汉族脑梗死患者阿司匹林抵抗基因单核苷酸多态性的分布特征

李六水，成华，刘宪军

首都医科大学附属北京潞河医院 临床药学中心，北京 101149

脑梗死又称缺血性卒中，是指脑血管堵塞或严重狭窄，使脑组织血流灌注降低，进而缺血、缺氧，导致脑血管供血区脑组织死亡的一类脑血管疾病，具有高发病率、高致死率、高致残率等特点，给患者、家庭和社会带来沉重负担[1]。阿司匹林既是脑梗死急性期抗小板治疗的重要药物，又是脑梗死二级预防的首选药物[2]。在临床实践中观察到，部分患者在服用阿司匹林期间仍会发生脑血管事件，部分学者使用“阿司匹林抵抗”这一术语来描述或定义这一现象。阿司匹林抵抗显著增加了脑梗死复发和其他脑血管事件发生的风险[3]，但阿司匹林抵抗发生的机制目前尚不清楚。研究表明，基因多态性是导致阿司匹林抵抗的重要因素[4]。GPⅢa PLA2、PEAR1、PTGS1等基因多态性对阿司匹林抗血小板作用正常发挥具有重要影响[5]。本研究对GPⅢa PLA2、PEAR1、PTGS1基因中与阿司匹林抵抗密切相关的3 个单核苷酸多态性（SNPs）在汉族脑梗死患者中的分布特征进行调查研究，以期为深入探讨这些SNPs 对阿司匹林药效学、药动学、不良反应和阿司匹林抵抗的具体机制提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般临床资料

选择2016 年1 月—2022 年12 月首都医科大学附属北京潞河医院收治的475 例脑梗死患者，其中男性352 例，女性123 例；年龄33～100 岁，平均（68.13±11.65）岁。

纳入标准：（1）符合脑梗死的诊断标准[6]；（2）汉族；（3）已完成GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 个SNPs 检测；（4）病历资料完整。

排除标准：（1）不符合脑梗死诊断标准，或疑似脑梗死但未确诊；（2）非汉族；（3）未完成GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331) 和PTGS1(rs10306114) 3 个SNPs 检测，或仅完成其中的1～2 个SNPs 检测；（4）病历资料不完整。

1.2 SNPs 测定

SNPs 采用荧光染色原位杂交的方法进行测定。先用一次性真空抗凝采血管（EDTA 抗凝，紫帽管）采集患者外周静脉血标本2～3 mL，轻摇采血管，充分混匀，使血样与抗凝剂充分混匀；取150 μL 血样，加入1 mL 红细胞裂解液，充分混匀，静置10 min；3 000 r/min 离心10 min，弃上清；加入50 μL 核酸纯化试剂（北京华夏时代基因科技发展有限公司），充分混匀；分别取1.5 μL 混悬液至对应位点的测序反应通用试剂管（北京华夏时代基因科技发展有限公司）中，充分混匀，置于TL988A双通道实时荧光定量聚合酶链反应仪（西安天隆科技有限公司）中的相应位置，打开计算机Microseq微测序程序，设定参数，检测GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 个位点SNPs。

1.3 样本的群体代表性检验

运用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验样本的群体代表性[7]。对所选取的脑梗死患者人群的PEAR1(rs12041331)位点的基因型分布进行遗传平衡检验，以判断该样本群体对汉族脑梗死患者群体是否具有良好的代表性。

1.4 基因型频率的计算

分别根据GP Ⅲa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 个位点SNPs的检测结果，将所选取的汉族脑梗死患者个体归属为野生型纯合子、突变型杂合子或突变型纯合子。某基因型频率＝该基因型个体的数量/样本总数，如PEAR1(rs12041331)位点上，野生型纯合子基因型频率的计算方法为：野生型纯合子个体的数量/样本总数，突变型杂合子、突变型纯合子基因型频率的计算方法与之类似；GPⅢa PLA2(rs5918)和PTGS1(rs10306114) 2 个位点上野生型纯合子、突变型杂合子和突变型纯合子基因型频率的计算方法与PEAR1(rs12041331)位点也相同。

