水曲柳FmCCoAOMT基因在木质素合成及非生物胁迫中的功能分析

单超然 陈晓慧 丁云飞 赵 威 卢 晗 高尚珠齐凤慧 詹亚光 曾凡锁*

（1.东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040；2.黑龙江省海林市林业和草原局，牡丹江 157100）

细胞壁是构成植物细胞最重要的结构之一，同时细胞壁还是地球上最丰富的可再生能源库［1］。细胞壁是植物体抵御外部危害的重要屏障，包括各种生物和非生物胁迫。细胞壁可分为初生细胞壁和次生细胞壁，次生细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素组成［2］。木质素是仅次于纤维素的第二大陆生聚合物，在植物抗击外来侵袭、抵御病害袭击、维持正常生长等方面发挥着重要作用［3］。木质素主要由苯丙烷代谢途径产生，作为一种重要的次级代谢产物，其生物合成过程及其复杂，涉及一系列的脱氨基、羟基化和甲基化，最后木质素单体在细胞质中产生。目前，已有研究表明调控木质素生物合成代谢的关键酶和基因已被成功分离和克隆，其中咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）是木质素生物合成途径中的一种关键酶［4］。它可以催化咖啡酰辅酶A（caffeoyl CoA），甲基化为阿魏酰辅酶A（feruloyl-CoA）［5］。咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）首先是在欧芹（Petroselinum crispum）的悬浮细胞中发现的［6］，目前，在绿竹（Bambusa oldhamii）［7］、慈竹（Sinocalamus affinis）［8］、白桦（Betula platyphylla）［9］、拟南芥（Arabidopsis thaliana）［10］、青 杨（Populus cathayana）［11］、烟草（Nicotiana tabacum）［12］等植物中都已经成功获取了CCoAOMT基因。此外，已有研究报道CCoAOMT基因的下调会导致木质素含量降低［13］，而CCoAOMT基因的过表达会使木质素含量增加，这表明咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶在木质素生物合成过程中具有重要作用。

木质素在植物生长发育过程中起着关键作用，它可以增强植物细胞壁的疏水性，促进植物组织、器官的发育，对植物适应环境具有重要意义。此外，木质素的生物合成与各种生物和非生物胁迫密切相关。当植物感染病原菌时，体内的细胞壁会积累大量的木质素用于抵御病原菌的侵害。例如，百合（Lilium browniivar.viridulum）中的LrCCoAOMT基因异源转化拟南芥，使维管组织中的木质素发生沉积，从而增强转基因植株对病原菌的抗性［14］。在玉米（Zea mays）中发现ZmCCoAOMT2基因与多种病原体的耐药性有关［15］，这些结果表明木质素生物合成途径基因在植物防御中发挥着重要作用。重金属胁迫可以增加细胞壁中木质素的含量，从而增加细胞壁的厚度。最新研究表明，铁胁迫可以增加苯丙烷代谢途径中HCT、CCoAOMT、POD 的表达从而增加木质素的含量［16］。此外，木质素的生物合成在干旱胁迫下明显增强。例如，当大豆（Glycine max）受到干旱胁迫时，CCoAOMT基因的表达量在大豆根的伸长区明显增强，木质素的含量也随之增加，从而减少大豆根系水分的流失［17］。最新研究表明，在干旱胁迫条件下，葡萄（Vitis vinifera）中的VvCCoAOMT基因的转录水平增加，有助于葡萄中花青素的甲基化活性［18］。此外，拟南芥CCoAOMT1基因积极响应盐胁迫且表达水平显著上调［19］，同时CCoAOMT1还可以通过ROS 和ABA 信号响应干旱胁迫［20］。以上研究结果充分表明CCoAOMT基因通过改变木质素的生物合成、增加木质素的含量来抵御生物和非生物胁迫，从而适应逆境。

