反向遗传学在冠状病毒疫苗研发领域的应用

汪梦俊 综述，申硕 审校

武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室，湖北 武汉 430207

冠状病毒（coronaviruses，CoV）是人类生命健康的一大威胁，由其引起的大流行已暴发过多起，以2019 年暴发的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）为例，因其具备极高的传染性、致病性及变异性，对全球各国经济及公共卫生安全造成了沉重的打击，截至2023 年5 月10 日，全球由SARS-CoV-2 导致的死亡人数已近700万人，与此同时，超过19种引起关切的变异株正在全球传播，包括α、β、γ及ο等［1］。

目前，应对SARS-CoV-2 疫情最有效的方式是通过疫苗接种建立群体免疫，阻断或减缓病毒在人群中的传播，降低发病率、重症率和病死率，进而结束病毒流行。但随着SARS-CoV-2 变异株的不断涌现而发生免疫逃逸，现有上市疫苗的保护效力正面临巨大挑战。新的、能够针对变异株的疫苗急需被研发。但现有的疫苗研发策略均存在一些问题。以灭活疫苗为例，尽管灭活疫苗具有安全、有效、免疫原性强等优点，但疫苗的生产条件要求较高，且合适候选疫苗株的获取较困难［2］。

针对目前SARS-CoV-2 疫苗研发过程中面临的一些问题，反向遗传学系统是一个极具潜力的工具，与经典遗传学相比，反向遗传学系统能够通过基因组修饰产生变异及重组病毒，快速、高效、定向地研究CoV 基因组不同区域或位点的生物学功能及作用机制，获得特定性状的重组毒株。了解病毒的致病机理及入侵机制，可以研究特定的疫苗接种方式，从而更高效地发挥疫苗的保护效力。在对SARS-CoV-2致病机理的研究中，实验人员利用反向遗传学系统将SARS-CoV-2的开放阅读框（open reading frame，ORF）7 替换为GFP 及GFP-nLuc 报告基因，通过重组病毒感染，证明了鼻腔对于SARS-CoV-2 的易感性，并推测鼻腔是介导病毒感染肺部的初始部位［3］，意味着鼻内给药可能是一种预防SARS-CoV-2 感染较为有效的方式。在另一项对猫传染性腹膜炎病毒（feline infectious peritonitis virus，FIPV）的研究中，实验人员通过S 蛋白（spike protein）的替换方式构建1 个基于血清型Ⅰ型FECV的反向遗传学系统，拯救得到了能够导致猫产生持续性感染的重组病毒［4］，为FIPV 基因型转换的研究提供了一个强有力的工具。本文现就目前应用于CoV 研究中的几种反向遗传学技术及其可能在CoV疫苗研发中的应用作一综述。

1 CoV中常用的反向遗传学系统

CoV是一种有包膜的正义RNA病毒，属于网巢病毒目、CoV科病毒，具有已知RNA 病毒中最大的基因组。由于正链RNA 病毒基因组可直接启动病毒蛋白翻译以及病毒负链RNA 的转录，启动病毒生命周期［5］。当将包含病毒基因组全长的cDNA 修饰，制备正链RNA 转染至细胞后，即可获得完整的、具有感染性的病毒颗粒，因此，CoV 是反向遗传学研究的重要平台。利用反向遗传学系统，能够对CoV基因组进行特定的修改，从而更好地研究病毒不同基因的生物学功能，获得各种带有特定性状的重组毒株，为疫苗的研发提供更多安全、高效的途径［6］。目前，应用于CoV基因组的反向遗传学技术主要有：靶向RNA重组、体外连接、细菌人工染色体系统（bacterial artificial chromosome，BAC）、痘病毒载体以及基于酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）的转化相关重组（transformation-associated recombination，TAR）技术等。以下主要对这些常用技术路线进行简单介绍。

