人参多糖的分离纯化及其对UVB 致皮肤损伤的保护作用

聂 梅，黎 鹏，汤静洁，张平军，黄冬婷,

（1.广东省科学院生物与医学工程研究所，广东广州 510316；2.广东省绿色制糖工程技术研究中心，广东广州 510316）

皮肤是人体的最外层器官，很容易暴露在紫外线下造成刺激。根据波长的不同，紫外线可以分为UVA（320～400 nm）、UVB（280～320 nm）、UVC（100～280 nm）。大气中的臭氧层对UVC 有较强的吸收能力，到达地球表面的紫外线主要是UVA 和UVB[1]。UVB 的波长处于DNA 和蛋白质的吸收峰附近，其辐射是皮肤光化学反应中最活跃部分，诱发的炎症在皮肤光老化中起核心作用[2-3]。过量的UVB 辐射导致皮肤组织中的ROS 被大量激活，超过了机体的清除能力，导致细胞膜受损，脂质过氧化产生过量MDA，致使细胞凋亡从而引起光老化[4-5]。因此，开发含有天然成分或配方的药物、食物抑制UVB 对皮肤的损伤实现抗衰老受到越来越多人的关注。

人参作为一种被广泛使用了几千年的著名中药材，其有效成分包括皂苷、多糖、挥发油和氨基酸等[6]。主要有效成分人参皂苷的研究比较完整，其生理功能已经有了大量的实验依据和证明[7-9]。然而，人参成分中最丰富的多糖（约占总含量的40%）还没有得到充分的研究，此前对人参多糖的研究主要集中在其具有抗氧化作用[10]，通过降低组织过氧化程度，保护组织器官免受氧化损伤[11-13]。目前还缺乏人参多糖在皮肤抗衰老方面的研究。抗衰老活性研究中，细胞模型和动物模型都已有报道。董坤等[14]建立了UVB 致HFF-1 损伤模型，考察草莓叶水提物对UVB 致皮肤损伤的保护作用，结果表明草莓叶水提物有助于缓解氧化应激造成的细胞损伤，达到延缓衰老的功效。王慧云[15]通过建立过氧化氢刺激人脐静脉血管内皮细胞诱导的衰老细胞模型发现，党参多糖干预后细胞血清中内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）、诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）、ROS 含量降低，内皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）含量升高，DNMT1、EZH2、Bmi-1 蛋白与基因表达量、细胞DNA 甲基化水平也得到了调节，表明党参多糖可以延缓内皮细胞衰老。赵苑伶等[16]分离纯化得到铁皮石斛多糖，以秀丽隐杆线虫为模式生物，研究了铁石斛多糖的抗衰老作用，结果表明铁皮石斛多糖可以显著延长秀丽隐杆线虫的寿命，对高温损伤和氧化应激损伤有一定的抵御作用。朱秋轶等[17]利用秀丽隐杆线虫模型研究羊乳酪蛋白酶解物的抗衰老作用，实验表明羊乳酪蛋白酶解物能延长线虫寿命，降低线虫体内脂褐素积累，提高线虫在应激条件下的抵抗能力和体内抗氧化酶活力，具有较好的抗衰老活性。

由于对分离纯化后的人参多糖在皮肤抗衰老方面的研究较为少见，因此，本文制备了人参精多糖，对其进行均一性测定、波谱表征及延缓皮肤衰老功效评价，为人参多糖的分离纯化及在延缓皮肤衰老方面的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人参的干燥根及根茎 河北省安国市药材市场；α-淀粉酶（酶活力4000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力3000 U/g） 分析纯，麦克林试剂生化科技有限公司；无水乙醇 市售，分析纯；窄分部普鲁兰多糖标准品 日本Shodex 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒、人基质活性氧（ROS）ELISA 试剂盒、人基质丙二醛（MDA）ELISA 试剂盒、人基质谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒、人基质超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 试剂盒 深圳子科生物科技有限公司；人基质金属蛋白酶1（MMP-1）ELISA 试剂盒、人基质金属蛋白酶9（MMP-9）ELISA 试剂盒 杭州联科生物技术股份有限公司。

