高耐受性氧化葡糖杆菌的筛选及鉴定

张珂,赵群,李静,殷志航,谭海刚*

(1.青岛农业大学 食品科学与工程学院,山东 青岛 266000;2.潍坊职业学院食品药品学院,山东 潍坊 261000)

醋作为我国主要的酸性调味品之一,酿造历史悠久,食用人群广泛[1]。醋酸菌是醋酸发酵阶段的主要菌种,可将乙醇转化为乙酸,并在该过程中产生独特风味,影响成醋的品质[2]。目前,国内在工业上广泛应用的醋酸菌种是中科AS1.41和沪酿1.01,但在生产过程中,普遍遇到了产酸能力不足、菌种衰退、发酵成醋口感不够柔和、风味较单一等问题[3]。因此,筛选发酵性能好且具有良好耐受性的醋酸菌菌株是解决行业痛点的重要手段之一。Chen等[4]从醋醅中筛选得到一株对高温、高醇耐受性好的醋酸菌AAB4,其在10%乙醇、37 ℃条件下,产乙酸达到42.0 g/L。刘静等[5]从自然发酵的咖啡果醋中筛选出一株产酸能力较强的醋杆菌A9,其产酸能力达到3.62 g/dL。

本研究旨在从天然腐烂的无花果中筛选出一株产酸能力强、高温耐受性、乙醇耐受性等性能较好的醋酸菌菌株,以期能够为解决食醋工业生产中遇到的难题提供技术和理论参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

腐烂无花果:山东威海的布兰瑞克熟果。

1.2 实验试剂

葡萄糖、无水乙醇:莱阳市康德化工有限公司;碳酸钙、酵母浸粉、琼脂粉、DNA Marker:北京索莱宝生物科技有限公司;TAE缓冲液、溴化乙锭:生工生物工程(上海)股份有限公司;细菌DNA 基因组提取试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 实验仪器

立式压力蒸汽灭菌锅 济南德强仪器有限公司;全温振荡培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司;电热鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;小型PCR 伯乐生命医学产品(上海)有限公司;凝胶成像系统 上海佳鹏科技发展有限公司;高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.4 培养基

普通固体培养基:1%酵母浸粉、2%葡萄糖、1.5%碳酸钙、2%琼脂,灭菌后加入2%无水乙醇。

乙醇胁迫固体培养基:以普通固体培养基为基础,按需要加入无水乙醇。

液体基础培养基:1%酵母浸粉、2%葡萄糖,pH 6.0,使用250 mL三角瓶分装40 mL,121 ℃、15 min灭菌。

液体种子培养基:液体基础培养基加入3%无水乙醇。

液体发酵培养基:液体基础培养基加入5%无水乙醇。

乙醇胁迫发酵培养基:液体基础培养基按需要加入无水乙醇。

乙酸胁迫液体培养基:液体种子培养基按需要加入乙酸。

1.5 实验方法

1.5.1 醋酸菌分离与筛选

1.5.1.1 菌种分离

取腐烂无花果变酸部分1 g置于液体种子培养基,于30 ℃、180 r/min富集培养2 d,然后稀释、涂布于普通固体培养基,30 ℃培养3 d,选取产生透明圈的菌株分别编号。

1.5.1.2 平板初筛

将分离的菌株分别点接到6%乙醇胁迫固体培养基(30 ℃)和普通固体培养基(37 ℃)培养3 d,选择在两种培养基上菌落的透明圈圈径比均较大的菌株,利用FeCl3对选取的菌株进行乙酸定性分析[6]。

1.5.1.3 平板复筛

经平板初筛的菌株接入液体种子培养基,于30 ℃、180 r/min培养20 h,得种子液。取3 μL平板初筛的菌株种子液,点接到普通固体培养基30 ℃培养3 d,计算菌落透明圈圈径比。

1.5.1.4 发酵筛选

取 5 mL平板复筛的菌株种子液接于液体发酵培养基,于30 ℃、180 r/min发酵4 d,测定发酵液中总酸含量,确定目标菌株。产酸量测定方法参考GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》[7]。

1.5.1.5 产乙酸能力分析

取5 mL目标菌株的种子液接于液体发酵培养基,于30 ℃、180 r/min发酵5 d,测定发酵液中乙酸含量。为确定所筛选目标菌株W-1产乙酸的能力,采用高效液相色谱法测定其在5%乙醇(30 ℃)条件下发酵5 d的发酵液中乙酸的含量,使用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);于紫外波长210 nm处检测;柱温25 ℃;流动相为0.05 mol/L的KH2PO4-H3PO4缓冲液(pH 2.8);流速0.7 mL/min;进样量10 μL。乙酸标准曲线见图1。该曲线拟合公式为y=2 396.37+4 879.77x,R2为0.999 8。