1.5 等位基因频率的计算

依照Hardy-Weinberg 遗传平衡定律[7]，若某个基因位点上只存在等位基因A、B，则A 等位基因频率P（A）＝（AA 型纯合子基因型样本数×2＋AB 型杂合子基因型样本数×1）/（样本总数×2）；B 等位基因频率P（B）＝（BB 型纯合子基因型样本数×2＋AB 型杂合子基因型样本数×1）/（样本总数×2），或P（B）＝100%－P（A）。

将本研究中汉族脑梗死患者样本中GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331) 和PTGS1(rs10306114) 3 个位点上所存在的等位基因频率与PharmGKB Aggregated、1000 Genomes（https://www.pharmgkb.org/）等数据库中收录的其他人群中相应等位基因频率进行比较。

1.6 统计学处理

使用SPSS 20.0 软件对本研究中的数据进行统计分析。计数资料用例数（百分数）表示，不同人群之间基因型频率和等位基因频率分布的差异性比较采用χ2检验或Fisher 精确概率法。

2 结果

2.1 样本的群体代表性检验结果

本研究中GP Ⅲa PLA2(rs5918)和PTGS1(rs10306114) 2 个基因位点上均出现了基因型的实际频数为0 的情况，故根据PEAR1(rs12041331)位点基因型的检测数据进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。对本研究中475 例汉族脑梗死患者PEAR1(rs12041331)位点基因型的检测数据进行Hardy-Weinberg 遗传平衡检验，该位点中3 种基因型，即GG、AG 和AA 分布的实际频数与理论频数基本一致（χ2＝0.53，P＝0.77＞0.05），说明该样本对汉族脑梗死患者人群具有良好的代表性，见表1。

表1 PEAR1 (rs12041331)位点基因型的遗传平衡检验Table 1 Genetic balance test of genotype at PEAR1(rs12041331) locus

2.2 各基因型的计数和频率

本研究中GP Ⅲa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 个位点上基因型的计数与频率见表2。其中GPⅢa PLA2(rs5918)位点上野生型纯合子（TT）占近99%，突变型杂合子（TC）所占的比例很低，未检测到突变型纯合子（CC）；PEAR1(rs12041331)位点上基因型变异程度较大，其中野生型纯合子（GG）和突变型杂合子（GA）所占比例均超过40%，而突变型纯合子（AA）较少；PTGS1(rs10306114)位点上全部为野生型纯合子（AA），未见突变型杂合子（AG）、突变型纯合子（GG）。

表2 检测位点的基因型计数和频率Table 2 Genotype count and frequency of gene locus

2.3 各位点上的等位基因频率

本研究中GP Ⅲa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 个位点上的各等位基因频率见表3。其中GPⅢa PLA2(rs5918)位点上，T 等位基因频率超过99%，C 等位基因频率不足1%；PEAR1(rs12041331)位点上，G、A 等位基因分别占64%、36%；PTGS1(rs10306114)位点上全部为A 等位基因，未见G 等位基因。

表3 各位点上的等位基因频率Table 3 Allele frequency of gene locus

2.4 其他人群中相关等位基因频率

将所调查的其他人群中GPⅢa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 个位点上的等位基因的分布情况进行汇总，见表4。T 等位基因在GPⅢa PLA2(rs5918)位点上的频率在不同人群中均较高，其中在西双版纳傣族人群中为100%，在北京汉族和越南京族人群中也接近100%，在孟加拉、英格兰和苏格兰、哥伦比亚麦德林以及巴巴多斯加勒比人群中均超过86%；所调查人群中A 等位基因在PTGS1(rs10306114)位点上的频率也较高，其中北京汉族、西双版纳傣族和越南京族人群中均为100%，在孟加拉、英格兰和苏格兰以及哥伦比亚麦德林人群中均超过90%；G 等位基因在PEAR1(rs12041331)位点上的频率在不同人群中分布的差异性较大，如在越南京族人群中为44%，而在英格兰和苏格兰人群中接近94%。

