化痰祛湿方对肥胖型多囊卵巢综合征大鼠的改善作用及对TGF-β/CTGF通路的影响❋

岳美宏,姜大成,雷钧涛

(1.长春中医药大学药学院,长春 130117;2.吉林医药学院药学院,吉林吉林 132013)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是常见的内分泌疾病,临床表现为月经不调,脱发及不孕等[1]。PCOS的发病机制至今尚未明确,目前认为激素水平失调,胰岛素抵抗以及卵巢间质纤维化均与PCOS的发生密切相关[2]。西医主要以药物或手术为主,对于改善PCOS患者激素水平等临床症状效果显著,但后期复发率较高,因此本研究考虑中药干预[3]。中医认为,痰湿蕴结是肥胖型PCOS的重要病理特征,应以祛湿化痰为立法原则,化痰祛湿汤出自《证治宝鉴》卷十二,具有改善痰湿体质的功效,但作用机制尚不明确[4-5]。卵巢间质纤维化是导致PCOS的重要原因,而转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)水平与卵巢间质纤维化程度有关[6-7]。故本研究选用化痰祛湿方治疗肥胖型PCOS,观察化痰祛湿方对肥胖型PCOS大鼠卵巢组织TGF-β、CTGF的影响,以期为PCOS的治疗提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级、SD雌性大鼠45只,体质量185～225 g,平均(205±20)g,购于北京百奥赛图基因生物技术有限公司,实验动物许可证为[SCXK(京)2020-0007],本研究已通过本院伦理委员会批准,伦理批准文号:2020-0175。

1.2 药物

二甲双胍片(国药准字H20023371,中美上海施贵宝制药有限公司,规格:0.5 mg);来曲唑(国药准字H19991001,江苏恒瑞医药股份有限公司,规格:2.5 mg)。

化痰祛湿方组方:薏苡仁30 g,泽泻30 g,茯苓10 g,白术15 g,半夏10 g,藿香10 g,猪苓10 g,赤芍25 g,天竺黄12 g,石菖蒲12 g,蒲黄12 g,陈皮12 g[8]。所有药材洗净后浸泡20 min,并加入水没过药材,煮沸后文火浓缩至50 mL,并根据配方将生药浓度调整为为5 g/mL,作为储存液,使用进行稀释,化痰祛湿方所用药物均由本研究中心于海口市张仲景大药房集中采购。

1.3 主要试剂及仪器

戊巴比妥钠(CAS号:57-33-0),上海哈灵生物科技有限公司;中性甲醛(CAS号:50-00-0),北京华科盛精细化工产品贸易有限公司;苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色试剂盒(货号:YT8310),北京伊塔生物科技有限公司;RNA提取试剂盒(货号:FT30506yy),上海梵态生物科技有限公司;实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒(货号:qPCR001),北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;TGF-β单克隆抗体(货号:IBIO-17268R)及山羊抗兔二抗(货号:IBIO-18015R),江西艾博因生物科技有限公司;CTGF单克隆抗体(货号:A-6216-100)及山羊抗兔二抗(货号:A-6233-100),美国Epigentek公司;SIGMA/3-18KS型台式高速冷冻离心机,北京博劢行仪器有限公司;BS-350型全自动生化分析仪,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;UV-9000型紫外分光光度计,上海添时科学仪器有限公司;BT-2型电泳仪,俄罗斯Service公司。

1.4 大鼠模型建立

选用45只动情周期正常的雌性大鼠,于22 ℃,湿度50%,通风,洁净度一万级的环境下进行适应性饲养,所有大鼠均记录初始体质量,随机选取8只为对照组,进行基础饲料喂养,其余大鼠建立肥胖型PCOS模型。除对照组外,其余组给予高脂混悬液联合来曲唑(letrozole,LE)进行诱导,每天给予高脂混悬液15 mg/kg,同时给予LE 1 mg/kg,连续给药28 d,给药18 d后,每日进行阴道脱落细胞涂片,第28天记录大鼠体质量。大鼠动情周期紊乱,同时体重增长率高于对照组即判定为肥胖型PCOS大鼠模型建立成功[9]。

1.5 分组及药物干预

建模过程中5只大鼠建模失败,其余大鼠随机分为模型组,化痰祛湿方高、低剂量组及阳性组4组,每组各8只。

建模成功后,根据人与大鼠的体重及给药剂量换算公式,阳性组给予0.3 g/kg二甲双胍,低、高剂量组分别给予16.65 g/kg、83.25 g/kg化痰祛湿汤,对照组、模型组给予等量的氯化钠溶液,均灌胃给药,1次/d,连续给药21 d。

