovery rates were 98.41%—101.18% with RSD ≤ 1.81%. Results of cluster heatmap analysis showed that 20 batches of QXC also could be divided into two categories.In this study, the qualitative analysis of UPLC fingerprint and quantitative analysis of multiple index components based on the same chromatographic analysis conditions is specific, simple and accurate, which can provide a reference for the quality control and quality evaluation of QXC.

Qingre Xiaoyanning Capsules; ultra-performance liquid chromatography fingerprint; cluster analysis; principal components analysis; orthogonal partial least squares discriminant analysis; quantitative analysis; cluster heatmap analysis; quality control; rosmarinic acid; chlorogenic acid; 4-dicaffeoylquinic acid; salvianic acid A sodium; neochlorogenic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2023)15 - 4856 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.011

2023-02-20

东莞市社会发展科技项目（20211800900442）

韦卓纯，女，硕士，主管药师，研究方向为中药质量控制研究。Tel: (0769)85010062 E-mail:wzc2018666@163.com

[责任编辑 郑礼胜]