水曲柳（Fraxinus mandshurica）系木犀科（Oleaceae）梣属（Fraxinus）乔木，是东北地区三大珍贵硬阔叶树种之一［21］，属于环孔材，具有高大挺拔、耐低温、高韧性、抗干旱等优良性状，在林业生产上具有重要经济价值。水曲柳在生长过程中经常遭受各种环境危害，如寒冷，干旱，虫害等。这些环境胁迫对于水曲柳木质部的发育以及木质素的生物合成造成了巨大的影响。近年来多种研究表明，CCoAOMT基因通过调节木质素的沉积来响应多种环境胁迫。因此，探究FmCCoAOMT基因在水曲柳木质素生物合成以及响应逆境胁迫中的功能具有重要意义。本研究以水曲柳人工林为材料，利用qRT-PCR 技术检测FmCCoAOMT基因在胁迫处理后的表达水平，揭示生物胁迫和激素诱导后FmCCoAOMT基因的表达模式，通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染方法获得FmCCoAOMT转基因烟草植株，观察转基因烟草及对照在NaCl、甘露醇（Mannitol，Man）和ABA 3 种胁迫后的生长发育表型，分析木质素、纤维素及半纤维素含量差异，同时测定过氧化物酶活性等生理指标，解析FmCCoAOMT基因在木质素合成和植物抗逆反应中的功能。这些结果将为深入研究FmCCoAOMT基因家族的功能和水曲柳抗逆遗传改良奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为东北林业大学实验林场1951年营建的水曲柳人工林。2018年在实验林场内随机选取长势良好且相对一致的雌株水曲柳和雄株水曲柳各3 株作为取样对象。选取距地面5 m 左右枝条上的叶片，每株5 片；同样选取距地面5 m 左右的3～5 年生枝条的木质部、表皮样本。收集表皮，同时刮取未成熟木质部组织进行收集，收集量为5 g。分别在5 月8 日、6 月22 日、7 月22 日、8 月22日和9 月26 日对上述组织部位重复取样，并分别标记雌株和雄株水曲柳。全部样品于冰箱中-80 ℃保存待用。

FmCCoAOMT转基因烟草植株“A-11”为b 株系扩繁得到，其中A为FmCCoAOMT基因的简称。

1.2 研究方法

1.2.1 FmCCoAOMT基因表达模式分析

利用CTAB［22］法提取水曲柳叶、叶柄、表皮和木质部RNA，将检测可用的RNA 反转录成cDNA进行RT-PCR。模板为稀释10 倍的cDNA，以水曲柳微管蛋白Tu 作为参照基因，内参基因引物为F：5′-AGGACGCTGCCAACAACTTT-3′，R：5′-TTGAGGGGAAGGGTAAATAGTG-3′；FmCCoAOMT引 物为F：5′-TTGTGGAACGGGTCTGTG-3′，R：5′-AGCTCCAACACGAAATCTCTG-3′。荧 光 定 量 使 用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix 试剂盒，利用Roche Light Cycler 480 进行扩增，反应程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s（共40个循环）；95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃15 s。每份样品重复3次。

1.2.2 FmCCoAOMT 基因非生物胁迫和激素诱导

将水曲柳15 d组培实生苗［23］分别用低温（4 ℃）、NaCl（200 mmol·L-1）、甘露醇（200 mmol·L-1）、ABA（脱落酸，100 μmol·L-1）、GA3（赤霉素，100 μmol·L-1）和IAA（吲哚乙酸，100 μmol·L-1）处理，分别在处理的1、3、6、12 h 后取样，取样量为5 g，将样品提取RNA反转录成cDNA。用qRT-PCR方法分析FmCCoAOMT基因在胁迫处理后的表达水平，反转录及qRT-PCR方法同上。

1.2.3 农杆菌介导烟草遗传转化

采用叶盘法获取转基因烟草植株［24］。（1）预培养：将无菌烟草用刀具将其叶片切割成叶盘，置于Murashige-Skoog（MS）培 养 基（MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+20 g·L-1蔗糖+5.4 g 琼脂，pH=5.8）上，25 ℃恒温培养3 d；（2）浸染：在无菌条件下将预培养的烟草叶片放置工程菌液中，轻轻振荡，浸染10～15 min；（3）共培养：将浸染后的叶片放到共培养的培养基中 （MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+20g·L-1蔗糖+5.4 g 琼脂，pH=5.8）；（4）脱菌与筛选获得转基因烟草植株。

1.2.4 转基因烟草的鉴定

基因水平检测随机选取在抗性培养基中生根的转基因烟草株系，采用CTAB法分别提取叶片总DNA 作为模板，以FmCCoAOMT基因全长引物进行PCR扩增，FmCCoAOMT基因全长引物为F：5′-ATGAGACCAGTACAAGGAGGA-3′，R：5′-TGACGAGGTAACAAAAGCAA-3′，阴性对照为野生型烟草。

转录水平检测以DNA水平检测为阳性的烟草植株叶片为材料，利用CTAB 法提取总RNA。反转录及qRT-PCR 方法同上，烟草内参引物为F：5′-CATTGGCGCTGAGAGATTCC-3′，R：5′-GCAGCTTCCATTCCGATCA-3′。