1.6 取材

最后一次给药后,禁食12 h,对大鼠进行体质量称重并记录,采用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,采集大鼠股动脉血5 mL,室温放置1 h,离心(2000 r/min,10 min,离心半径12 cm)分离上层血清,于-80 ℃环境下冻备用。血液采集完成后迅速将大鼠处死,并于无菌环境下取出右侧卵巢组织,并将周围血管及脂肪组织分离,每组四只置于4%多聚甲醛中固定处理,用于HE染色,另外四只迅速置于液氮10 min后,于-80 ℃环境下冷冻保存,用于RT-qPCR及Western Blot检测。

1.7 测量指标

1.7.1 大鼠血清激素水平 取5 mL上层血清,室温解冻,采用放射免疫法检测血清黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)、睾酮(testosterone,T)、雌二醇(estradiol,E2)水平,严格按照相应试剂盒说明书进行操作[10]。

1.7.2 大鼠卵巢组织病理检测 取4%中性甲醛固定的卵巢组织样本,脱水,透明,浸蜡,包埋,制备成4 μm切片,加入染液进行HE染色,将切片置于光镜下观察卵巢组织病理学变化[11]。

1.7.3 RT-qPCR检测大鼠卵巢组织TGF-β、CTGF mRNA表达情况 取部分液氮保存的卵巢组织,根据TRIzol试剂盒说明书提取卵巢组织总RNA,经逆转录得到cRNA,根据RT-qPCR试剂盒检测卵巢组织TGF-β、CTGF mRNA表达。RT-qPCR反应体系:SYBR 10 mL,上游引物0.4 μL、引物0.4 μL,cDNA模板2 μL,H2O加至20 μL;反应条件:先95 ℃作用2 min;变性95 ℃ 10 s,退火58 ℃ 15 s,延伸72 ℃ 10 s,循环40次[12]。GAPDH为内参基因,2-△△CT为目的基因相对定量,引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7.4 Western Blot注检测大鼠卵巢TGF-β、CTGF蛋白表达情况

取液氮保存的卵巢组织,加入适量缓冲液研磨成匀浆,加入裂解液对卵巢组织进行裂解处理,低温环境下离心5 min(2000 r/min,10 min,离心半径12 cm),取上清,比色法测定蛋白浓度,并进行电泳法分离蛋白质,电泳后湿转法转膜,分别加入一抗TGF-β、CTGF及内参(稀释浓度1:500),山羊抗兔二抗(稀释浓度1:1000),经化学发光强度(enhanced chemiluminescence,ECL)显影得到结果[13]。[蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度值(integral optical density,IOD)/GAPDH IOD]。

1.8 统计学方法

结果

2.1 大鼠体质量比较

与对照组比较,模型组体质量升高(P<0.05);与模型组比较,低、高剂量组及阳性组体质量降低(P<0.05);高剂量组与阳性组上述指标改善效果均优于低剂量组大鼠(P<0.05),具体见表2。

表2 大鼠体质量比较

2.2 大鼠血清性激素水平比较

与对照组比较,模型组血清LH、T水平升高,FSH、E2水平降低(P<0.05);与模型组比较,低、高剂量组及阳性组血清LH、T水平降低(P<0.05),FSH、E2水平升高(P<0.05);高剂量组与阳性组上述指标改善效果均优于低剂量组大鼠(P<0.05),具体见表3。

表3 大鼠血清性激素水平比较

2.3 大鼠卵巢组织病理检测

对照组卵泡数量多,种类丰富体积大,颗粒细胞层多,卵泡生长发育良好。模型组囊状卵泡和闭锁卵泡数增加,颗粒细胞层减少,可见闭锁卵泡。与模型组比较,低、高剂量组:扩张卵泡数、闭锁卵泡数明显减少,卵泡颗粒细胞层逐渐增厚,其中高剂量组及阳性组卵巢内可见成熟卵泡,具体见图1。

注:黑色箭头表示颗粒细胞层,红色箭头表示成熟卵泡A.对照组;B.模型组;C.低剂量组;D.高剂量组;E.阳性组

2.4 大鼠卵巢组织TGF-β、CTGF mRNA及蛋白表达量情况

与对照组比较,模型组TGF-β、CTGF mRNA水平升高(P<0.05),TGF-β、CTGF蛋白表达上调(P<0.05);与模型组比较,低、高剂量组及阳性组的TGF-β、CTGF mRNA水平降低,TGF-β、CTGF蛋白表达下调(P<0.05);高剂量组与阳性组上述指标改善效果均优于低剂量组大鼠(P<0.05),具体见图2、表4。