图1 HPLC法测定乙酸标准曲线Fig.1 Standard curve of acetic acid determined by HPLC method

1.5.2 醋酸菌鉴定

1.5.2.1 生理生化鉴定

参照《伯杰氏系统细菌学手册》[8]对菌株W-1进行生理生化鉴定。

1.5.2.2 16S rRNA鉴定

使用细菌DNA基因组提取试剂盒提取菌株W-1的DNA,使用细菌通用引物进行PCR扩增(上游引物27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';下游引物1492R:5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。用1%(质量与体积比)琼脂糖凝胶电泳分离扩增DNA,溴化乙锭染色后检测。

委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rRNA测序,通过BLAST程序提交测序结果,在NCBI数据库中进行同源序列检索,并利用MEGA 6.06构建系统发育树。

1.5.3 菌株W-1生理特性

1.5.3.1 菌株W-1对温度的耐受能力

取3 μL菌株W-1的种子液点接到普通固体培养基,分别于30,35,37,39,41 ℃培养3 d,观察醋酸菌生长及产酸情况。

1.5.3.2 菌株W-1对乙醇的耐受能力

取3 μL菌株W-1的种子液分别点接到含有2%、6%、8%、10%、12%乙醇的乙醇胁迫固体培养基,于30 ℃培养3 d,观察醋酸菌生长及产酸情况。

1.5.3.3 菌株W-1生长曲线测定

取5 mL菌株W-1的种子液接于液体种子培养基,于30 ℃、180 r/min 培养,每隔2 h测定细胞浓度(波长540 nm处的吸光值,用OD540 nm表示),绘制菌株W-1生长曲线。

1.5.3.4 菌株W-1发酵曲线测定

取5 mL菌株W-1的种子液接于液体发酵培养基,于30 ℃、180 r/min发酵培养,每隔1 d测定细胞浓度和总酸含量,并计算产酸率,绘制菌株W-1发酵曲线。

1.5.3.5 菌株W-1遗传稳定性

菌株W-1于试管斜面传代10次,分别进行液体种子培养,各取5 mL种子液接于液体发酵培养基,于30 ℃、180 r/min发酵4 d,测定发酵液中细胞浓度和总酸含量。

2 结果和分析

2.1 醋酸菌分离与筛选

2.1.1 平板初筛

从腐烂无花果中分离出153株产生透明圈的菌株,分别以37 ℃(2%乙醇)和6%乙醇(30 ℃)作为胁迫条件进行平板初筛,挑选出在两种条件下透明圈圈径比均较大的8株菌株,分别为Z-3、Z-8、Z-11、Y-3、X-1、X-7、W-1、W-9。对这8株菌株发酵液进行乙酸定性分析,结果见图2。

图2 乙酸定性分析Fig.2 Qualitative analysis of acetic acid

由图2可知,菌株的发酵液可以与FeCl3反应产生红褐色沉淀,所以判断发酵产物中存在乙酸。

2.1.2 平板复筛

由图3和表1可知,菌落透明圈圈径比较大的菌株分别是W-1、Z-8、Y-3和W-9,其中菌株W-1的圈径比最大,为(3.16±0.08)。

表1 普通固体培养基平板复筛菌落透明圈圈径比Table 1 Ratios of diameters of transparent circles of plate rescreened colonies on the common solid medium

图3 普通固体培养基平板复筛菌落Fig.3 Rescreened colonies on the common solid medium

2.1.3 发酵筛选

由图4可知,菌株W-1总酸含量最高,为(4.22±0.06) g/dL,比Z-8、Y-3和W-9分别提高了2.9%、17.35%、170.51%,最终确定菌株W-1为目标菌株。

图4 菌株发酵筛选Fig.4 Screening and fermentation of strains

图5 菌株W-1发酵液高效液相色谱图Fig.5 High performance liquid chromatogram of strain W-1 fermentation broth

2.1.4 产乙酸能力分析

通过图1乙酸标准曲线计算乙酸含量为(4.01±0.16) g/dL。

2.2 醋酸菌鉴定

2.2.1 生理生化鉴定

由图6和表2可知,菌株W-1为革兰氏阴性菌株,菌体呈短杆状,大小为(0.63～0.76) μm×(1.19～1.51) μm,可以氧化乙醇产生乙酸,不能氧化乙酸和乳酸,其他试验结果也均符合葡糖杆菌属的生理生化特征。

表2 菌株W-1生理生化鉴定结果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain W-1

图6 菌株W-1革兰氏染色结果(G-)Fig.6 Gram staining results of strain W-1 (G-)