1.2.5 转基因烟草木质素、纤维素、半纤维素的测定

分别取野生型和转FmCCoAOMT烟草茎的部位各10 g 作为待测样品。采用分光光度计法测定木质素含量：木质素含量=吸收值×100/吸收系数×样品浓度，吸收系数=20.2 L/（g·cm）-1。采用72%浓硫酸水解法测定纤维素［25］，纤维素含量：X=K（a-b）/（n×24），K为硫代硫酸钠浓度（mol·L-1）；24为1 mol C6H10O5相当于Na2S2O3的当量数；a为空白滴定所消耗Na2S2O3体积，单位为mL；b为溶液所耗硫代硫酸钠体积，单位为mL；n为样品质量，单位为g。采用盐酸水解法结合DNS法测定半纤维素：用DNS 法测定溶液中的还原糖，对照葡萄糖标准曲线计算含量，乘上系数0.9得半纤维素含量。

1.2.6 非生物胁迫处理后转基因烟草酶活性以及生理指标的测定

分别配制含有150 mmol·L-1NaCl、250 mmol·L-1甘露醇、75 mmol·L-1ABA 的MS 培养基，进行非转基因以及转基因烟草的非生物胁迫处理。每隔10 d 拍照观察转基因与非基因植株的表型。硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）浓度；氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性。

1.2.7 胁迫处理后转基因烟草NBT染色

取胁迫处理以及空白对照的叶片（大小尽可能相同），分别置于洁净干燥的50 mL 离心管中，加入NBT 染液浸没叶片，避光放置12 h。倒出染液后加入无水乙醇于80 ℃水浴中脱色30 min（每10 min换1次无水乙醇）。

1.2.8 数据分析

本试验荧光定量数据采用2-△Ct和2-△△Ct的计算方法。利用office365 进行数据整理，所有基因表达数据均为3 次生物重复和3 次技术重复的平均值。使用GraphPad Prism 8.0.2 软件制图并对数据进行单因素方差分析和多重比较，分别分析了不同组织部位和不同月份FmCCoAOMT基因表达量之间的差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 FmCCoAOMT在水曲柳中的表达模式分析

2.1.1 FmCCoAOMT基因的时空表达模式

根据课题组前期对水曲柳木质部干旱转录组的分析表明，FmCCoAOMT基因表达水平上调，基于与拟南芥和杨树（Populus）的进化关系以及序列同源性比对结果，推测FmCCoAOMT基因参与木质素生物合成，因此对其表达模式进行分析。对水曲柳雌株和雄株的木质部（多年生）、木质部（1年生）、枝皮（多年生）、枝皮（新生）、叶柄、小叶6个部位进行FmCCoAOMT基因表达量的检测，结果表明FmCCoAOMT基因在水曲柳不同部位的表达量不同（图1），该基因在多年生雌株和雄株木质部中相对表达量最高。在雄株水曲柳中，FmCCoAOMT在枝皮（新生）中相对表达量最低，FmCCoAOMT表达量在木质部（多年生）是在枝皮（新生）表达量的9.4 倍；在雌株水曲柳中，FmCCoAOMT在叶中相对表达量最低，FmCCoAOMT表达量在木质部（多年生）是在叶片表达量的13.1倍。对5～9 月的雌株和雄株水曲柳实生苗取材，比较不同月份水曲柳木质部和叶片中FmCCoAOMT基因的表达量，结果表明FmCCoAOMT基因在不同月份的表达量差异较显著（图2），其中在7 月雌株水曲柳木质部中表达量达到了峰值，而9 月FmCCoAOMT在雄株水曲柳木质部中表达量降到了最低，几乎不再表达，这与水曲柳本身的生长发育时段密切相关，因此，以上结果表明该基因具有时空表达和组织表达特异性。

图1 FmCCoAOMT基因在水曲柳不同部位的表达量柱形图上用不同小写字母标识表示不同组织部位FmCCoAOMT 基因表达量的差异显著性（P＜0.05）Fig.1 Expression level of FmCCoAOMT gene in different tissues of F. mandshurica Different lowercase letters indicated the significant difference of FmCCoAOMT gene expression in different tissue（sP＜0.05）