1.1 基于病毒RNA的反向遗传学系统 靶向RNA重组是第一个应用于CoV 研究的反向遗传学系统［7］，其主要利用在RNA 病毒复制过程中，RNA 聚合酶表现出的一种模板转移机制［8］，能够在没有病毒感染性全长cDNA 的情况下，对CoV ORF1ab 区域以外的基因进行操作。主要包括2 个步骤：首先，构建1 个带有筛选标记的重组嵌合病毒；其次，构建1 条带有筛选基因的野生型对应片段及病毒基因组中需要操作区域的片段的RNA，将其转染至感染有嵌合病毒的细胞中，通过负筛选的方式得到引入目标突变的重组病毒。该方案首先应用于小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）的反向遗传学改造，后又被应用于猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、FIPV等其他CoV的全长cDNA构建［9-10］。但该方案在应用时，需保留病毒本身的复制能力，因此并不能对病毒复制酶相关基因，即ORF1ab进行操作，因此，极大地限制了其在病毒复制、毒性等研究方面的应用［11］。有研究人员利用基于RNA 重组的反向遗传学系统，将FIPV 的S 蛋白基因替换至MHV相应部位，使构建得到的重组CoV 在新的宿主细胞增殖，为减毒活疫苗及灭活疫苗的毒种研发提供了参考［12］。

1.2 基于病毒全长cDNA的反向遗传学系统

1.2.1 基于体外线性化的反向遗传学系统 该方案最早由ALMAZAN 等［13］在对黄热病病毒的研究中提出，主要通过体外连接病毒基因组cDNA片段来生成全长的病毒cDNA，再以其作为模板，转录合成病毒基因组RNA。在应用时，通常会先分析CoV 基因组上特异的限制性内切酶的酶切位点，在酶切位点附近设计引物，获得1 组覆盖CoV 基因组全长的基因片段。同时，在5'端基因片段前端，添加连接T7 RNA聚合酶启动子的酶切位点，3'端添加引入poly-A 尾巴的酶切位点。构建片段时，通常会先将其克隆至不同质粒中，以方便大量扩增目的片段。得到目的片段后，利用限制性核酸内切酶酶切产生特异性末端，通过酶连获得1 条包含CoV 全部基因组以及T7启动子、poly-A 尾巴的全长cDNA［14-15］，以全长cDNA为模板，转录出病毒基因组RNA 后转染特定宿主细胞，即可拯救获得目标毒株，后续重组病毒的构建仅需对相应基因片段的特定位点进行修改即可。另外，一项关于MHV 的研究表明，若将表达待拯救毒株N蛋白的mRNA与体外转录出的全长病毒RNA一同转染细胞，能够显著增强病毒RNA 基因组的复制及转录能力，从而有利于病毒的拯救［16］。近年来，随着环状聚合酶延伸反应（circular polymerase extension reaction，CPER）技术的发展，可将带有CMV启动子序列片段与包含CoV 基因组的1 组片段在体外合成环状cDNA，更快速、高效、简便地实现CoV的拯救［17］。

该方案不需依赖细菌系统构建病毒全长cDNA，与依赖细菌系统的cDNA构建方法相比，可有效解决病毒全长cDNA 在细菌中的不稳定性和毒性问题。同时，病毒cDNA 片段可在质粒上进行操作和制备，一定程度上降低了工作量及工作难度。目前，已在引起SARS-CoV、中东呼吸综合征的冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）、PEDV 和SARS-CoV-2 等冠状病毒的感染性cDNA 的构建中得到应用［18-20］。以SARS-CoV-2为例，在SARS-CoV-2 暴发的第一时间，WAND 等［21］利用体外连接的策略快速获得了病毒基因组全长cDNA，经病毒拯救后，获得与原始亲本株有相似感染及增殖特性的拯救毒株，在通过插入nLuc以及mNeonGreen等报告基因后，作为药物筛选及疫苗评价平台，极大地促进了SARS-CoV-2抗病毒药物以及疫苗的研发。

1.2.2 基于BAC 的反向遗传学系统 与基于体外线性化的反向遗传学技术相比，基于BAC 的反向遗传学技术是将获得的包含CoV 基因组全长的DNA 片段连接至DNA 载体上。由于CoV 基因组较大，使得病毒全长cDNA在一般质粒中难以稳定存在，但PENZES 等［22］于2000 年在构建TGEV 全长cDNA 的过程中即克服了这一问题。同时，通过添加大肠埃希菌F因子（fertility-factor），可严格控制BAC 在大肠埃希菌中的拷贝数，使得宿主细胞增殖期间，每个细胞仅保留1 ～2 个人工染色体的拷贝，极大地保证了病毒基因组全长cDNA 的稳定性及其序列相关的宿主细胞毒性。其构建策略主要如下：首先，通过RT-PCR 或化学合成获得几段带有同源序列的DNA 片段。在病毒基因组5'端的DNA 片段通过PCR 连接添加与启动子以及与载体质粒连接所需的同源臂序列，3'端DNA 片段包含poly-A 尾巴以及与ABC 连接所需的同源臂序列。然后，将所有DNA 片段按特定顺序连接至选定的ABC 上。最后，在T7 或CMV 启动子的作用下，通过体外转录后转染（T7 启动子）或直接转染（CMV启动子）细胞即可获得相应的重组病毒。

