中医肿瘤基础实验模型研究现状与进展

吴先林， 江海媚， 张锦芳， 黄海福

广州中医药大学深圳医院（福田），深圳市中医肿瘤医学中心，广东 深圳 518000

当前，恶性肿瘤仍然严重威胁人类健康。我国是世界第一人口大国，癌症新发人数远超世界其他国家。据统计，全国每日大约有1.25 万人确诊癌症。近30年来，我国癌症死亡率增加了80%，发病率与死亡率呈持续上升趋势，癌症已成为国人的第一杀手。2020年，中国新发癌症457万人，占全球新发人数的23.7%，死亡人数300 万，占全球癌症死亡人数的30%，远超其他国家[1]。

肿瘤属于中医“癥瘕”、“积聚”和“岩”等范畴，也有具体部位的肿瘤如“瘰疬”、“噎膈”和“肠蕈”等。中医学对肿瘤的发病成因认识，不外乎内因和外因。内因最主要是机体正气不足，外因包括外感六淫、饮食七情所伤，以及气滞、血瘀、痰凝和毒结等病理产物的长期作用[2]。中医药是治疗肿瘤的重要手段，在多年的临床实践中，中医药治疗肿瘤已经形成了扶正固本、以毒攻毒、活血化瘀、清热解毒和软坚散结等治则治法，在减轻患者痛苦、延缓肿瘤组织扩散、改善生活质量和延长生存期等方面，发挥了重要的作用[3]。

中医实验研究在探索肿瘤的中医病因病机、验证中药方剂的有效性和安全性以及阐明中药的作用机制和药效规律等方面具有重要的作用。肿瘤实验模型是中医肿瘤学的重要研究对象，基于中医“辨证论治”的独特性，中医肿瘤实验模型具有一定的特殊性。本文结合中医肿瘤证候动物模型、类器官模型和细胞模型的最新研究现状，阐述实验模型在中医肿瘤学中的应用和前景，希冀为中医肿瘤研究提供思路与依据。

1 肿瘤的中医证型相关的实验动物模型

中医证型动物模型是指根据中医证型的特点和临床表现，在中医整体观念及辨证论治思想指导下，结合中医病因病机理论，依据人类疾病原型制定模型构建方法，最后制作成中医证候临床表现相符的动物模型。中医证候动物模型主要分为病的模型、证的模型和病证结合模型三大类。

1.1 中医证候模型研究概述

疾病动物模型是研究疾病发生、发展机制和筛选出最有效、最安全的治疗方法的动物模型，主要制作方法是采用不同致病因素诱导动物产生相对应的疾病，如化学致癌、病毒感染和手术等。常用的疾病模型动物包括小鼠模型、大鼠模型、兔子模型、狗模型和猴子模型等，它们被广泛应用于药物研发、疾病机制研究和毒理学研究等领域[4]。证候动物模型是中医特有的动物模型，是运用中医病因病机理论，将“证”形成的内外因直接施加在动物身上所构建的动物模型。如外感六淫证候模型，可模拟高温、低温、高湿或低湿等不同饲养环境，闵莉等[5]采用高胆固醇致石饲料结合人工气候箱模拟湿热环境，制作小鼠胆固醇结石“湿热证”模型。内伤七情证候模型，可给予一些应激性的刺激如惊吓、禁食或触怒等建立相应的七情内伤证候模型，赵海滨等[6]采用禁食禁水、夹尾、行为固定和电击足底等方法制造大鼠“肝气郁结”模型。饮食内伤模型，可给予一些特制的饮食如高脂高糖等建立饮食内伤模型，喻松仁等[7]采用高脂饮食喂养SD 大鼠8周，建立中医肥胖“痰湿证”动物模型；王玲等[8]利用基因编辑CRISPR/Cas9 技术成功构建了Parkin 基因敲除小鼠，发现小鼠基因敲除之后表现出与“肾虚证”相符的一些特点，如生长发育迟缓、反应迟钝、自主活动减少、精神倦怠和生育能力下降等，因此认为Parkin 基因敲除小鼠可作为一种理想的“肾虚证”动物模型。此外，中医的“血瘀证”模型、“肝郁气滞证”模型和“湿证”模型等运用非常广泛。其中，“血瘀证”模型已非常成熟，已发展出寒凝血瘀、气滞血瘀、痰浊血瘀等九种证型的造模方法[9]。通过中医证候动物模型的研究，可以深入了解疾病的中医病因病机，并制作出不同证型的实验动物，筛选和验证最合适的中药处方，为中医“辨证论治”提供进一步的参考和科学依据。