图2 不同月份水曲柳木质部、叶中FmCCoAOMT 基因的表达量柱形图上用不同小写字母标识表示不同月份FmCCoAOMT 基因表达量的差异显著性（P＜0.05）Fig.2 Expression level of FmCCoAOMT gene in xylem and leaves of F. mandshurica in different months Different lowercase letters indicated the significant difference of FmCCoAOMT gene expression in different month（sP＜0.05）

2.1.2 FmCCoAOMT 基因在非生物胁迫下的表达模式

以水曲柳15 d幼苗为材料分别进行低温和NaCl 2种非生物胁迫处理，以及IAA，ABA 和GA33种激素诱导，结果显示FmCCoAOMT基因的表达量随处理时间的变化而出现波动的现象（图3）。在低温处理中，以内参基因TU 的表达量作为对照，FmCCoAOMT的表达量先上调，1 h 时，为0 h 的11.04 倍，然后在3 h 时下降，随即在6 h 时基因的表达量达到峰值，为0 h 的23.18 倍，12 h 时降到最低值。NaCl处理后，3 h时出现1个表达量小高峰，是0 h 的14.77 倍，然后逐渐上升，直到12 h 表达量达到最高峰值，为0 h 的17.42 倍。上述结果表明，FmCCoAOMT基因均响应这2 种非生物胁迫，但FmCCoAOMT基因响应低温胁迫比NaCl 胁迫更迅速。

图3 非生物胁迫和植物激素诱导下FmCCoAOMT 基因的相对表达量Fig.3 Relative expression of FmCCoAOMT gene induced by abiotic stress and plant hormones

在IAA、ABA 和GA33 种激素诱导后，FmCCoAOMT基因的表达量均出现了先上升后下降的趋势，以内参基因TU 的表达量作为对照，经IAA激素处理后，FmCCoAOMT基因的表达量在1 h 后就出现了显著的上升，在3 h 时表达量达到峰值，为0 h 的55.07 倍，随即表达量下降，但均高于对照组；经ABA 处理后，在3 h 时达到峰值，为0 h 的40.73 倍，之后表达量下降，在12 h 时低于对照组；经GA3处理后，在3 h时达到峰值，为0 h的42.41倍，之后基因的表达量出现了波动，但均高于对照组，综合比较3 种植物激素对FmCCoAOMT基因表达的影响，IAA 处理时水曲柳中FmCCoAOMT基因表达（12 h 的平均值）高于ABA 和GA3。同时结果也表明FmCCoAOMT基因可以被激素信号快速诱导表达，从而抵抗非生物胁迫。

2.2 FmCCoAOMT转基因烟草的遗传转化和鉴定

利用农杆菌法侵染大地烟草叶片，利用分化培养基将烟草叶片分化出芽，最终筛选获得FmCCoAOMT转基因烟草植株，转基因过程如图4 所示，图4A 为预培养阶段，图4B 为侵染脱菌后在脱菌培养基中培养，图4C 为叶片为愈伤组织诱导出丛生芽，图4D 为出芽后的烟草丛生苗的不同时期，图4E为生根培养基中烟草成苗。

图4 转基因烟草再生过程A.预培养阶段；B.烟草叶片侵染脱菌后在脱菌培养基中培养；C.叶片为愈伤组织诱导出丛生芽；D.出芽后的烟草丛生苗的不同时期；E.生根培养基中烟草成苗Fig.4 Regeneration process of transgenic tobacco A.Pre-culture stage；B.Leaves infected with and cultured in the culture medium；C.The leaves clustered buds induced by callus；D.The different stages of tobacco clusters after budding；E.Tobacco seedling in rooting medium

通过CTAB法提取转基因烟草DNA，从DNA水平验证转基因烟草植株，结果显示，泳道1和2无条带出现，泳道3出现目的条带，（其中泳道1 为阴性对照，泳道2 模板为野生型烟草，泳道3 模板为转基因烟草），表明转基因成功；同时从RNA 水平验证转基因烟草植株，以非转基因烟草CK 作为对照，横坐标为不同的株系，纵坐标为相对表达量，结果表明FmCCoAOMT基因在非转基因烟草中几乎不表达，而在转基因烟草中大量表达，进一步说明烟草再生植株为转基因植株（图5）。

图5 转基因烟草FmCCoAOMT 基因的PCR 和RT-PCR鉴定泳道1.阴性对照；泳道2.野生型烟草；泳道3.转基因烟草Fig.5 Identification of transformed tobacco FmCCo-AOMT gene by PCR and RT-PCR Lane 1.Negative control；Lane 2.Wild-type tobacco；Lane 3.Overexpressed tobacco