该方案的主要优势在于能够稳定插入较大DNA片段，同时，通过F 因子、独特克隆位点、合适启动子、抗性筛选标记等的修饰，可极大地优化病毒全长cDNA 构建、修改、筛选以及病毒拯救的流程。构建至相应的质粒载体上后，可大量获得包含病毒全长cDNA 的载体，且后续基因修饰均可在质粒上进行，可加快重组病毒全长cDNA 的构建过程。利用该方案，研究人员将PEDV 的S 蛋白进行异源替代，产生的重组病毒具备与原PEDV 不同的中和特性，提示了构建异源S 蛋白的重组腺病毒作为减毒候选疫苗株的可能性［23］。

1.2.3 基于痘病毒载体的反向遗传学系统 基于痘病毒载体的反向遗传学技术的主要特点在于选择了痘病毒基因组作为承载病毒基因组全长cDNA 的载体。痘病毒载体是一种反向遗传学研究的通用载体，在不影响病毒复制的前提下，能够插入大片段的外源基因（26 000 ～31 000 bp），同时，牛痘病毒基因组稳定，具有传染性，可在组织培养中高效复制，容易得到滴度较高的毒株［13］。该方案在应用时，首先要对痘病毒的基因组序列进行分析，寻找可供外源cDNA 插入的限制性酶切位点。当将包含CoV 全长基因组的cDNA片段插入至痘病毒基因组中后，线性化转染BHK 细胞中，即可拯救出相应的病毒颗粒。该方案首先应用于HCoV-229E 全长cDNA 的构建，随后又在鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）、MHV、SARS-CoV 和FIPV 等CoV 中得到应用［24］。以痘病毒载体作为CoV 的反向遗传学操作系统，一方面，可研究CoV 的遗传表征，为CoV 减毒及灭活疫苗的研发奠定理论基础；另一方面，去除CoV 必需基因后，构建的重组痘病毒可作为候选的病毒载体疫苗，具有极广泛的应用前景［25］。

1.2.4 基于多质粒载体的反向遗传学系统 基于多质粒载体的反向遗传学技术主要解决了CoV 反向遗传学研究中，由于CoV 庞大的基因组导致全长cDNA难以获得以及体外转录相对困难的问题。其构建步骤主要如下：首先，根据CoV 基因组特征，将其划分为3 或多个主要片段，通过逆转录或体外合成等方式获得相应的DNA 片段；其次，将得到的片段分别连接至不同质粒上；最后，将包含CoV 基因组不同部分的全部质粒共转染至293T 细胞中，即可获得相应的病毒颗粒［26］。

该方案的主要优点在于质粒的构建相对简单，可快速获得目标重组病毒。且由于病毒基因组cDNA存在于不同质粒上，操作也相对简单。但由于无法产生包含病毒基因组全长的RNA，只能形成病毒颗粒空壳，无法进行连续传代。该方案目前已在SARSCoV-2 中成功得到应用［27］。在对PEDV 的细胞嗜性的研究中，研究人员通过多质粒载体的反向遗传学技术，发现了其S 蛋白上3 个与PEDV 的Vero 细胞嗜性相关的位点，提示PEDV 的细胞嗜性可能与其S2亚基的剪切位点或RBD 的结构有关，为CoV Vero 细胞适应的疫苗候选株提供了理论指导［26］。