表4 其他人群中相关等位基因频率Table 4 Frequency of related alleles in other populations

2.5 相关等位基因的分布差异性

本研究中，GP Ⅲa PLA2(rs5918)、PEAR1(rs12041331)和PTGS1(rs10306114) 3 个位点上各等位基因在汉族脑梗死患者人群中的分布情况与所调查的其他人群进行差异性比较见表5。GPⅢa PLA2(rs5918)位点上，汉族脑梗死患者人群中T 等位基因频率（99.37%）与北京汉族、西双版纳傣族或越南京族人群相比，分布差异无统计学意义，但都明显高于孟加拉、英格兰和苏格兰、哥伦比亚麦德林以及巴巴多斯加勒比人群（P＜0.01）；PEAR1(rs12041331)位点上，汉族脑梗死患者人群中G 等位基因频率（64.21%）与北京汉族人群（60.19%）或孟加拉人群（63.37%）相比差异无统计学意义，显著高于西双版纳傣族、越南京族和巴巴多斯加勒比人群（P＜0.01），又显著低于英格兰和苏格兰人群以及哥伦比亚麦德林人群（P＜0.01）；PTGS1(rs10306114)位点上，汉族脑梗死患者人群中未见等位基因G 分布，A 等位基因频率为100%，等位基因分布与检索到的北京汉族、西双版纳傣族或越南京族人群的情况相同，A 等位基因频率都显著高于孟加拉、英格兰和苏格兰、哥伦比亚麦德林以及巴巴多斯加勒比人群（P＜0.01）。

表5 汉族脑梗死患者人群与其他人群相关等位基因的分布差异Table 5 Difference of allele frequencies between Chinese Han population with cerebral infarction and some other populations

3 讨论

阿司匹林抵抗现象的发生会对其抗血小板临床疗效产生严重影响，如Krasopoulos 等[8]进行了1项Meta 分析，共纳入20 项研究，2 930 例心血管疾病（部分合并脑梗死等脑血管疾病）患者，其中810 例患者（28%）存在阿司匹林抵抗，发现存在阿司匹林抵抗的患者发生心脑血管事件的风险显著升高；Guo 等[9]也发现，存在阿司匹林抵抗的急性脑梗死患者发生脑梗死复发的风险较不存在阿司匹林抵抗的患者更高。阿司匹林抵抗的发生机制复杂，目前其发生原因也尚未明确。近年来，基因多态性导致阿司匹林抵抗现象越来越引起相关领域学者的广泛关注，基因多态性也被证实为导致阿司匹林抵抗的重要原因[4,10-11]。大量研究表明，GPⅢa PLA2、PEAR1和PTGS1等基因多态性可能与阿司匹林抵抗的发生具有密切关系[12-14]。本研究选取475 例汉族脑梗死确诊患者，经Hardy-Weinberg 遗传平衡检验被证实为一个具有良好代表性的样本群体，对该群体中GPⅢa PLA2、PEAR1和PTGS1基因上的3 个重要SNPs 的分布特征进行系统研究。