2.3 FmCCoAOMT基因功能分析

2.3.1 FmCCoAOMT 基因对木质素、纤维素和半纤维素合成的影响

木质素、纤维素和半纤维素是植物细胞壁的重要组成部分。以野生型烟草为对照，FmCCoAOMT转基因烟草中木质素、纤维素和半纤维素的测定结果表明（图6），转基因烟草的木质素含量高于野生型烟草，比野生型烟草的含量高出41%，而转基因烟草的纤维素和半纤维素含量比野生型烟草低，纤维素含量比野生型烟草低了32%，半纤维素含量比野生型烟草低了52%，因此可以推测FmCCoAOMT基因与木质素的合成相关。

图6 转基因烟草木质素、纤维素和半纤维素含量测定***.P＜0.001，差异极显著；*.0.01＜P＜0.05，差异显著Fig.6 Determination of lignin，cellulose and hemicellulose in transgenic tobacco***.P＜0.001，extremely significant difference；*.0.01＜P＜0.05，significant difference

2.3.2 FmCCoAOMT 基因在非生物胁迫中的功能分析

对长势一致的野生型烟草和转基因烟草幼苗进行NaCl、甘露醇、ABA 3 种处理，分别对10、20、30 d 的表型进行拍照记录，根据照片结果显示（图7），在150 mmol·L-1NaCl 培养基中，转基因烟草A-11和野生型烟草均长出根系并且状态良好，并且转基因株系明显要高于野生型。在250 mmol·L-1甘露醇培养基中，转基因烟草A-11 在10 d 时长出了根系，而野生型烟草在20 d 时才长出根系，但是它们的生长状态与对照组相比均受到了抑制，并且出现了枯黄萎蔫的现象。在75 mmol·L-1ABA 培养基中，转基因A-11 与野生型烟草均未生根。同时可以看出在3 种胁迫处理下转基因植株A-11 相比野生型植株均有不同程度的生长恢复现象，因此可以推测FmCCoAOMT参与了烟草植株抵抗非生物胁迫和激素信号的诱导。

图7 转基因烟草胁迫处理Fig.7 Transgenic tobacco under stress treatments

过氧化物酶（POD）参与植物的生长发育过程，并且与植物木质素合成相关，根据转基因烟草POD 活性测定结果可知（图8），在转基因烟草受到NaCl、ABA 和Man 3 种胁迫处理后，POD 活性与对照组相比显著增加，其中在NaCl处理后，POD活性增加得最为明显，比对照组活性高83%，表明转基因烟草木质化程度较高，进一步推测FmCCoAOMT基因参与木质素的合成。超氧化物歧化酶（SOD）是一种存在于植物体内可以抑制细胞膜中不饱和脂肪酸过氧化作用的酶，当植物在逆境条件下，SOD 活性迅速增强，从而起到保护细胞膜的作用，根据转基因烟草SOD 活性测定结果可知（图8），在NaCl、ABA 和Man 3 种胁迫处理后，转基因烟草的SOD 活性高于野生型烟草，分别比对照组的活性升高56.6%、44.2%和19.0%，转基因烟草SOD 活性的显著升高表明比野生型烟草受到的毒害作用更小。丙二醛（MDA）是脂质过氧化的终产物，其浓度的高低可以体现植物在胁迫条件下细胞氧化受损伤的程度，根据转基因烟草MDA的含量结果可知（图8），未经胁迫处理以及胁迫处理后的转基因烟草MDA 浓度均小于野生型，其中在NaCl 处理后表现极为明显，MDA 浓度显著下降，下降了77.2%，因此可以推测转基因烟草受到的过氧化损伤程度要小于野生型。综上所述，FmCCoAOMT基因在植物抗逆过程中发挥着正向调控作用。

图8 转基因烟草POD活性、SOD活性和MDA浓度Fig.8 POD activity，SOD activity and MDA concentration of transgenic tobacco

2.3.3 FmCCoAOMT 基因对植物活性氧含量合成的影响

植物细胞在生命活动过程中不断地进行氧化还原反应，研究结果显示活性氧在植物对环境胁迫信号感受、传递和适应过程有重要作用，因此测定植物活性氧含量在植物抗逆研究中有着非常重要的作用。本研究采用氮蓝四唑（NBT）染色的方法来测定植物体的活性氧，染色结果显示（图9），与对照组相比，未经胁迫处理以及胁迫处理后的转基因烟草A-11 叶片蓝色沉淀面积均小于野生型，从而得知转基因烟草植株体内活性氧含量较少，表明FmCCoAOMT基因的过表达导致胁迫下的损伤减少，因此推测FmCCoAOMT基因参与植物抗逆反应。