TDZ4-WS 离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；DNM-9602 酶标分析仪 北京普朗新技术有限公司；BHC-1300IIB2 生物安全柜 苏州金净净化设备公司；Thermo Forma 3111 CO2恒温培养箱美国Thermo 公司；XDS-500C 显微镜 上海蔡康光学仪器有限公司；UV-1750 紫外-可见分光光度计、GPC-20A 凝胶渗透色谱仪、RID-20A 示差折光检测器 日本岛津公司；iS10 红外（FT-IR）光谱仪 美国尼高力公司；AVANCE III 400M 核磁共振波谱仪德国BRUKER；TSKgel GMPWXL 水相凝胶色谱柱东曹（上海）生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人参粗多糖（GPS）的制备 参考文献[18]制备人参粗多糖。称取干燥过筛后的人参样品，置于玻璃烧杯内，按料液比1:30（g/mL）加入去离子水，在70 ℃温度、60 Hz 超声功率下提取30 min。待溶液冷却后离心（6000 r/min），取上清液。在上清液中加入约4 倍体积的无水乙醇溶液，放置在-20 ℃环境中醇沉24 h。过滤收集沉淀，将其放入真空干燥箱（70 ℃）中干燥至恒重，即得人参粗多糖（GPS），备用。

1.2.2 GPS 纯化 参考文献[19]对GPS 进行纯化。利用α-淀粉酶去除上述提取的GPS 的淀粉。精密称取10.0 g GPS，用少量去离子水溶解后转移至1000 mL 容量瓶中，用去离子水定容，得到10 mg/mL的GPS 溶液。向配制好的GPS 溶液中加入800 Uα-淀粉酶，50～60 ℃酶解30 min，然后转移至沸水浴中加热5 min 终止酶解反应。溶液降至室温后离心（4000 r/min，10 min），收集上清液。

利用木瓜蛋白酶去除上述提取的GPS 中的蛋白质。将200 U 木瓜蛋白酶加入上述溶液中，30～40 ℃酶解2 h，然后转移至沸水浴中加热5 min 终止酶解反应。溶液降至室温后离心（4000 r/min，10 min），收集上清液。

将上清液加热至70 ℃以蒸发除去过多的水分，浓缩至50 mL，向浓缩液加入200 mL 无水乙醇，摇匀，-20 ℃冰箱冻存静置24 h，过滤得到白色固体，放置真空干燥箱中烘干（60 ℃）至恒重，得到4.8 g 酶解后的GPS。

取酶解后的GPS 4.0 g，配制成10 mg/mL 的溶液。溶液用DEAE-52 纤维素填料进行柱层析洗脱，以去离子水为洗脱液，使用试管收集，每管收集10 mL。采用苯酚-硫酸法对每管溶液在490 nm 处吸光度进行检测，对出现吸收峰的溶液进行收集，将收集的溶液冷冻干燥（-40 ℃），得到2.5 g 人参精多糖（GPS-1）。

1.2.3 GPS-1 的均一性鉴定及相对分子质量测定采用高效凝胶渗透色谱法测定GPS-1 的相对分子质量和纯度。采用TSKgel GMPWXL 水相凝胶色谱柱，以0.1 mol/L NaNO3+0.06% NaN3（质量分数）水溶液为流动相，流速0.6 mL/min，检测温度35 ℃，进样体积20 μL。采用示差折光检测器，窄分部普鲁兰多糖标准品进行对照，对GPS-1 的分子量分布进行测试。

1.2.4 GPS-1 的初级结构表征 采用溴化钾压片法对GPS-1 样品进行FT-IR 测试，波数范围：400～4000 cm-1，光谱仪分辨率4 cm-1，信躁比50000:1，扫描64 次。采用核磁共振氢谱（1H NMR）和核磁共振碳谱（13C NMR）对GPS-1 的初级结构进行表征：称取GPS-1 样品5 mg，放入核磁管，加入1 mL 氘代试剂（重水）充分溶解样品，检测其1H NMR 和13C NMR谱图。

1.2.5 细胞培养、细胞活力测试 采用含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素（10000 U/mL）与链霉素（10 mg/L）混合液）的DMEM 培养基培养HFF-1 细胞，将其置于37 ℃，5% CO2的培养箱中。显微镜下观察HFF-1 细胞为贴壁细胞。

将处于对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化，显微镜下计数后制成3×104个细胞/L 的细胞悬液。分别取100 μL 至96 孔培养板，每种细胞每块板设置3 个复孔，3×103个细胞/孔，然后添加100 μL 不同质量浓度的GPS-1 溶液，同时以100 μL 培养液做空白对照，将培养板放置37 ℃、5% CO2的培养箱中培养过夜。分别处理细胞在0、48 h 后，按1:10 体积比混合CCK-8 和无血清必需基本培养基，每孔100 μL加入待测孔中，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1 h。用酶标仪测定450 nm 波长下培养板每孔吸光度，记录数值。