A.对照组;B.模型组;C.低剂量组;D.高剂量组;E.阳性组

表4 大鼠卵巢组织TGF-β、CTGF mRNA及蛋白表达量比较

3 讨论

PCOS是常见的内分泌综合征,可导致女性月经紊乱、排卵障碍,不孕不育等,半数以上的患者伴随肥胖[14]。PCOS的病因复杂,其发生由多种因素相互作用形成,目前发病机制尚不清楚。中医将PCOS归属于“月经失调”“不孕症”及“肥胖”等范畴。其中肾虚痰湿型最为常见,主要由于脾肾亏虚导致体内水液代谢失常,形成痰湿,逐渐使卵巢表现出多囊性[15]。西医治疗PCOS短期效果显著,但后期病情反复无法根治,目前研究证实中药对于PCOS具有一定的疗效,根据PCOS的中医证型,本研究选用化痰祛湿方进行中药调理,该方由薏苡仁、泽泻、茯苓、陈皮等药物组成,其中薏苡仁、泽泻具有利水除湿,清热泄热的功效,茯苓、白术则具有健脾益气,渗湿利水的功效;天竺黄、石菖蒲具有清热化痰,凉心安神,化湿开胃的功效;半夏能燥湿,化痰,止呕;藿香芳香化湿;猪苓利水渗湿;赤芍清热凉血,散瘀止疼;蒲黄止血,散瘀,利尿;陈皮则可健脾化痰。综合用药该方具有健脾、化痰以及祛湿等的功效,符合脾虚痰湿型、痰瘀互结型及肾虚血瘀型等大部分类型的PCOS,旨在改善卵巢功能,促进排卵。

本研究通过建立胖型PCOS大鼠模型发现,模型组血清LH、T水平、体质量升高,FSH、E2水平降低,说明PCOS大鼠能够导致肥胖,同时性激素水平紊乱。不同剂量的化痰祛湿方干预后,低、高剂量组及阳性组血清LH、T水平、体质量降低,FSH、E2水平升高,提示化痰祛湿方对于改善大鼠激素水平,促进排卵效果明显,其中高剂量化痰祛湿方效果尤为显著,提示化痰祛湿方在改善大鼠激素水平方面具有一定的效果,同时对于肥胖型大鼠的体重具有一定的控制作用。临床药理学显示,天竺黄、石菖蒲、半夏及陈皮等化痰类药物可以降低机体脂肪堆积,从而降低PCOS大鼠体重增厚卵巢细胞层,改善卵巢形态[16]。研究证实,补肾、化痰等药方能够有效降低机体行性激素与胰岛素水平,促进排卵,半夏、天竺黄等具有化痰作用,能够激活腺苷酸,从而进一步活化蛋白激酶α基因,使脂质代谢紊乱得到明显的改善,因此对肥胖型PCOS起到治疗作用,从而引起卵巢闭锁卵泡数减少,卵泡颗粒细胞层增厚,PCOS的改善效果明显[17-18]。

近年来研究证实卵巢纤维化是PCOS的发病机制之一[19]。卵巢局部产生的生物活性因子在多囊卵巢纤维化的过程有着重要作用,TGF-β,CTGF与卵巢间质纤维化密切相关。TGF-β是生物活性因子中的一种,能够调节细胞生长、分化,同时能够促进成纤维细胞的生长,同时,TGF-β是纤维化发生与发展的启动按钮,CTGF是在TGF-β的刺激下诱导产生,主要介导TGF-β的促纤维化作用,二者相互作用,加速ECM沉积,促进卵巢器官纤维化的发展,在PCOS等多种组织器官纤维化疾病中发挥重要作用[20-21]。本研究中模型组TGF-β、CTGF mRNA水平升高,TGF-β、CTGF蛋白表达上调,提示肥胖型PCOS由TGF-β/CTGF信号传导通路诱导,化痰祛湿方干预后,TGF-β、CTGF mRNA水平降低,TGF-β、CTGF蛋白表达下调,表明化痰祛湿方对肥胖型PCOS可能通过抑制TGF-β/CTGF信号通路发挥作用。化痰祛湿方能够抑制TGF-β/CTGF信号通路的表达,抑制TGF-β诱导产生CTGF,阻碍卵巢纤维化的发展,从而起到改善PCOS的作用。

综上所述,化痰祛湿方能够改善肥胖型PCOS,其作用机制可能与TGF-β/CTGF信号通路有关。未来可通过TGF-β/CTGF的抑制剂进一步探究该通路对肥胖型PCOS的调控作用,为化痰祛湿方在肥胖型PCOS中的广泛应用提供更加全面的科学依据。