基于敏感肌形成机制的舒缓成分评价方法研究

袁春颖，韩婷婷，李 燕，姜姗姗，刘三岭，冷佳蔚，杨素珍*

（1. 山东福瑞达生物股份有限公司，山东 济南 250101；2. 山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101）

敏感性肌肤是一种特殊的皮肤类型，不属于皮肤病的范畴。敏感肌易出现皮肤干燥、泛红、脱屑、红斑、丘疹、肿胀、脓包、水疱、毛细血管扩张等客观症状，同时也易出现瘙痒、刺痛、灼烧、紧绷等主观症状；更有甚者，当皮肤敏感情况严重时，也可能出现负面情绪或精神症状。根据世界卫生组织调查，皮肤敏感已成为皮肤的一种常态，亚洲女性中敏感性肌肤人群比例已超过50 %[1]；在全球范围内，有高达71 %普通成年人发生某种程度的肌肤敏感，而40 %人群有中度或重度的肌肤敏感[2-3]。

敏感肌的产生是一个复杂的过程，由外而内涉及皮肤表面的微生态屏障、表皮屏障、神经系统和炎症反应等多个方面，改善敏感肌常需通过皮肤护理、调整生活习惯、避免接触刺激源等方式缓解或避免。目前市面上用于改善肌肤敏感的原料和护肤产品众多，效果也参差不齐，因此，建立全面有效的功效评价体系是一项亟待完善的工作。本文从敏感肌的形成机制出发，介绍了包括细胞、3D模型、动物和人体等4个维度上的功效靶点和检测方法，为舒缓、抗敏感功效成分的研发提供科学依据和理论基础。

1 皮肤敏感机制

1.1 基于微生态失衡的皮肤敏感机制

皮肤是人体最大的器官，其表面环境与微生物群落组成的微生态系统构成了皮肤的第一道屏障[4-5]，微生物群落的组装、稳定和功能的执行由宿主和微生物之间相互作用来驱动。当皮肤微生物群与宿主和外部环境平衡稳定时，皮肤表现为健康状态；若皮肤微生物群与宿主和外部环境失衡时，皮肤屏障受损，则出现各种皮肤问题[6-7]。如在特应性皮炎（AD）患者的皮肤中检测出金黄色葡萄球菌的丰度更高，表皮屏障受损更严重，白介素4（IL-4）、白介素13（IL-13）、白介素22（IL-22）、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）和其他与AD相关的细胞因子的表达升高[6]，加剧皮肤炎症。因此，稳定皮肤微生态，是改善敏感肌的一大重要关注点。

1.2 基于表皮屏障功能受损的皮肤敏感机制

狭义上的皮肤屏障一般指表皮层，尤其是与角质层结构相关的屏障功能，干燥、脱屑等症状均是敏感肌肤最直接的表现。其原因主要是外界刺激后，角质细胞排列错乱，细胞间基质成分破坏降解，角化包膜不能正常形成，导致角质层结构改变，通透性增加、水分的维持能力受损、屏障功能异常。表皮屏障功能受损不仅与特应性皮炎、银屑病、黄褐斑、痤疮等疾病[8]的发生密切相关，同样也是敏感肌形成的重要原因，因此，为改善皮肤的敏感情况，需着重关注皮肤表皮屏障功能的损伤及修复情况。

表皮层形态及结构的完整是发挥屏障功能的基础，任何结构受损均直接或间接导致敏感肌或加重敏感症状。何黎等[9]构建了长链非编码RNA（lncRNA）和信使RNA（mRNA）的共表达网络，通过全基因组测序筛选敏感肌肤与非敏感肌肤的差异基因，发现IncRNA LNC 000265这一的差异化最大，它与编码紧密连接蛋白5的序列具有高度相关性，紧密连接蛋白5在真表皮连接处发挥至关重要的作用；兜甲蛋白、外周蛋白和富含脯氨酸的小蛋白在转谷氨酰胺酶1，3和5的催化下与神经酰胺发生交联，形成角化包膜，保护和防止水分流失[10]；丝聚蛋白在角质细胞从颗粒层向角质层过渡的过程中，被多种酶（如基质蛋白酶、弗林蛋白酶、成对氨基酸转化酶-4）去磷酸化，聚集角蛋白的中间细丝，形成最外层的角质屏障[11]；除此之外，内膜蛋白水通道蛋白3可在细胞膜上形成“孔道”，像细胞的“水泵”一样控制水的进出[12]。表皮屏障的正常功能不仅依赖于其正确的形态结构，还需有充足且完整的生化成分。透明质酸是细胞外基质的最大成分，具有非常强的水结合能力；皮肤中天然存在的神经酰胺可形成防水屏障，减少水分流失，而神经酰胺链长度减少对角质层的渗透性有很大的负面影响，特应性皮炎患者中有观察到神经酰胺链长度减少[13-14]。