2.2.2 16S rRNA鉴定

对菌株W-1进行16S rRNA鉴定,其PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图7。

图7 琼脂糖凝胶电泳Fig.7 Agarose gel electrophoresis

由图7可知,在1 500 bp左右有一条清晰的条带,测得菌株W-1的16S rRNA基因序列,其含有1 394 bp碱基。通过BLAST程序提交序列,进行同源序列检索,并通过MEGA 6.06软件构建系统发育树,结果见图8。

图8 菌株W-1系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of strain W-1

菌株W-1与氧化葡糖杆菌GluconobacteroxydansDSM 3503(NR 026118.1)为同一种属,基因序列同源性为99.64%,确定菌株W-1为氧化葡糖杆菌(CGMCC No.18500)。

2.3 菌株W-1生理特性

2.3.1 菌株W-1的高温耐受能力

温度过高导致菌体产酶能力下降,因此生长及产酸受到抑制[9]。将菌株W-1接种到普通固体培养基(2%乙醇),分别在不同温度下培养,其生长及产酸结果见图9。

图9 菌株W-1的温度耐受性Fig.9 Temperature tolerance of strain W-1

由图9可知,菌株W-1在30～39 ℃范围内生长没有明显差异,均能较快生长且没有明显的延滞期,这与Perumpuli等在斯里兰卡椰子醋中筛选的醋酸菌Gluconobacter菌株SL13E-2和SL13E-3的耐高温特性相近,但这两株菌株延滞期长达2 d和3 d且乙酸产量较低,只有3.15 g/dL和3.02 g/dL[9]。

2.3.2 菌株W-1的乙醇耐受能力

将菌株W-1分别接种到含有不同乙醇浓度的固体培养基,30 ℃条件下培养,其生长及产酸结果见图10。

图10 菌株W-1的乙醇耐受性Fig.10 Ethanol tolerance of strain W-1

由图10可知,菌株W-1在10%乙醇中可以生长并产酸,说明其乙醇耐受能力较热带醋杆菌JM2和巴氏醋杆菌B103强。同时可以看出,菌株W-1的生长和产酸能力随着乙醇浓度的升高而逐渐变弱。在含2%～8%乙醇的固体培养基,菌株W-1生长1 d便形成了明显的菌落,而在10%乙醇的培养基上2 d才形成菌落,说明乙醇对菌株W-1的生长及产酸产生抑制作用[10]。

2.3.3 菌株W-1生长曲线

由图11可知,菌株W-1的延滞期为0～2 h,对数期为2～28 h,稳定期为28～36 h,处于对数期的细菌对外界因素敏感、形态典型、活性好,因此选择菌株W-1的种子培养时间为20 h。

图11 菌株W-1生长曲线Fig.11 Growth curve of strain W-1

2.3.4 菌株W-1发酵曲线

菌株W-1生长和产酸受到高浓度乙醇的抑制,因此菌株W-1在 3%乙醇(30 ℃)种子培养后,再将其种子液接于发酵培养基(5%乙醇、30 ℃)进行发酵,发酵曲线见图12。

图12 菌株W-1发酵曲线Fig.12 Fermentation curves of strain W-1

由图12可知,菌株W-1发酵过程中,细胞浓度和总酸含量呈现逐渐增长的趋势,而产酸率则先上升后下降。4 d时产酸率为(11.94±0.69) g/d,此时总酸含量达到(4.26±0.06) g/dL;4 d之后产酸率迅速降低,总酸含量增长缓慢,发酵6 d后总酸含量达到(4.70±0.02) g/dL。其总酸含量均高于已筛选的氧化葡糖杆菌E3[11]和葡糖杆菌Gra904[12],二者的总酸产量分别为3.35 g/dL和3.57 g/dL。

2.3.5 菌株W-1传代稳定性

将菌株W-1传代10次后分别在5%乙醇条件下发酵4 d,其生长和发酵情况见表3。

表3 菌株W-1传代稳定性Table 3 Passage stability of strain W-1

由表3可知,菌株 W-1传代10次后在波长540 nm处的吸光值维持在1.178～1.213之间,发酵液总酸含量维持在4.15～4.32 g/dL之间,生长和产酸情况均无明显变化,说明菌株W-1稳定性较好。

3 结论

本研究以腐烂无花果为来源,采用平板分离法经过初筛、复筛及发酵筛选,最终筛选出一株高温耐受性好、乙醇耐受能力强的醋酸菌菌株W-1,并经过生理生化鉴定、16S rRNA测序分析,确定该菌株为氧化葡糖杆菌。研究菌株W-1的生理特性发现,菌株W-1可以耐受39 ℃高温或10%乙醇;在含5%乙醇的发酵培养基中,菌株W-1发酵4 d和6 d,总酸含量分别达到(4.26±0.06) g/dL和(4.70±0.02) g/dL,产酸能力较强;传代稳定性实验表明,菌株W-1的生长和产酸稳定性较好。