1.2.6 急性光损伤模型的建立及分组 参照文献[14]建立急性光损伤细胞模型。选择生长状态良好、对数生长期的HFF-1，接种密度3×104个/孔，建立实验分组，每组设置3 个复孔。空白对照组：不照射UVB，不加GPS-1 溶液，细胞正常培养72 h；UVB 照射组：细胞正常培养48 h 后，在功率密度68 μW/cm2、照射距离10 cm 条件下，UVB 辐照100 s 后细胞培养24 h；GPS-1 高中低剂量组（200、500 和800 μg/mL）：细胞正常培养24 h 后，添加GPS-1 溶液和培养基条件下培养24 h，然后在功率密度68 μW/cm2，照射距离10 cm条件下，UVB 辐照100 s 后，再进行细胞培养24 h。

1.2.7 GPS-1 对SOD、MDA、MMP-1、MMP-9、ROS、GSH-Px 的影响 培养后，收集细胞上清，按照ELISA试剂盒说明书对SOD、MDA、MMP-1、MMP-9、ROS、GSH-Px 含量进行测定。

1.3 数据处理

采用SPSS statistics 软件对数据进行One-way ANOVA 检验，数据结果以±s 表示，以*P＜0.05 为差异有统计学意义，**P＜0.01 为差异极其显著。

2 结果与分析

2.1 GPS-1 的纯度及相对分子质量分析

纯化后的人参多糖GPS-1 的HPGPC 结果显示，分子量分布图（图1）有两个峰，其中峰1 峰面积占95.13%，此峰数均分子量（Mn）为1.079 kDa，重均分子量（Mw）为2.104 kDa，分布宽度指数PD（Mw/Mn）为1.95。峰2 峰面积占比4.87%，数均分子量（Mn）为0.055 kDa，重均分子量（Mw）为0.072 kDa，分布宽度指数PD（Mw/Mn）为1.29。结果表明GPS-1分子量分布相对均一，多糖纯度为95.13%，相对分子质量较低。

图1 GPS-1 的分子量分布凝胶色谱图Fig.1 GPC chromatogram of GPS-1 for molecular weight determination

2.2 GPS-1 的初级结构表征

2.2.1 GPS-1 的红外光谱表征 图2 为GPS-1 的FTIR 谱图，该谱图表现出多糖的特征吸收峰，分别在3385、2928、1632、1594、1413、1364、1153、1079、1024、931 和850 cm-1处出现特征吸收峰。在3385 cm-1附近出现相对较宽的强吸收峰，是由分子间或分子内的O-H 伸缩振动引起的，表明样品含多糖羟基。2928 cm-1附近的肩峰，是由C-H 或O-H 的伸缩振动引起的特征吸收峰[20]。1632 cm-1是C=O 非对称伸缩振动峰，是未酯化的糖醛酸羧基特征峰[21]；1413 cm-1处为C-H 的变形吸收峰。在1200～1000 cm-1区间的多糖特征吸收峰是由C-O-C 和C-O-H 的伸缩振动引起的[20]。在1024、1079 和1153 cm-1处分别有三个吡喃糖特征吸收峰，表明该样品多糖结构为吡喃糖环状结构。α-型或β-型吡喃葡萄糖通常在960～730 cm-1内有特征吸收峰，其中，在844±8 cm-1处有吸收峰为α-型异构体，在891±7 cm-1处有吸收峰为β-型异构体[22]。该样品的红外谱图在891 cm-1处无吸收峰，在850 cm-1处出现明显的吸收峰，表明存在α-D-吡喃葡萄糖[23]。红外光谱分析结果表明GPS-1 存在α-D-吡喃葡萄糖构型。

图2 GPS-1 的红外光谱图Fig.2 FTIR spectra of GPS-1

2.2.2 GPS-1 的核磁表征 糖苷异头氢的1H NMR信号一般处于δ4.2～5.8 ppm 范围，其中，α-型糖苷的异头质子处于δ4.8～5.8 ppm 范围内，β-型糖苷的异头质子处于δ4.2～4.8 ppm 范围[24]。图3 显示，δ4.7 ppm为重水溶剂峰，δ3.2～4.0 ppm 为人参多糖糖环上的质子信号。人参多糖糖苷键的质子化学位移在δ4.5～5.4 ppm 范围内，表明含有α-型和β-型两类糖苷键。在糖苷键质子共振区δ4.2～5.8 ppm 范围内出现7 个信号峰，表明样品由7 种单糖组成。根据文献[25]报道推断氢谱上7 个信号δ5.31 ppm、δ5.27 ppm、δ5.14 ppm、δ5.13 ppm、δ4.88 ppm、δ4.57 ppm、δ4.56 ppm 分别归属为α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖醛酸、α-D-阿拉伯糖、α-D-岩藻糖、α-D-核糖、β-D-甘露糖、β-D-阿拉伯糖糖苷键质子信号。