图9 转基因烟草NBT染色Fig.9 NBT staining of transgenic tobacco

3 讨论

木质素是所有维管植物细胞内细胞壁所必需的组分，它广泛参与植物生长发育过程，提高植物体的机械强度并增强了其抗逆性。木质素由S-木质素、G-木质素和H-木质素3 类单体聚合成酚类多聚体［26］，其中CCoAOMT基因对G 型木质素合成有特异调节作用［27］。本研究分析了水曲柳FmCCoAOMT基因的组织表达模式，结果表明FmCCoAOMT基因具有组织特异性，其中在木质部中表达量较高，因此推测该基因参与了水曲柳中木质素的生物合成。此外，我们又分析了水曲柳FmCCoAOMT基因的时空表达模式，结果显示在7 月木质部中FmCCoAOMT基因的表达量达到峰值，而到9 月时，FmCCoAOMT基因的表达量降到最低值。据研究表明，CCoAOMT的下调会导致木质素含量降低［28］，而CCoAOMT的过表达导致木质素含量增加［29］。例如，甜菜（Beta vulgaris）CCoAOMT转基因烟草植株与野生型相比木质素含量明显增加［30］。本试验通过测定转基因烟草纤维素、半纤维素和木质素含量发现转基因植株木质素含量明显高于对照组，而纤维素和半纤维素含量有所降低，这与先前研究报道［30］一致，表明FmCCoAOMT基因在木质素生物合成中发挥重要作用，也说明转基因植株中木质素和纤维素的合成可能存在着互相补偿关系［31］。

CCoAOMT基因是木质素生物合成过程中的一个关键酶，其表达水平受到多种环境胁迫的调控［32］。对拟南芥的研究表明，AtCCoAOMT1的转录水平在盐胁迫时显著上调，在甜菜的研究中也有相同的结论，当甜菜受到盐胁迫后，CCoAOMT的表达水平明显增加［33］。此外，对洋麻（Hibiscus cannabinus）CCoAOMT基因的研究表明，其表达水平均响应寒冷、ABA 处理［34］。Liu 等［35］发现，对柳枝稷（Panicum virgatum）进行干旱、寒冷和机械损伤处理后，CCoAOMT在叶片和茎中的表达水平上调。综上所述，不同植物的CCoAOMT基因可以响应多种非生物胁迫。本文研究了FmCCoAOMT基因在非生物胁迫和植物激素诱导下的表达模式，结果表明FmCCoAOMT基因的表达水平随着处理时间的增加出现明显波动，这与上述结果研究一致，证明FmCCoAOMT基因响应非生物胁迫和激素诱导，从而参与植物抗逆适应过程。植物木质部中木质素含量的增加可提高植物抵御环境胁迫的能力。例如，通过观察外源施加NaCl、Man 和ABA 处理的野生型和转基因烟草的表型发现，转基因烟草比野生型有更高的耐盐和抗旱性，并且随着处理时间的增加，转基因植株的生根速率要高于野生型，生长状态更具有优势。胁迫处理后，对野生型和转基因植株POD、SOD 酶活性分析表明，转基因株系POD、SOD 酶活性均高于野生型，这降低了超氧阴离子对细胞的氧化损伤，同时POD 参与细胞壁木质素单体聚合反应［36］，增加了次生细胞壁木质素的沉积，进而提高了转基因株系抵御非生物胁迫的能力。另一方面，通过测定过表达植株中MDA 含量，结果与象草（Pennisetum purpureum）的研究结果［37］一致，MDA 含量降低，并且过表达植株木质素含量增加，使细胞壁硬化，避免细胞脱水，进而降低对细胞的损伤。这些结果表明，FmCCoAOMT基因的过表达增加了转基因株系中木质素的沉积，对于盐胁迫，干旱胁迫和激素诱导有保护作用。

综上，FmCCoAOMT基因参与水曲柳的木质素生物合成，通过转基因烟草的表型特征以及生理指标的测定，证明FmCCoAOMT基因的过表达可以增强植物体内木质素的含量，从而提高抵御非生物胁迫的能力。FmCCoAOMT基因抗逆功能的探究为水曲柳的遗传改良奠定了基础。