1.3 基于神经反应的皮肤敏感机制

敏感皮肤中的感觉受体在接触到外界刺激时，经神经末梢与神经元的逐级信号传递，最终在大脑皮层形成疼痛、瘙痒等感觉，若皮肤的神经反应性过于敏感，感觉受体表达异常，均有可能导致皮肤敏感。Misery等[15]发现瞬时受体蛋白（TRP）的激活与Ca2+调控通道密切相关，非兴奋细胞外的Ca2+浓度低，膜内外浓度差小，便无法形成感受电位，当受到刺激时，Ca2+内流，膜内外浓度差变大，产生动作电位，神经递质传递从而介导疼痛等神经变化。刺激源不同会激活不同的瞬时性受体电位通道（TRPV），从而传递不同的神经信号：辣椒素或热源可激活辣椒素受体（TRPV1）[16]，传递热感或灼烧感；激活瞬时性受体电位通道4则引起瘙痒与疼痛感[17]；TRPM8主要传递冷感[18]。临床试验结果表明，敏感肌肤的表皮内神经纤维的数量明显减少，C纤维和Aδ纤维群也发生了改变[15,19]。

1.4 基于炎症反应的皮肤敏感机制

与正常皮肤相比，敏感性皮肤对外源性刺激和过敏原的攻击防御能力相对较差，很容易因刺激或过敏而产生一系列炎症反应[20]。据报道，美国儿童和成人群体中AD的流行率分别为11.3 %～12.7 %和6.9 %～7.6 %[21]。白介素（IL）是白细胞或免疫细胞间相互作用的最主要淋巴因子，参与不同的信号通路调控各类生理活动。IL-14和IL-13 两型细胞因子能促进趋化因子的产生、诱导皮肤屏障功能障碍、抑制抗菌肽的表达[22-23]；IL-31可促进脑源性利钠肽的产生和释放，调控致炎因子和趋化因子释放，诱导AD患者的瘙痒感[24]；IL-17能减少丝聚蛋白和外披蛋白的表达，加剧皮肤的屏障损伤[25-26]。区别于T淋巴细胞产生的多种细胞因子，IL-33是在皮肤遭受感染、炎症或损伤时由各种组织的驻留细胞产生，通过影响造血干细胞的功能引发炎症，与非炎症皮肤相比，AD患者皮肤中IL-33的表达水平大幅升高[27]。

2 改善敏感肌成分的评价方法研究

2.1 基于微生态平衡的改善敏感肌成分的评价方法

目前在化妆品中人为干预或调控皮肤微生态平衡、增加菌群多样性的方法主要是添加应用发酵技术开发的益生菌、益生元、后生元和合生元等，屈畅[28]指出对微生物的菌群丰度及多[29-30]样性进行检测是反映化妆品原料干预效果最直观的评价形式。基于改善皮肤微生态的原料评价思路可概括为采样-检测-分析3个阶段。常用的采样手段主要有无菌棉签擦拭皮肤进行大规模采样、胶带粘取或剥脱收集表层皮肤样本、针孔穿刺取样等[30]。对于菌群的检测手段经历了从凝胶平板技术和低聚糖生物选择性技术到DNA测序技术的精确性跨越。通过凝胶平板培养活菌菌落，对其进行分离、计数和鉴定是传统的培养方法，但是受限于实验室条件不能完美复原或实现菌种的最优生长环境，可实现体外培养的菌种有限；房晓[29]用大多数共生菌群均能利用低聚糖做为碳源，利用致病菌群则没有代谢低聚糖能力的这一特性，对基体中碳残留量进行对比，间接反映共生菌与致病菌的生存及定殖情况，但它仅能依据低聚糖的种类将菌种的范围鉴定在属水平。DNA测序技术弥补了以上两种方法的缺陷，传统的测序方法如扩增子测序，利用保守的基因序列进行扩增，通过扩增循环数间接反映含量变化，如细菌多采用16S核糖体RNA（16S rRNA），真菌则优选内部转录间隔区1（ITS1）为各自的保守序列进行扩增[31-32]，根据扩增子的测序分析可确定属和物种水平的群落组成及变化。近年，随着重大技术和分析方法突破，利用鸟枪法宏基因组测序成为可能，不需靶向序列扩增，且不需对特定目标区域进行测序，即可同时捕获包括人类、细菌、真菌、古细菌和病毒样本中的所有遗传物质[33-36]，揭示其在界和菌株水平上的相对丰度。