图3 GPS-1 在400 MHz 条件下的1H NMR 谱图Fig.3 1H NMR spectrum of GSP-1 recorded at 400 MHz

13C NMR 谱图中，糖苷碳的信号共振区通常在δ95～110 ppm 范围内。根据图4 可知，δ100.33 ppm、δ99.94 ppm、δ99.69 ppm、δ99.58 ppm、δ98.57 ppm、δ98.25 ppm、δ95.75 ppm 分别对应七种单糖的糖苷碳，表明GPS-1 含有七种单糖成分，与其1H NMR 结果一致。糖环上化学位移一般在δ50～85 ppm 范围内，其中，未发生取代的C6 在δ60～63 ppm 附近，连接到另一个糖残基的C6 特征峰出现在δ65～70 ppm附近；糖环上C2、C3、C4 位置未发生取代时特征信号峰在δ70～77 ppm 范围内，糖环上C2、C3、C4 位置发生取代时特征信号峰在δ77 ppm 以上[26]。图4中GPS-1 信号在δ68～69.5 ppm 范围内有特征峰，说明C6 位发生取代；在δ70～77 ppm 范围内出现明显的特征峰，可以判断GPS-1 在C2、C3、C4 位置未发生取代。

图4 GPS-1 在400 MHz 条件下的13C NMR 谱图Fig.4 13C NMR spectrum of GSP-1 recorded at 400 MHz

2.3 GPS-1 对正常生长HFF-1 细胞增殖的影响

本实验使用可快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的CCK-8 试剂盒，考察GPS-1 对正常生长HFF-1 细胞增殖情况的影响。细胞存活率是可直接表达各组细胞状态的指标，反映细胞增殖情况，细胞存活率越高说明细胞状态越好[27]。由图5 可知，与对照组相比，当GPS-1 的质量浓度小于等于800 μg/mL时，对HFF-1 细胞存活率无显著影响（P＞0.05）。当GPS-1 的质量浓度大于800 μg/mL 时，HFF-1 细胞存活率降低，GPS-1 质量浓度增至2000 μg/mL 时，细胞活率降至87.1%（P＜0.01）。最终选取200、500 和800 μg/mL 三个质量浓度用于后续实验。

图5 GPS-1 对正常生长HFF-1 细胞活力影响Fig.5 Effect of GPS-1 on the viability of normal growing HFF-1 cells

2.4 GPS-1 对UVB 致HFF-1 细胞损伤的保护作用

由图6 可知，经UVB 辐射后，与对照组相比，UVB 照射组细胞存活率下降了20.1%，细胞存活率显著降低（P＜0.01），说明UVB 致HFF-1 细胞损伤模型建立成功。而经GPS-1 保护干预后，与UVB照射组相比，GPS-1 质量浓度分别为200、500 和800 μg/mL 时，细胞存活率分别增加了1.9%（P＜0.05）、9.5%（P＜0.01）和18.8%（P＜0.01），均具有显著性差异，说明GPS-1 对UVB 损伤HFF-1 细胞具有明显的保护作用，在GPS-1 质量浓度为200～800 μg/mL范围内，随着质量浓度增高，对损伤细胞的保护作用随之增强。

图6 GPS-1 对UVB 照射组HFF-1 细胞活力影响Fig.6 Effect of GPS-1 on the viability of HFF-1 cells in UVB irradiation group

2.5 GPS-1 对UVB 照射组细胞内SOD、MDA、ROS、GSH-Px、MMP-1、MMP-9 的影响

皮肤成纤维细胞是合成胶原及弹性纤维的主要场所，虽然此种细胞位于真皮层，但更易发生氧化损伤[28]。当UVB 照射成纤维细胞时，细胞内SOD 和GSH-Px 抗氧化酶的活性受到抑制，当大量的ROS未能得到及时清除出现氧化应激反应，将破坏细胞内脂质、蛋白质、核酸等大分子物质，激活基质金属蛋白酶表达，导致脂质分解，引发脂质过氧化反应，形成过氧化脂质产物（MDA）[14]。因此，测定MDA 含量，可间接反映细胞损伤程度，而SOD 作为衡量机体抗氧化能力大小的重要因素，可反映细胞消除ROS 的能力[29]。