血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）是位于血小板表面上的数量最多的一种受体，可与纤维蛋白原和血管性血友病因子结合[15]。GPⅡb/Ⅲa 与纤维蛋白原结合是血小板聚集及血栓形成的最终共同途径[16]。编码GPⅢa亚基的基因主要存在PLA1、PLA2两种等位基因亚型，已被证实在人群中普遍存在[17]。目前GPⅢa基因在冠心病人群中研究较多，在脑梗死人群中研究却较少[18]。有证据表明，PLA2等位基因可能与急性血栓形成或脑卒中发生有关[17]。本研究调查的汉族脑梗死人群中，GPⅢa PLA2(rs5918)位点上野生型纯合子（TT 型）占98.74%，突变型杂合子（TC 型）占1.26%，无突变型纯合子（CC 型）。李达伟[18]报道76 例脑梗死患者（未限定为汉族）中，TT 型占74 例（97.37%），TC 型占2 例（2.63%），也无CC 型，与之相比，本研究GPⅢa PLA2(rs5918)位点上基因型的分布无统计学差异。本研究中，该位点上的等位基因频率（T＝99.37%，C＝0.63%）也与李达伟[18]报道（T＝150/152＝98.68%，C＝2/152＝1.32%）类似。此外，GPⅢa PLA2(rs5918)位点上等位基因频率与北京汉族、西双版纳傣族或越南京族人群相比也无统计学差异，由于本研究中研究对象为脑梗死患者人群，而后3 类人群为一般人群，故提示GPⅢa PLA2基因多态性尽管可能与阿司匹林抵抗的发生有关，但与脑梗死疾病本身的发生可能并无关联。

血小板内皮聚集受体-1（PEAR1）是一种含有表皮生长因子重复序列的跨膜受体，已被证实参与血小板接触诱导的活化[19]。PEAR1基因多态性可影响血小板功能和血小板聚集过程而成为心血管疾病的危险因素[20]；陈静静等[21]研究表明，PEAR1(rs12041331)位点多态性是阿司匹林抵抗的独立危险因素，该位点中等位基因A 与脑梗死患者发生阿司匹林抵抗有关。郭宏伟等[22]报道的150 例初发脑梗死患者中，PEAR1(rs12041331)位点AA 型59 例（39.33%），GA 型38 例（25.33%），GG 型53 例（35.33%），与本研究中该位点上基因型的分布存在显著差异（χ2＝48.12，P＜0.01），可能与其研究对象并非全部为汉族患者有关，也可能与样本量大小有关，还可能是由于其研究对象为初发脑梗死，而本研究中未对初发脑梗死或复发脑梗死患者进行限定。本研究中汉族脑梗死患者人群中PEAR1(rs12041331)位点的基因型分布与西双版纳傣族、越南京族、英格兰和苏格兰以及哥伦比亚麦德林人群存在显著差异，但与北京汉族人群无差异，也可能是由于该位点基因多态性尽管可能与阿司匹林抵抗有关，但与脑梗死的发生无关。

阿司匹林抗血小板药理作用的靶点COX-1 受其编码基因PTGS1（前列腺素内过氧化物合成酶1，也称为环氧合酶或COX-1）影响[23]，故阿司匹林抵抗发生也与PTGS1基因多态性有关，许海宁等[24]研究发现，PTGS1基因多态性是急性脑梗死患者发生阿司匹林抵抗的危险因素之一。本研究中汉族脑梗死患者人群中PTGS1(rs10306114)位点上全部（100%）为AA 型，未见等位基因G，该位点上等位基因频率与数据库中收录的与北京汉族、西双版纳傣族或越南京族人群相同，后3 类人群该位点上也全部（100%）为等位基因A；而Cao 等[25]报道的858 例脑梗死患者中，PTGS1(rs10306114)位点上AA 型共856 例（99.77%），AG 型仅2 例（0.23%），与本研究相比，该位点上的基因型分布也无统计学差异，但其报道中出现了AG 型，可能与其样本量更大也有关，也可能为其纳入的脑梗死患者并非全部为汉族患者。

总之，本研究对汉族脑梗死患者中阿司匹林抵抗相关基因上3 个重要SNPs 的分布特征进行了调查分析，发现GPⅢa PLA2(rs5918)位点上以野生型纯合子为主，占近99%，PTGS1(rs10306114)位点上全部为野生型纯合子，未见突变，而PEAR1(rs12041331)位点上突变常见，野生型纯合子（GG型）仅占40%左右。部分研究结果与既往报道结果相同，也有部分研究结果与既往报道或相关数据库中收录的其他人群有所差异。建议脑梗死患者使用阿司匹林时进行相关基因位点检测，并根据检测结果精准用药。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突