1.2 病证结合模型

中医“病证结合”动物模型是指在中医理论指导下，结合实验动物学相关知识和现代医学的发病机制，将疾病和中医证型的构建方式先后或同时施加于动物身上，使动物模型同时具有疾病与证候特征，形成“疾病+证候”的动物模型，即病证结合模型[10]。开展中医病证结合的动物模型研究，对阐释中医病因病机的科学内涵、深入研究中医基础理论有重要的学术价值和应用前景[11]。袁俊俊[12]依据“太阴湿土”理论，采用高糖高脂饮食喂养联合来曲唑混悬液，制备“痰湿型”多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗大鼠模型；赵荣华等[13]采用HCoV-229E 病毒感染小鼠后再置于高湿低温的环境中饲养，制作肺炎寒湿疫毒袭肺小鼠病证结合模型；陈隽等[14]在左冠状动脉前降支起点下方结扎大鼠，配合力竭式游泳和禁食法，建立慢性心力衰竭“气虚血瘀证”模型；孙晓霞等[15]根据“热盛伤阴”的中医理论，采用自发性糖尿病小鼠，给予灌胃“伤阴药”中药黑顺片、肉桂和吴茱萸，建立糖尿病“阴虚证”病证结合小鼠模型；李鑫等[16]根据中医“怒伤肝”理论，在采用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的基础上，加用慢性夹尾激怒大鼠的方式，制作肝纤维化大鼠“肝郁”病证结合模型。

1.3 中医肿瘤证候实验模型

中医肿瘤证候模型，是在肿瘤动物模型的基础上制作的一种“病证结合”动物模型。目前，肿瘤动物模型的构建主要有以下五种：自发性肿瘤模型、诱发性肿瘤模型、肿瘤细胞系移植模型、人源肿瘤组织异种移植模型和基因修饰模型等。中医肿瘤证候动物模型是在中医学整体观念及辨证论治思想指导下，把肿瘤发病原型的某些特征在动物身上的一种复制，也是肿瘤患者中医证候表现的模拟与再现[17]。气虚肝癌模型是在肝癌动物模型的基础上，采用控制饮食法、中药泻下法、疲劳力竭法和复合法同时构建气虚证的造模方法。采用此方法，可以造成气虚证肺癌模型[18]、气虚证乳腺癌模型[19]等多种气虚证肿瘤模型。张栋等[20]分别采用甲腺素合利血平制作小鼠“阴虚”动物模型、采用醋酸氢考制作小鼠“阳虚”模型、采用小鼠球后静脉丛放血制作“血虚”模型后，再接种肝癌H22 细胞株，造成“阴虚”肝癌模型、“阳虚”肝癌模型和“血虚”肝癌模型。彭召云等[21]采用小鼠颈背部皮下注射盐酸肾上腺素，同时用绷带细条束缚小鼠四肢，并加笼外木棒敲击等方式制作“气滞血瘀”模型，然后在皮下接种肺癌Lewis 细胞株制作“气滞血瘀”肺癌小鼠模型。左娇娇等[22]采用目前公认的胃癌前病变造模方法N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）五因素法，以模拟中医病因中长期饮食偏嗜或饮食不洁损伤脾胃功能，并配合禁食等制作胃癌前病变“气虚血瘀证”大鼠模型。

1.4 中医肿瘤证候模型的现状

当前，中医肿瘤证候模型具有一定的不足之处。首先，造模时间长、干扰因素多。在模型制作过程中，肿瘤模型和证候模型往往需要先后进行，先成功制作成证候模型后，再进行肿瘤模型的制作，耗时较长。对证候模型如肝郁气滞模型，需要对实验动物进行禁食禁水、夹尾、行为固定和电击足底等一系列操作[23]，后再进行肿瘤细胞的接种，这对实验动物实施的干扰过多，使动物难以承受。其次，证候模型缺乏客观化标准。虽然近来年对中医证型的客观化做了大量的研究，如基于胰腺癌的客观指标与中医证型相关性研究[24]、原发性肝癌的中医辨证分型与血清肿瘤标志物水平的相关性[25]以及非小细胞肺癌中医证型与肿瘤标志物相关性的研究[26]等。但对于证候模型制作的成功与否，仍然缺乏一套客观化和标准化的指标。最后，受制于当前技术水平，证候模型仍然无法最大化模拟中医病因和发病过程，比如中医外感六淫中的“湿邪”，是高湿度、微生物和机体免疫功能和病理产物共同作用的结果，而现今的“湿证”动物模型主要采用湿度来模拟，无法最大化地复制湿邪的致病过程。