1.2.5 基于YAC 的TAR 克隆的反向遗传学系统 病毒序列的大小限制以及不稳定性是将CoV 基因组全长cDNA克隆至可复制载体中的主要障碍，尽管基于BAC 的策略一定程度上克服了这些问题，但部分病毒序列对于细菌的细胞毒性依然限制了部分CoV 基因组全长cDNA的构建。与细菌相比，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）对于病毒序列的细胞毒性敏感度更低［28］。此外，通过TAR 克隆技术，能够简单、快捷地进行大DNA 片段的操作［29］。因此，YAC 已经成为CoV 反向遗传学研究中较为常用的手段。其构建流程与基于BAC 的反向遗传学系统相似。首先，将待构建的CoV 基因组划分为几个彼此带有重叠区域的片段，并以病毒基因组为模板，通过反转录PCR 获得相应的cDNA 片段。将带有同源末端的1组cDNA片段及线性化的载体片段导入酿酒酵母后，通过TAR克隆即可制备包含病毒基因组全长cDNA 的人工染色体［28］。

相较于以上提到的几种反向遗传学系统，基于YAC系统的反向遗传学技术主要优势在于以下2点：首先，YAC 基因载量大，能够携带高达300 kb的插入片段；其次，基于酵母的TAR克隆在组装组分片段方面具有更高的效率。全长克隆可在酵母系统中扩增，为进一步研究提供了充足的材料，节省了制备体外连接片段的大量时间，并且与基于体外连接的策略相比，能够进行更多重组片段间的重组［30］。在大流行初期，ISENI 等［31］就基于YAC 的反向遗传学平台，在1 个月内制备了SARS-CoV-2 的毒株，同时构建了带有标记基因GFP的SARS-CoV-2-GFP和synSARSCoV-2-GFP，极大地推动了SARS-CoV-2 疫苗的研究进展。

2 反向遗传学技术在疫苗研发领域的应用

反向遗传学能通过对CoV 基因组的定向改变，来研究相关基因的功能及其对于病毒表型、性状的影响。通过反向遗传学操作，可快速获得大量的病毒资源，极大地推动CoV 重要毒力位点的发现及对病毒作用机制的研究，从而获得理想的减毒株来研制疫苗。与此同时，通过给病毒添加GFP 等可视化标记，还可实现病毒感染的实时监控，从而优化病毒的细胞及动物感染模型，为相关疫苗的快速测评提供一个更为直观、精准的途径。

2.1 减毒位点及Vero 细胞适应性位点的发现 首先，在对CoV 复制及致病机理有一定了解的基础上，能够对CoV 基因组复制或致病关键位点进行改造，在不影响其免疫原性的基础上，得到相应的减毒毒株，解决疫苗生产过程中的安全性问题。同时，针对新出现的CoV 突变株，可通过相应突变位点的改造，快速得到突变株的减毒毒株，应用于疫苗生产。其次，在减毒株骨架基础上，进一步获得人用疫苗细胞基质适应性更好、滴度和产量更高骨架，引入新变异株的S 蛋白或与免疫逃逸相关的中和位点，克服新变异株适应性弱、滴度和抗原产量低的困难。进一步，利用反向遗传学平台，能够对CoV 基因功能、蛋白结构、免疫逃逸及致病机理等进行更深入研究，预测未来可能出现的CoV 大流行，利用反向遗传学手段，提前获得相应的减毒疫苗株，为CoV 的大流行做好准备。

2.1.1 非结构蛋白（non-structure protein，NSP）NSP1是CoV（α 及β-CoV）感染细胞后编码的第1 个蛋白，能够抑制感染细胞中干扰素表达，进而抑制机体对病毒的免疫应答。因此，NSP1 是研究CoV 感染、复制的重要位点。反向遗传学研究已经证明，当敲除SARS-CoV-2 NSP1 的141 ～143 位氨基酸KSF 后，病毒毒力就会减弱。同时，感染细胞的固有免疫应答也会恢复［32］。

NSP2 同样被报道与病毒复制相关。当将MHV和SARS-CoV 中NSP2 敲除后，病毒的生长和复制将会减弱。但不同CoV NSP2 同宿主细胞的作用机制有所差异［33］。