2.2 基于表皮屏障功能的改善敏感肌成分的评价方法

针对表皮屏障功能相关的靶点，可在人体、离体皮肤、皮肤外植体、3D全层皮肤模型、3D表皮模型及2D细胞上进行不同维度的生物及化学方法检测。基于离体皮肤、皮肤外植体、3D全层皮肤模型、3D表皮模型，可直观地在显微镜下观察角质细胞排列状况判断屏障结构的完整性，在此基础上升级的苏木精-伊红（HE）染色法，通过颜色变化可更为直观地观察到角质层厚度变化及角质形成细胞的活性。对于各个靶标蛋白的检测方法则更多元化，如对某一目标蛋白进行特异的荧光染色，目前常用的标记染料如FITC、GFP等，根据其荧光面积及强度分析目标蛋白的表达是否增加；蛋白免疫印迹技术（western blotting）可在提取的总蛋白中特异性标记出目的蛋白，通过比较目的蛋白的灰度即可判断相应蛋白的表达量，与此原理相似的方法还有酶联免疫吸附测定（ELISA），同样可精准识别并定量总蛋白中的特异性目的蛋白。通过渗透实验，根据荧光染料进入皮肤模型的情况确定表皮的通透性，若进入模型的染料增多，则皮肤的通透性增大。基于透明质酸钠、神经酰胺、长链/短链脂肪酸、天然保湿因子等细胞间各生化成分的检测，可采用紫外检测、高效液相色谱和液质联用[37-38]等方法；雷曦利用ATP或底物剩余量的酶促反应动力学实验检测透明质酸酶的抑制率，其抑制率越高，屏障修护功效越强[39]。

离体皮肤资源较难获得，皮肤外植体及3D皮肤模型的普及和使用难度较高，基于2D细胞层面的功效评价较容易实施与开展。在2D细胞层面，通过噻唑蓝（MTT）比色法、Cell Counting Kit-8（CCK-8）、中性红染色等常规方法检测细胞活性与增殖情况；通过细胞划痕实验检测细胞的迁移率，多角度验证功效成分对皮肤特征性细胞的直接作用。收集功效成分干预后的细胞，破碎提取其总蛋白，利用Western Blotting、特异性荧光染色、ELISA等方法继续特定蛋白的表达检测，同时还可裂解细胞提取总RNA，用实时荧光定量PCR方法进行基因层面的分析与检测。

在人体维度，除了借助调查问卷通过消费者的自我评估获得相应数据外，还可借助仪器测量获取直观数据，如皮肤水分测试仪（corneometer）可检测功效成分使用前后皮肤含水量的变化，VISIACR可对采取面部成像进行红区的a*值分析；经皮水分散失值（TEWL）则可利用经皮水分散失测试仪（如aqua flux）获得。

2.3 基于神经反应的改善敏感肌成分的评价方法

对具有神经舒缓功效的成分进行评价时，可从神经镇静的角度出发，镇静效果越好，则舒缓功效越强，主要思路是通过比较原料作用前后相关神经纤维的密度、受体蛋白的表达或激活水平及Ca2+电位变化进行评估，其神经纤维的密度越接近于正常肌肤，感觉受体蛋白的激活与表达数量越少，Ca2+的内流情况得到抑制，则舒缓功效越强。