2 类器官在中医肿瘤中的应用

2.1 类器官在中医领域中的运用

类器官，顾名思义类似于组织器官，指的是由干细胞经体外3D 培养产生的“类似”器官样、具有自我更新和组装能力以及结构和功能与来源组织或器官高度相似的微型器官[27-28]。自2009年肠道类器官成功“问世”以来，类器官培养技术取得了长足的进步，且逐步发展为生物医学中最具突破性的领域[29]。中医药以整体观念、辨证论治指导临床实践，具有多途径、多靶点、多通路的作用特点，依赖于传统动物和细胞模型的基础研究具有较大局限性，难以精准评价中医药治疗作用，也缺少直观动态揭示药效作用机制的有效方法，使得药物筛选、中药安全性评价效率较低。类器官以客观化、可视化、精准化为特点，应用干细胞技术，在体外构建类似体内的组织器官模型，不仅有效避免了动物模型物种间差异所造成的实验结果偏差，同时弥补了细胞模型缺少整体性和异质性的不足，在模拟疾病发生发展、药物有效性筛选及新药研发[30]、器官移植和再生医学等多个领域取得了突破[31]。李彦军等[32]采用结直肠癌患者来源的肿瘤类器官，研究癌基因CUL4B 在调控直肠癌患者miRNAs 的作用；陈豪等[33]通过建立结直肠癌患者来源的类器官生物样本库，体内模型结直肠组织的生物学行为，为临床前模型评估结直肠患者的化疗效果，可预判结直肠患者化疗效果，从而指导患者的化疗方案。类器官平台在各类肿瘤药物的筛选中发挥了重要的作用。

中医将每个病人视为不同的个体，每个个体的异质性决定了每个肿瘤患者的症状体征完全不一样，治法治则和遣方用药也不一样，这即是中医“辨证论治”的治疗原则。动物和细胞模型具有非常大的“同质性”，作为中医的科学研究和临床前研究的工具具有一定的局限性。类器官可由具体患者的自身的细胞培养而来，体现出患者的“异质性”，使得中医学研究更加具有说服力，也使中医药的临床前研究更加精确，从而提高中医治疗疗效。在中医的辨证论治临床实践中，由于患者的体质不同，同一种病可能采用不同的方剂，不同的病却采用相同的方剂，即所谓“同病异治，异病同治”，是中医个体化治疗的体现。在临床上，对于辨证存在模棱两可或者治疗后效果不佳的患者，在遵守相应法律法规条件下，可根据辨证后制定的处方，先进行类器官药物敏感性检测，综合判断中医处方的优劣，进一步修正临床治疗方案以提高中医临床治疗肿瘤的疗效[34]。

2.2 类器官在中医肿瘤中的运用

在临床实践用药中，为了更好地消除肿瘤，大部分患者接受联合用药治疗或中西医结合治疗。韩毅[35]认为，体外培养的肿瘤类器官具有很好地模型肿瘤组织的体外生长，最关键的是和患者具有同样的遗传背景和结构，并且在一定程度上保留了来自患者的生物学信息和相同的药物反应。肿瘤类器官药物敏感性检测类似体外培养细胞系的药物敏感性检测，既可以进行单纯的化疗药物筛选，也可以对药物组合如化疗药物联合中医药进行筛选，并从中找到最佳的治疗方案，极大地扩展了药效研究和安全性研究[36-37]。