NSP3是CoV复制／转录复合物（replication／transcription complex，RTC）的重要组成成分，同时也是CoV中最大的多功能域蛋白。其中，木瓜样蛋白酶结构域（papain-like protease，PLpro）、泛素样结构域（ubiquitin-like domains）和ADP 核酸磷酸酶结构域（ADPribose-phosphatase domains）在不同CoV 中均高度保守［34］。反向遗传学研究已经证明，当NSP3的环ADP酸糖蛋白水解酶活性降低后，SARS-CoV 在小鼠中的致病性将会减弱，并显著增强小鼠的固有免疫反应。同时，MHV NSP3的V787S突变也会导致病毒毒力减弱，并增强宿主的免疫保护。PEDV 和TGEV NSP3的590 ～1 215位氨基酸残基也被证明与病毒免疫逃逸相关。NSP4 是一种与双膜囊泡（double-membrane vesicles，DMV）形成有关的跨膜蛋白，当研究人员将其C-末端的结构域去除后，病毒的复制将受到影响［35］。

NSP5也称为3CLpro（3C-like protease）或Mpro（motrypsin protease），是CoV 复制过程中1 个至关重要的酶，负责pp1a／ab上11个位点的酶切，由此形成12个成熟的NSPs。反向遗传学研究表明，MHV NSP5 的T26I 和D65G 突变会使得病毒对3CL-like 蛋白酶抑制剂产生抗性［36］。

CoV 的NSP6 与宿主细胞自噬相关，具有多个跨膜结构域。当敲除SARS-CoV 基因组中的NSP6 后，病毒无法形成复制所必需的DMV。研究人员利用反向遗传学验证了MHVNSP7、NSP8 的缺失均可使得病毒无法复制，NSP9 和NSP10 缺失也会对病毒的复制产生影响［37］。

NSP12和NSP13是CoV RTC最核心部分，分别起到RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）和解旋酶的作用，对于病毒的复制不可或缺。CoV NSP14 具有5'→3'端的核糖核酸酶（ExoN）和N7 甲基转移酶（N7 MTase）活性。前者与RAN聚合酶的保真性有关，被认为是CoV保持其庞大基因组的关键［38-39］。

CoV 编码的NSP15 具有核酸内切酶活性，在病毒复制过程中发挥重要作用。被认为是CoV 减毒株制备的1 个关键位点。当MHV NSP15 发生H262A突变后，NSP15 将会失活，其在小鼠模型上的致病性也大大降低，并能刺激机体产生免疫保护反应。在PEDV中，NSP15同样也是1个关键的毒力因子［40］。

NSP16具有2'-O-甲基转移酶活性（2'-O-MTase），在CoV 中高度保守，是1 个值得注意的减毒靶点［41］。反向遗传学研究证明，MHV 的D129A、SARS-CoV 的D130A、MERS-CoV的D130A和PEDV（KDKEK-AAAA）能够使得NSP16 失活降低病毒毒力，并刺激机体产生更强的Ⅰ型和Ⅲ型干扰素反应。同时，NSP16 的突变体还能够与NSP1、NSP14 或S 蛋白中的另一个突变位点协同作用，产生更稳定的减毒株［42］。

2.1.2 主要结构蛋白 CoV 的S 蛋白是位于病毒颗粒表面的Ⅰ类融合蛋白，由S1 和S2 2 个亚基构成，是亚单位疫苗开发的核心分子。有研究人员构建了2株相互交换了S基因的嵌合病毒，发现其中1株毒力较高，另一株无毒，证明了S基因是CoV 毒力所必需的，但不是与CoV 相关的唯一因素［43］。而另一项反向遗传学研究以同样的方式研究了S基因在不同代毒株PEDV 发病机制中的作用，结果表明，除S基因外，其他基因同样会对病毒毒力造成影响［44］。而对SARS-CoV、TGEV、IBV和PEDV等CoV的研究表明，病毒颗粒在内质网-高尔基体中间隔室上的聚集与S 蛋白上2 个保守基序（YxxΦ 和KxHxx／KKxx）有关，研究人员将PEDV 中这2 个保守基序缺失或突变后发现，YxxΦ 基序（YEVF 或YEAF）触发S 蛋白的内吞作用，KVHVQ 基序参与了病毒复制过程中，S 蛋白与宿主细胞的内质网和高尔基体之间的相互作用；这2个基序的缺失显著增强了Vero 细胞中合胞体的形成，并降低了毒株的毒力［45］。