刘栋等[40]借助Ca2+选择性微电极进行穿刺，检测内充液在细胞内外的电位差，检测功效成分的舒缓功效；刘丽娜等[41]用放射性同位素标记Ca2+，检测含量变化；刘丽娟等[42]用Fura2、Indol、Fluo-4AM等荧光指示剂标记Ca2+，通过流式细胞仪、荧光分光光度计或荧光显微镜联合检测Ca2+变化。针对受体表达方面，Scandolera等[43]开发了正常人星形胶质细胞的炎症模型模拟敏感皮肤中与神经炎症相关的疼痛感应，并证实红色微藻提取物中的γ-氨基丁酸（GABA）及其结构衍生物GABA-丙氨酸能抑制TRPV1的表达，缓解敏感；Zhou等[44]利用角质形成细胞的炎症模型发现柑橘果实提取物能通过抑制TRPV1激活，缓解辣椒素、乳酸、苯氧乙醇等引发的神经高反应，增强皮肤的耐受性。

2.4 基于炎症反应的改善敏感肌成分的评价方法

炎症导致皮肤的血管增生、口径增大，斑马鱼炎症诱导试验可用于观察降低炎症因子IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达后血流速度与血管口径的变化[45]；此外，小鼠实验表明痔九味镇痛膏能有效抑制皮肤毛细血管通透性增加，对祛肿功效评价有一定借鉴意义。在炎性渗出过程中，白细胞通过黏附因子与内皮细胞先发生粘连游出，然后在趋化因子和细胞因子的牵引下向炎区移动，因此黏附因子、趋化因子的表达情况也间接反映了白细胞的流出与趋化情况。潘虎[46]通过培养体外鼻息肉和皮肤组织，检测到组胺和花生四烯酸能诱导单核细胞趋化因子蛋白-1（MCP-1）、单核细胞趋化因子蛋白-3（MCP-3）、活化后可调节的正常T细胞表达分泌因子（RANTES）等趋化因子和IL-4、IL-5和TNF-α的表达，导致炎症的发生；5-脂氧合酶（5-LOX）及环氧合酶1/2（COX1/2）不仅是花生四烯酸代谢的主要动力酶，同样也是各种舒缓成分的主要作用靶点，花生四烯酸会通过5-LOX介导的脂质氧化酶途径和 COX-1/2介导的环氧化酶途径分别生成白三烯和前列腺素，吴丹丹[47]通过二氧化钛纳米管固定酶筛选出忍冬中的槲皮素、木犀草素、忍冬苷等10种化合物对5-LOX具有较好的抑制功效。由于抗原呈递细胞数量和形式的限制很难在体外培养，因此用CD54/CD86在人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）上的表达增加作为等效替代指标[48]。通过比较THP-1上CD54/CD86的相对荧光强度（RFI）的影响程度，判断其作用效果：在THP-1细胞的存活率大于50 %的前提下，如果RFICD86≥150或者RFICD54≥200，则表示有促炎作用。

除此之外，针对各类白介素的检测也是舒缓功效成分的主要检测靶点。Johnston等[49]通过转录组及差异基因富集分析发现IL-1和IL-36是广泛性脓疱型银屑病的主要细胞因子，战紫莹通过酶联免疫吸附法、HE染色、免疫荧光染色等实验证实菊科植物木香中的木香烃内酯可抑制IL-36[50]介导的银屑病样皮肤炎症；包括阿达木单抗、英夫利昔单抗、依那西普、赛妥珠单抗和戈利木单抗在内的TNF-α抑制剂[51]，能很好地抑制AD的发生。

3 展望

敏感皮肤形成原因包括微生态屏障失衡、表皮屏障功能受损、神经反应敏感及炎症反应。本文将抗敏感活动分为四步评价法：维持微生态平衡能力、表皮屏障修复能力、神经镇静能力和抗炎能力；按照上述分类，在进行舒缓成分的功效评价工作时，分别通过体外细胞、3D皮肤模型、动物或相应的人体实验进行筛选和改进，以建立系统的基于敏感皮肤产生机制的原料评价方法，为筛选出更好的改善皮肤敏感的化妆品原料提供科学的依据及理论基础。

然而，在皮肤微生态、神经因素及抗炎能力的评价方法方面，目前有很多细胞因素及其生理功能尚未分析完全，各种体外培养的人体皮肤细胞和3D皮肤模型无法完全还原机体的变化情况，因此，我们仍需要从多方面、多层次继续探索分析敏感皮肤的成因，寻找更加合适的抗敏感成分的功效评价方法，建立更加完善的评价体系。