基于中药抗肿瘤作用通过多组分、多靶标和多途径的特点，对中药的有效成分物质筛选及中药安全性评价研究，现有动物模型和细胞系并不能准确预测中药在人体的不良反应，使得进行中药研究所投入的时间和精力远超于化学药物研究。且二维细胞培养缺乏细胞和胞外基质的相互作用，细胞在缺少一个整体相互作用的情况下，与实际中人体内的药物反应和表达相差甚远，因此研究模式体系的选择也成为中药新药研发中的弊端，而类器官的无疑为标准化药物筛选和安全性评价提供了新的思路[38]。王璐等[39]通过收集结直肠癌患者肿瘤组织样本，并以正常癌旁组织样本为对照，构建了结直肠癌类器官模型和正常组织类器官模型，并通过此模型，评价几种有毒中药单体成分如雷公藤甲素、斑蝥素和蟾毒灵对结直肠癌类器官活性的影响，并在正常组织类器官中测试其毒性，为有毒中药在结直肠癌患者中用药的有效性和安全性提供临床参考；朱方圆等[40]将8 周龄C57 小鼠胃幽门部分离之后，体外培养成胃类器官，72 小时后体外出芽形成胃类器官，并采用南蛇藤提取物对胃类器官进行干预观察其生长和形成情况。此外，类器官芯片等新型的体外研究模型已经用于中药等天然药物的毒性评价[41-42]。

3 肿瘤细胞模型在中医肿瘤学中的研究

肿瘤细胞系是经首次传代成功后的肿瘤细胞，具有连续传代的“永生化”特征。肿瘤细胞系在形态学、遗传学和生物化学上都保持着肿瘤细胞的原有特征，可以用来研究肿瘤的生长分化规律、肿瘤细胞的代谢和肿瘤药物的作用机制。目前，大多数肿瘤都有相应的肿瘤细胞系模型，如小鼠肝癌细胞系、人肝癌细胞系、人肺癌细胞系、小鼠乳腺癌细胞系、人胰腺癌细胞系和人白血病细胞系等。肿瘤细胞模型是研究中医复方、单味药和单体抗肿瘤作用的重要研究手段。中医利用肿瘤细胞模型进行实验研究，一般是采用中药复方或主要有效成分直接或间接作用于细胞模型。直接作用于细胞模型的研究方法主要是采用中药或复方水煎剂、膏剂、中药冻干粉和中药单体等，间接作用是采用中药复方的大鼠含药血清。

3.1 中药复方水煎剂或膏剂作用于肿瘤细胞模型

早期中医肿瘤细胞研究主要采用水煎剂直接作用于肿瘤细胞并沿用至今，如刘金虎等[43]采用中药全蝎、白术、白头翁组合品发酵前后水提液，截留不同分子量段的活性成分，观察其于乳腺癌细胞株MCF-7 细胞的抑制作用；黄松丽等[44]采用牵正散合大补阴丸水煎剂作用于大鼠嗜铬瘤细胞PC12 细胞，观察其增殖和凋亡的影响；张秋艳等[45]采用黄芪注射液合天花粉水煎剂对小鼠恶性黑色素瘤B16细胞增殖、迁移的作用，以及对迁移相关蛋白表达的影响；张天怡等[46]采用槐耳清膏作用于人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231 和MDAMB-453 细胞，观察其对肿瘤增殖和迁移的作用和机制。

3.2 中药复方冻干粉作用于肿瘤细胞模型

中药冻干粉是将中药提取液中的有效成分冻干而形成的粉末制剂，它是一种稳定剂的干燥制剂，能够保持中药的天然活性成分不被破坏，并具有较高的生物利用度和稳定性。李永盛等[47]采用中药槐耳有效部位冻干粉，作用于结肠癌HCT-116 细胞株，观察细胞迁移和侵袭作用；王雪纯等[48]采用中药落地生根冻干粉，作用于人肝癌细胞株HepG2 细胞，观察冻干粉对人肝癌细胞的增殖和凋亡影响；吕鹏等[49]采用龙贝逍遥散冻干粉，观察其于通过调节细胞自噬功能增强对乳腺癌耐药细胞株MDA-MB-231/ADR 细胞的增殖、迁移抑制作用；文秀华等[50]采用补肺汤冻干粉作用于人非小细胞肺癌细胞A549 细胞，观察其对肺癌细胞的抑制作用和相关机制。

3.3 中药含药血清作用于肿瘤细胞模型

中药含药血清是指用于中药制剂给予动物灌胃后，经动物体内的吸收后进入血液循环，并在一定时间内采取血液，分离所得血清，血清内含有一定量的药物有效成分和代谢产物。中药含药血清作用于中医肿瘤细胞模型是目前较为常用的中医肿瘤体外研究方法。罗燕等[51]采用肝喜合剂含药血清作用于人肝癌细胞株HepG2 细胞，观察肝癌细胞的增殖作用；于丹等[52]采用补中益气汤含药血清，观察其对被转化生长因子TGF-β1 介导的DDP 细胞（人非小细胞肺癌细胞顺铂耐药株）间充质转化的作用；魏征等[53]采用化瘀解毒方含药血清，作用于人肺部细胞A549 细胞，观察其对肺癌细胞的凋亡作用和机制。郑莲等[54]采用半夏泻心汤含药血清，作用于幽门螺杆菌感染的人胃黏膜上皮细胞GES-1 细胞，观察其对胃癌细胞的凋亡作用及对凋亡蛋白表达的影响。