如图7 所示，与空白对照组相比，UVB 照射组HFF-1 细胞中ROS 和MDA 含量显著增高（P＜0.01），SOD 和GSH-Px 酶活力显著降低（P＜0.01），说明UVB照射对HFF-1 有明显损伤作用，大量的ROS 未能被细胞清除，同时导致生成过量的MDA，造成细胞氧化损伤，引起机体衰老。与UVB 照射组相比，经GPS-1 保护干预后，HFF-1 中ROS 含量降低，GPS-1低、中、高剂量组分别下降了21.5%、42.8%、56.5%，且具有显著性差异（P＜0.01），说明GPS-1 可有效降低因UVB 刺激产生的ROS。同样地，当GPS-1 质量浓度分别为200、500 和800 μg/mL 时，HFF-1 中MDA 含量降低，分别为4.9、3.4、2.9 nmol/mL（P＜0.01），呈剂量依赖性。与UVB 照射组相比，当GPS-1 质量浓度分别为200、500 和800 μg/mL 时，SOD 含量分别提高了32.5%、75.0%、128.9%（P＜0.01），说明GPS-1 显著提升HFF-1 细胞SOD 活力。与UVB 照射组相比，当GPS-1 质量浓度分别为200、500 和800 μg/mL 时，GSH-Px 含量分别提高了29.7%、59.9%、108.3%（P＜0.01），说明GPS-1 可以调节HFF-1 细胞GSH-Px 含量。在衰老细胞中，ROS 和MDA 含量显著增加，SOD 和GSH-Px 酶活力显著降低，在该模型下，GPS-1 能有效减少细胞中ROS 和MDA 含量，有效提高SOD 和GSH-Px 酶活力，说明GPS-1 能够通过减少ROS 含量，防止细胞产生氧化应激，对MDA 的产生具有抑制作用，降低细胞氧化损伤，同时促进细胞内SOD 和GSH-Px 活力提升，提高细胞抗氧化能力，从而帮助细胞对抗由UVB 诱导引起的细胞衰老。

图7 GPS-1 对HFF-1 细胞内SOD（a）、MDA（b）、ROS（c）、GSH-Px（d）、MMP-1（e）和MMP-9（f）的影响Fig.7 Effects of GPS-1 on SOD (a), MDA (b), ROS (c), GSH-Px (d), MMP-1 (e) and MMP-9 (f) in HFF-1 cells

基质金属蛋白酶（MMPs）是一种具有广泛特异性的而且几乎可以分解所有细胞外基质成分的水解酶。MMP-1 特异性降解I 型胶原蛋白，使得I、III 型胶原比例下降，MMP-9 作为一种明胶酶，可以继续降解MMP-1 降解产物，导致皮肤胶原蛋白流失，继而发生衰老发生[30]。如图7e、图7f 所示，与UVB线照射组相比，低剂量的人参多糖即可极显著降低HFF-1 细胞内MMP-1 和MMP-9 的含量（P＜0.01），而当添加高剂量的人参多糖时，MMP-1 和MMP-9 含量接近正常未经UVB 照射组细胞内水平，说明人参多糖可以抑制MMP-1 和MMP-9 的表达，达到减少胶原分解的功效，改善细胞结构，从而具有延缓皮肤衰老的效果。

3 结论

本实验以人参为原料，通过提取分离纯化得到人参精多糖。采用高效凝胶渗透色谱法对人参精多糖进行分析，结果表明该人参多糖为均一性多糖，相对分子质量为2.104 kDa，多糖纯度为95.13%，另外通过红外光谱、核磁谱图对人参结构进行了初步分析。进一步利用UVB 照射HFF-1 细胞模型，通过ROS、MDA、SOD、GSH-Px、MMP-1 和MMP-9 等指标的测定，对人参精多糖进行抗皮肤衰老的探究。实验结果表明人参精多糖可有效去除细胞中的ROS，抑制MDA 的含量，缓解由外源条件（UVB）造成的细胞受损，同时，促进SOD 和GSH-Px 抗氧化酶活提升，提高细胞抗氧化能力，通过维持氧化还原平衡来达到抗衰老的作用，为皮肤提供有利的组织环境；此外，人参精多糖还可抑制MMP-1 和MMP-9 的表达，达到减少胶原分解的功效，维持皮肤弹性，延缓皮肤衰老。因此，人参多糖具有一定的抗皮肤衰老作用，可作为一种延缓衰老功效原料，应用于化妆品、保健品等领域，可以有力提升人参的市场竞争能力，进一步提高经济效益。