CoV 的E 蛋白是CoV 主要结构蛋白中最小的蛋白质，参与了CoV 的组装、出芽和致病等过程。E 蛋白的缺失会使得病毒的复制效率和毒力显著降低，但仍能形成具有感染性的病毒颗粒。而对MERSCoV 和TGEV 的反向遗传学研究表明，E基因缺失后，在正常细胞中不能拯救病毒的全长cDNA，但能够在E蛋白表达的细胞间传播［46-48］。

M 蛋白也是病毒颗粒组装所需的主要结构蛋白，可与E蛋白和S蛋白共同形成完整的病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）。SARS-CoV M 蛋白的两端多肽均具有免疫原性［26］，但其所引起的免疫保护效力还有待进一步探讨。有研究表明，CoV 的M 蛋白也能够抑制宿主细胞干扰素的产生。而MERS-CoV的M 蛋白能够通过抑制RF3的BK1依赖的磷酸化来抑制Ⅰ型干扰素的产生［49］。

CoV 的N 蛋白在病毒的生命周期中发挥着多种功能，包括调节病毒RNA合成、核衣壳形成以及病毒组装等。N 蛋白的表达对于从感染性cDNA 中回收病毒是必要的。N 蛋白能够诱导机体产生细胞免疫反应，当研究人员利用重组病毒MVA-MERS-N 免疫小鼠后，小鼠能够产生更强的T 细胞免疫，保护小鼠免受MHV 致命感染［50］。而SARS-CoV N 蛋白的1 ～422 位氨基酸残基片段和110 ～422 位氨基酸残基片段能够在小鼠中产生特异性抗原，并与SARS康复患者血清发生反应［51］。SARS-CoV 的N 蛋白还是一种干扰素拮抗剂，通过抑制IRF-3和NF-κB抑制干扰素合成，干扰TRIM25介导的RIG-I泛素化或减弱PTAC介导的RIG-I／MDA5激活［24］。

2.1.3 辅助蛋白 CoV 的辅助蛋白在病毒致病过程中发挥重要作用。研究表明，从MERS-CoV 中删除ORF3 和ORF5、从SARS-CoV 中删除ORF8 均不会影响病毒复制，但会减弱病毒毒力［52-53］。由于CoV 的辅助蛋白不会影响病毒复制，也常作为外源基因插入的靶点。值得注意的是，一些辅助蛋白被认为具有离子通道活性，并与宿主细胞的固有免疫相关，可能能够帮助病毒逃避宿主细胞的免疫监视，并增强病毒毒力［54-55］。因此，辅助蛋白缺陷的CoV 被认为是CoV减毒株制备的重要策略。

2.2 其他 反向遗传学技术还能够应用于建立病毒感染模型以及疫苗评价。有研究人员利用反向遗传学技术，将PEDV 基因组中的ORF3替换为红色荧光素蛋白（red fluorescent protein，RFP）基因，获得1 株能够在体内外有效复制，并介导仔猪发病的重组毒株icPEDV-ΔORF3-RFP，为对该病毒发病机制、嗜性、中和抗体以及疫苗保护评估的研究提供了一个安全、高效的平台［56］。

3 小结与展望

CoV 已经多次跨越物种屏障，其中一些获得了人际间传播的能力，其中对人类生命健康具有严重威胁的主要包括SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。此外，已知其他4 种CoV 会感染人类导致轻微疾病，包括人CoV-229E（HCoV-229E）、人CoV-NL63（HCoVNL63）、人CoV-OC43（HCoV-OC43）、人CoV-HKU1（HCoV-HKU1）。蝙蝠通常被认为是一系列CoV 的天然宿主［56］。一些蝙蝠CoV 也有可能出现在人类群体中，如马蹄蝠中的SARS-like病毒SHC014-CoV［57-58］。反向遗传学技术能够实现对CoV 基因组的直接操作，通过相关位点突变、敲除或重排等，均有可能获得理想的、用于CoV 疫苗生产的疫苗株，与此同时，利用反向遗传学技术，还能够对CoV-宿主相互作用、宿主免疫反应和病原体免疫逃避策略进行更深入的研究。如探究CoV 感染期间受影响的宿主细胞途径，确定能够抑制宿主先天免疫的CoV 蛋白和特定的信号途径等。将反向遗传学与基因组学和结构生物学相结合，有助于描述出目前的CoV 种群，预测可能出现的人畜共患病CoV，为未来的CoV暴发做好准备，促进针对CoV感染的防治策略的发展。