3.4 中药单体和有效成分作用于肿瘤细胞模型

中药单体是指中药中的活性成分，为具有特定化学式的化合物。研究中药单体抗肿瘤作用，对于筛选更有效的抗肿瘤药物、提高药物疗效、降低毒副作用和促进中药现代化具有重要的意义。目前，中药单体抗肿瘤的筛选和药效研究，已经成为中医药体外细胞研究的主流。周珊珊等[55]采用决明蒽醌、木犀草素和去氧紫草素三种中药单体，分别作用于人非小细胞肺癌A549 和NCIH460 细胞，观察三种中药单体对于肺癌细胞株的存活率和毒性。杨晶莹等[56]采用灵芝主要成分灵芝菌丝多糖，分别作用于人口腔鳞癌细系HSC-3、人肺癌细胞系A549和人肝癌转移癌细胞系HCCLM细胞，观察其于三种不同类细胞系的体外抗肿瘤活性；陈良等[57]对中药分心木的16 种有效成份进行抗黑色素瘤Hela细胞活性筛选，筛选出胡桃宁B等两种具有抗肿瘤活性的中药单体；龙国清等[58]从中药苦参中筛选出11 个中药单体化合物，观察其对人乳腺鳞状癌HCC1806 细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和肺癌H1299细胞等6种肿瘤细胞系的体外抑制活性，筛选出苦参酮、胡椒酸等多种具有抗肿瘤活性的中药单体；周梦楠等[59]通过从中药玄参分离出23 个中药单体化合物，观察中药单体体外抗肝癌HepG2 细胞、肺癌A549 细胞和结肠癌4T1 细胞的抗肿瘤活性，筛选出反式-咖啡酸甲酯等两种具有抗肿瘤活性的中药单体。

4 当前研究现状的不足与展望

“证候”是中医辨证论治的主要依据，而“证候动物模型”是中医特有的动物模型。当前，诸如“血瘀证”“肝郁气滞证”和“湿证”等证候动物模型在中医研究中已受到广泛的运用。对于中医证候动物模型的验证，陈小野等[60]学者很早就提出，应该从症状、病因和治疗等方面进行。中医的肿瘤证候模型是在证候模型的基础上，进一步制作肿瘤模型，为典型的“病证结合”动物模型。中医肿瘤证候模型，对于肿瘤的证候形成机理、方药验证和安全性评价具有重要的意义。由于证候的复杂性和客观化原因，中医肿瘤的证候动物模型，对于模拟中医肿瘤的发病病因、病机和不同证型的特点，仍然有很大的不足，中医肿瘤证候模型需要在中医证候因素不断标准化的基础上，继续深入研究和改进。

类器官平台是在实验动物和细胞实验的一种延伸，可以模拟人体器官的形态结构和生物学功能，同样可以在中医肿瘤证候研究中发挥重要作用。类器官可用以研究中医证候的特征和机制，从而为中医的“辨证论治”提供科学的依据。此外，类器官还可以用于中药有效组分或方剂的筛选、药效学研究和安全性评价。通过直接从患者肿瘤细胞构建的类器官，可以更加准确地模拟人体内的肿瘤生长和发展，并为中药的选方和辨证论治提供更加客观的依据。然而，类器官平台模拟的仅仅是人体肿瘤或器官在体外的一种形态结构和某些生物学功能，无法代表人体的整体，而肿瘤的中医证候是肿瘤发展到某个阶段病因、病位、病势、邪正关系等一系列病理变化的总称，是在中医“整体观念”指导下的一种概括，两者在本质上存在差异。对于中药改善免疫功能的研究，单独的类器官构建无法模拟机体的免疫反应，必须借助于类器官共培养技术[61]，限制了类器官在中医科研中的运用。类器官及器官芯片模式体系建立和相关平台的出现，为我们从整体评价中医药的科学性提供了可能，也是对动物和细胞实验的一种补充和延伸。